大豆RN型细胞质雄性不育系及保持系cDNA-AFLP分析

本研究利用cDNA-AFLP技术对大豆RN型细胞质雄性不育系及其同核异质保持系进行多态性分析。提取不育系和保持系的总RNA,反转录成cDNA。以cDNA为模板,通过PCR对64对AFLP引物进行扩增筛选,对不育系或保持系中特有的差异带进行回收测序,通过NCBI-Blast同源比对分析得到12条同源序列,其中8条序列为已知功能的基因,4条为未知功能基因。其中与线粒体基因同源的序列A4,编码ATP合成酶γ亚基蛋白基因同源的序列A1,编码减数分裂不联会突变蛋白同源的序列B1可能与不育有关。这些片段的发现为不育机制的深入研究提供帮助,同时可作为不育系及保持系快速鉴定的依据,对缩短育种年限,加快育种进程具有重要意义。     

甜菜细胞质雄性不育相关基因的克隆表达及CMS的相关性研究

已有的研究表明,线粒体atpA基因和orf187片段与作物雄性不育关系密切。为了研究atpA基因和orf187片段与甜菜细胞质雄性不育之间的关系,采用同源序列法分离克隆了甜菜体内atpA和orf187序列;序列分析揭示这2个片段序列在不育系和相应保持系间存在差异,进一步利用半定量RT-PCR和Real-time PCR技术分析了两系的atpA基因和orf187片段的表达情况。结果表明,与保持系相比,atpA在不育系中发生了碱基的置换及插入;orf187在不育系中缺失6个碱基,而在保持系中多了6 bp的重复序列;基因表达分析也显示,不育系atpA在花蕾发育的前2个时期表达量明显低于相应的保持系,而在大花蕾期其表达量又高于相应的保持系;orf187在不育系小花蕾时期表达量明显高于相应的保持系,随着花蕾的发育,该序列在不育系中的表达逐渐减弱并明显低于对应保持系中的表达量。推测atpA和orf187的结构变异及异常表达与甜菜细胞质雄性不育有着密切关系。     

甘蓝型油菜NCa细胞质雄性不育系统花药败育前期的基因差异表达

采用cDNA-AFLP技术研究了甘蓝型油菜NCa不育系、保持系和可育F1花药败育前期的基因差异表达谱。用224对引物对不育系、保持系及育性恢复F₁等3个材料的cDNA进行AFLP分析。回收、克隆可能与花药育性有关的差异条带,筛除假阳性,获得41条阳性差异条带（TDFs）;经测序、同源比对、功能预测,归并为35个非重复的TDFs。大多数TDFs在甘蓝型油菜中属首次报道。将已知功能的28个TDFs按其推测功能分为2大类10小类,82%的TDFs与细胞形态建成和降解、蛋白质合成、加工和转运、能量代谢、信号传导有关;基本涵盖花药发育相关的关键代谢过程。对其中7个TDFs基因进行了RT-PCR分析。结果表明,果胶甲酯酶基因和氨基酸通透酶基因都在不育系花蕾中大量表达,果胶甲酯酶基因在不育系叶片、保持系的花蕾、叶片中都没有检测到;而氨基酸通透酶基因有微量表达。驱动蛋白和乙醛脱氢酶主要在保持系花蕾中大量表达,而在不育系花蕾、叶片以及保持系叶片中都只有微量表达。玉米黄素环氧化酶（ZEP）和单脱氧抗坏血酸还原酶则在保持系花蕾、叶片和不育系叶片中大量表达,而在不育系花蕾中微量表达。花粉油体蛋白在不育系和保持系的花蕾中都有表达,不过保持系花蕾中的表达量约2倍于不育系花蕾;但是在两者的叶片组织中都没有检测到。本试验获得的差异表达基因对于了解油菜花药育性形成的调控机制提供了重要的分子信息。     

甜菜雄性不育系及其保持系花蕾期差异蛋白分析

甜菜是重要的糖料作物之一,利用雄性不育系配制杂交种是甜菜育种的主要途径。为探索甜菜雄性不育形成机理,本研究以甜菜不育系(N9849)和保持系(960766)的现蕾期花蕾为试材,采用双向电泳、质谱鉴定、生物信息学分析方法,进行差异蛋白质组学研究。结果表明:不育系和保持系间差异表达蛋白21个,涉及8个功能类别,其中胁迫响应、碳水化合物代谢、花粉发育等功能类别所占比例较大。谷胱甘肽-S-转移酶、过氧化氢酶等在不育系中显著低表达,活性氧的清除能力弱,酶保护系统遭到破坏,代谢紊乱,可能导致了花粉败育;蔗糖合酶在不育系中表达量较低,碳水化合物代谢强度低,能量代谢匮乏促进了花粉不育的发生;Ⅲ型聚酮合酶A在保持系中显著高表达,可能是保持系维持育性的重要原因。本研究为解析甜菜雄性不育机理提供科学依据。     

大豆细胞质雄性不育系MADS-box基因的分离分析

采用cDNA-AFLP差异显示技术对大豆细胞质雄性不育系NJCMS2A与其保持系NJCMS2B间基因差异表达进行研究,结果从NJCMS2A花蕾中分离到一个差异表达片段,对该差异片段进行克隆、测序和序列比对分析,Blast检索结果显示它与大豆基因组中Gm13上g29510.1 cDNA片段的同源性达98.7%,与大豆中一个MADS-box基因的同源性达98%,氨基酸序列比对结果表明它与大豆中一个MADS-box蛋白有96%的同源性,与豌豆中MADS-box M7蛋白有83%的同源性,与苦瓜中MADS-box2蛋白有88%的同源性,与海岛棉典型的MADS-box基因编码的AGAMOUS蛋白保守区有83%的同源性,进一步对其氨基酸序列进行结构和功能预测显示该差异片段具有MADS-box转录因子的典型结构域K-box,证明其编码蛋白为一MADS-box转录因子,半定量RT-PCR分析结果显示其在NJCMS2A花蕾中表达量很高,而在NJCMS2B花蕾中表达量很低,推测该差异片段可能与大豆细胞质雄性不育有关。     

红麻HcMS1基因的克隆、表达与功能分析

为挖掘红麻雄性不育核基因,解释红麻花蕾败育的分子机理,通过分析转录组数据,利用同源克隆的方法从红麻花药中克隆出拟南芥MALE STERILITY1(MS1)的同源不育基因,并命名为HcMS1基因。利用生物信息学方法对HcMS1蛋白进行结构、理化性质及亲缘关系等分析,并通过qRT-PCR分析HcMS1基因在红麻不育系、保持系不同时期的表达水平;构建过表达载体,利用叶盘法转化本氏烟草并对转基因烟草进行表型观察。HcMS1基因序列开放阅读框(ORF)为1 950 bp,编码649个氨基酸。生物信息学分析显示,HcMS1蛋白为亲水蛋白,定位在细胞核上且含有典型PHD-finger结构域,没有信号肽和跨膜区结构,与陆地棉MS1蛋白亲缘关系最近,其次为木槿MS1蛋白。qRT-PCR结果表明,HcMS1基因的表达量在保持系和不育系中均呈现先上升、后下降的趋势,且在红麻花蕾的四分体至单核期表达量最高,这与拟南芥中MS1基因表达模式一致;另外在保持系中基因的表达水平显著高于不育系,推测红麻败育与HcMS1基因的低量表达相关。通过遗传转化试验发现,HcMS1转基因烟草株型较矮,花萼大小不一,花筒长度缩短,并出现自交不结实的现象,说明红麻HcMS1基因的异源表达有影响本氏烟草正常育性的功能。从红麻花药中成功克隆出核不育相关基因HcMS1,并对其进行功能分析,为后续红麻雄性不育育种工作提供了一定的理论依据与基础。     

转抗虫基因三系优良保持系的获得

以质粒pBUSCK-HPT作抗虫基因供体,优良籼型保持系D62B为受体,采用基因枪转化法,获得了转抗虫基因sck的植株。将转基因保持系与不育系D62A回交,获得转抗虫基因不育系。分子证据表明,外源基因能稳定转移到不育系中。蛋白活性测定显示,转基因在不育系中得到表达。本文还讨论了转基因技术在水稻育种中的作用。     

甘蓝型油菜NCa CMS育性相关候选线粒体基因及其恢复基因的转录调控

用10个线粒体基因为探针，对NCa不育系、保持系和可育F1幼蕾的线粒体RNA进行了Northern检测。结果表明，atp6、atp1、cox1、cox2、cob、rrn5S和rnn26S等7个线粒体基因探针在不育系、保持系、可育F1中的转录没有差异，只有orf222、orf139和atp9等3个探针检测到转录本的差异。orf222和orf139分别在不育系和可育F1中产生相同大小和丰度的转录本，但是在保持系中没有检测到转录本；orf222检测到的3条转录本分别为1．1、0．9和0．6kb，orf139检测到0．8和0．6kb2条带。atp9探针在不育系和保持系中都检测到1条0．6kb转录本，而在可育F1中检测到0．6和1．2kb的转录本。NCaCMS不育的形成可能与orf222、orf39和atp9基因的表达有关。讨论了恢复基因在F1育性恢复过程中对育性相关候选基因的可能调控方式。     

瓣化型胡萝卜雄性不育基因atp6的CAPS标记建立

根据atp6的基因序列设计特异扩增引物，以瓣化型胡萝卜核质互作雄性不育系H05A及其保持系H05B为试材，扩增获得了1条约500bp的特异扩增片段。用限制性内切酶BglII对该片段进行酶切，不育系产生1条保持系中没有的特异片段，其分子量约为60bp。建立了atp6基因的CAPS标记，该分子标记可用于胡萝卜雄性不育分子标记辅助育种。     

四种细胞质来源的烟草不育系线粒体SSR位点差异

采用线粒体SSR(mtSSR)方法对普通烟草4种不育类型的不育系、不育胞质来源的烟草野生种和保持系进行线粒体位点差异分析,探讨mtSSR位点差异与胞质不育的关系。在烟草线粒体基因组上检索到24个能重复稳定扩增出片段的mtSSR,对烟草属植物的这些mtSSR分析结果显示,普通烟草种内mtSSR较为保守,多态性比率仅10.5%;4种不育类型的各自不育系与保持系、不育胞质上存在多个差异位点,在Nta(sua.)S类型中差异位点在线粒体编码基因orf138a、orf138c以及orf102~orf210的基因间区;在Nat(gla.)S类型中,差异位点在线粒体orf138a、orf138c两个编码基因以及nad2~sdh3、rps12~orf125b、orf116~orf101b、orf102~orf210的4个基因间区;在Nta(rep.)S类型中,差异位点在线粒体编码基因orf190以及orf104c~orf202的基因间区;在Nta(rus.)S类型中,差异位点在线粒体编码基因orf137以及rps12~orf125b的基因间区。这些位点差异可能与各自的雄性不育有关。另外,mtSSR引物TMS20在Nat(sua.)S、Nat(gla.)S、Nat(rep.)S和Nat(rus.)S类型的雄性不育系中分别扩增出了184、172、212和225 bp的片段,表明可用该引物区分4种烟草CMS类型。     

小麦雄性不育系保持系过氧化物酶同工酶的比较研究

从小麦雄性不育系、保持系的10个不同组织、器官中共检测出8种过氧化物酶,在叶、芽鞘、根、节、节间、穗轴、叶鞘和芒中,不育系和保持系的过氧化物酶基本相同,说明这种酶由细胞核编码,但在花粉粒发育的3个不同时期,不育系与保持系间的过氧化物酶有明显差异,表现为不育系中的过氧化物酶同工酶多于保持系,这可能是由于不育系中细胞质不育基因对核基因的表达有调控作用,这种调控作用表现为不育细胞质基因的去阻遏作用,即不育细胞质基因可以去除细胞核中编码过氧化物酶基因的阻遏作用,使不育系中有更多的过氧化物酶基因得以表达,造成不育系中过氧化物酶同工酶多于保持系的现象.     

水稻野败不育系与保持系线粒体DNA限制酶酶切图谱分析

采用限制酶酶切片段长度多态性（ＲＦＬＰ）分析广泛比较了水稻野败不育系及其籼型保持系线粒体ＤＮＡ酶切图谱。野败不育系与籼型保持系线粒体ＤＮＡ在组成上存在十分明显的差异。根据具有相同迁移位置与大小的片段比例判断，这２种不同细胞质线粒体ＤＮＡ顺序同源性约为３０％。分子杂交结果显示，编码功能蛋白的基因及其邻近顺序存在在相当程度的保守性。本文并对线粒体ＤＮＡ的组成变异与细胞质雄性不育的关系进行了分析与讨论。     

胡萝卜雄性不育系生理生化特性研究

为进一步揭示与研究胡萝卜雄性不育的生化遗传机制,分析了胡萝卜雄性不育系及其同型保持系在花蕾发育的不同时期蛋白质、可溶性糖、丙二醛、脯氨酸、超氧化物歧化酶、过氧化物酶含量的变化趋势。结果表明,从小花蕾到盛花期,不育系和保持系蛋白质含量均呈现由高向低变化的趋势,不育系各期蛋白质含量均低于保持系;可溶性糖含量逐步升高,到盛花期达到最大值,不育系可溶性糖均低于保持系;不育系脯氨酸含量呈下降的趋势,而保持系则呈上升的趋势;不育系脯氨酸含量低于保持系,其中盛花期脯氨酸含量差异最大;超氧化物歧化酶含量逐步升高,保持系超氧化物歧化酶活性高于不育系;过氧化物酶含量的变化趋势为高—低—高,不育系过氧化物酶含量高于保持系;不育系丙二醛含量的变化为低—高—低,而保持系丙二醛的含量逐渐升高;花蕾发育的各个时期,不育系丙二醛含量远远高于可育系。     

油菜新型胞质雄性不育系1193A和保持系的同工酶分析

本研究利用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳技术,对油菜新型胞质雄性不育系1193A和保持系1193B花蕾发育过程中的过氧化物酶(POD)、三磷酸腺苷(ATP)酶和酯酶(EST)3种同工酶进行分析。结果表明,在花蕾生长发育的不同时期不育系与保持系的同工酶谱带数及表达活性之间均存在差异。在花蕾发育后期,不育系1193A的POD同工酶中迁移率最快的一条酶带活性明显强于保持系1193B;不育系1193A的ATP和EST同工酶活性都是随着花蕾发育逐渐减弱的,且在花蕾发育后期都出现了酶带的缺失。     

油菜细胞质雄性不育系及其保持系花蕾发育过程中的多胺代谢

在花蕾发育过程中,不育系花蕾的多胺代谢不同于其保持系。不育系花蕾中腐胺、亚精胺、精胺含量及三者之和均先略降后升高再降低,而其保持系则先降而后升高,在发育早期不育系明显低于其保持系。不育系的精氨酸脱羟酶活性一直下降,而其保持系的则先降后略升,不育系始终低于保持系。保持系的多胺氧化酶一直降低而不育系的先     

一个与小麦雄性不育育性转换相关的MADS-box转录因子基因

为了揭示YS型小麦温敏雄性不育育性转换的基础, 构建了该类型不育系A3017的不育和可育幼穗正、反杂交的两个SSH-cDNA文库。经文库比较, 在不育文库中筛选出一个与MADS-box基因同源的EST序列(GenBank登录号: 36925702)。以该EST序列的同源性比对和拼接结果为依据, 设计引物对该基因在可育和不育幼穗中的表达进行了RT-PCR分析, 结果表明, 该基因在不育幼穗中表达量较高, 可育幼穗中表达量很低。对不育幼穗中扩增出的cDNA片段进行克隆测序, 获得了666 bp的cDNA序列。序列分析表明, 该片段编码160个氨基酸, 具有MADS-box转录因子的典型结构域K-box, 被定名为TaMS-MADSbox, 与一个小麦MADS box转录因子基因WAG的氨基酸序列的相似性为94%。进一步以3种不同类型的小麦雄性不育系和保持系的幼穗cDNA为材料, 利用半定量RT-PCR对该基因的表达模式分析发现也存在类似差异, 该基因在不育系幼穗中表达量较高, 而保持系幼穗中表达量较低。以上分析表明, 该MADS-box转录因子基因的表达与小麦雄性不育系的育性转化相关, 表达量高时表现雄性不育, 表达量低时表现雄性可育。     

Trends of Activity of Three Kinds of Isozymes in the Flower Buds of Male-sterility Three Lines of Pepper

以辣椒雄性不育系1442A（灯笼型）和13733A（羊角型）及其保持系和恢复系为试材,对花蕾中SOD、POD和CAT 3种同工酶活性的变化趋势进行了研究。结果表明,随着花蕾发育,不育系1442A、13733A,保持系1442B、13733B,和恢复系1442C、13733C 的SOD活性变化趋势分别一致,POD、CAT亦同。保持系和恢复系花蕾中SOD活性均高于相应的不育系;不育系花蕾中SOD活性先下降后上升,在2级花蕾时期最低;保持系花蕾中SOD活性先上升后下降,在2级花蕾时期最高;恢复系花蕾中SOD活性变     

arnold911@sohu.com

 以辣椒雄性不育系1442A（灯笼型）和13733A（羊角型）及其保持系和恢复系为试材，对花蕾中SOD、POD和CAT 3种同工酶活性的变化趋势进行了研究。结果表明，随着花蕾发育，不育系1442A、13733A，保持系1442B、13733B，和恢复系1442C、13733C 的SOD活性变化趋势分别一致，POD、CAT亦同。保持系和恢复系花蕾中SOD活性均高于相应的不育系；不育系花蕾中SOD活性先下降后上升，在2级花蕾时期最低；保持系花蕾中SOD活性先上升后下降，在2级花蕾时期最高；恢复系花蕾中SOD活性变     

不同甜菜单胚细胞质雄性不育系与保持系的遗传多样性分析

利用35对SSR引物分析40对不同的甜菜单胚细胞质雄性不育系与保持系的遗传多样性。结果表明：每对引物扩增得到的条带数在2～12之间,有效等位基因数(Ne)、Shannon’s信息指数(I)、Nei’s基因多样性指数(H)的平均值分别为2.306、0.891和0.519。采用类平均法(UPGMA)进行聚类分析并计算遗传距离。聚类结果显示,除供试材料22与其他材料的遗传距离较大,亲缘关系较远,单独为一类群;其余的供试甜菜品系可分为4个类群;共有14对甜菜单胚细胞质雄性不育系与保持系完全聚合在一起,说明经过回交后,不育系和保持系的细胞核基因组之间几乎达到一致,纯度较高,今后可以直接应用于甜菜育种中;另有26对纯度较低,遗传距离较大,还需要继续进行回交至纯合。80份供试材料的遗传距离最大为0.462,最小为0.120。14对聚合在一起的原配组中的不育系之间遗传距离各不相同,今后可选择14对中遗传距离较大的不育系和其异型保持系配制二元不育系,用于杂交种中的母本。加大培育出甜菜新品种的可能性,同时减少了育种工作中的盲目性,有效的提高了甜菜育种效率。     

白菜型冬油菜温敏不育系PK3-12S育性转换的差异蛋白质组学分析

为揭示温敏不育系PK3-12S育性转换机制,本研究以白菜型冬油菜温敏不育系PK3-12花药为材料,采用2-DE和LC-MS/MS质谱鉴定等差异蛋白组学方法,分离鉴定了PK3-12在不育/可育条件下花药差异表达蛋白质,并对差异表达蛋白进行了生物信息学分析;进而采用RT-PCR检测了PK3-12在不育/可育条件下花蕾发育进程中差异蛋白编码基因表达量变化。结果表明,高温不育条件下, PK3-12花药形态瘪小,药室有少量败育花粉,育性转换受1对隐性基因控制,表达变化量在2倍以上差异蛋白质点31个,其中增量表达蛋白质点6个,减量表达蛋白质点11个,表达完全抑制蛋白点12个,不育花药特异表达蛋白点2个。质谱鉴定出15个差异蛋白质,参与信号转导通路、二羧基乙醛酸代谢、糖酵解代谢、次生合成代谢、氨基酸生物合成、分支酸生物合成、碳代谢途径等细胞过程。Rubisco亚基连接蛋白编码基因BrrbcL开放读码框(open reading frame, ORF)长度为1095 bp,编码364个氨基酸;与可育花蕾相比,发育进程中不育花蕾BrrbcL基因、膜联蛋白基因(ANN)、BetVI过敏原家族基因(BetVI)表达明显下调,表明上述基因可能参与了温敏不育系PK3-12S育性的转换。