巴西橡胶树产胶基因HbREF、HbHMGR1与MYCs转录因子互作

天然橡胶主要来自巴西橡胶树,巴西橡胶树是海南省主要的经济作物之一。胶乳在乳管中合成储存,乳管数量影响胶乳产量。乳管分化一直被证明与茉莉酸信号途径相关,本实验室已在前期研究中鉴定了茉莉酸信号途径中的关键转录因子MYCs与G-box顺式作用元件的互作,为了验证HbMYCs是否与含G-box(CACGTG)顺式作用元件的产胶相关基因互作,本研究克隆了两个产胶相关基因HbREF与HbHMGR1的全长启动子序列,并设计了相应的单荧光素酶报告基因实验,经生物信息学分析发现,2个基因的启动子上均含G-box (CACGTG)顺式作用元件,单荧光素酶报告基因实验的结果表明,HbREF和HbHMGR1分别与Hb MYC2、Hb MYC3、Hb MYC4互作,且受HbMYCs转录因子的正向调控,说明茉莉酸信号通路中的转录因子可以调控橡胶产排胶基因的表达,对阐明橡胶树产排胶机理具有重要意义。     

假禾谷镰孢侵染小麦后3种植物激素相关基因的差异表达分析

假禾谷镰孢(Fusarium pseudograminearum)是我国近年新发现的小麦病原真菌,本研究目的是揭示植物激素信号传导途径中相关基因表达对假禾谷镰孢侵染的响应。利用假禾谷镰孢野生菌株WZ2-8A侵染小麦品种周麦24,对接种后5 d和15 d样品进行转录组测序,分析差异表达基因,并对候选基因进行q RT-PCR验证。假禾谷镰孢侵染后,小麦幼苗生长受到明显抑制,根长、株高、根重和地上部分鲜重均显著降低。转录组分析结果表明,植物激素信号传导途径中有29个基因差异表达,涉及到生长素、细胞分裂素和脱落酸3种植物激素。在接种后5 d有11个差异表达基因,其中2个上调,9个下调;在接种后15 d共有25个差异表达基因,其中8个上调,17个下调。在生长素信号传导途径中,生长素输入载体AUX1差异表达,影响生长素的极性运输,从而影响小麦根部的细胞伸长。在细胞分裂素信号传导途径中,起正调控作用的B-ARR上调表达,推测其促进细胞分裂素的信号传导,从而抑制细胞分裂,与生长素协同作用,造成小麦的长势减弱。在脱落酸途径中,脱落酸受体PYR/PYL下调表达;起到负调控作用的PP2C相关基因均上调表达。脱落酸使植物对真菌和细菌的抗性起到负调控作用,其信号传导途径与茉莉酸/乙烯途径相互拮抗,脱落酸信号传导途径的阻遏可能会使茉莉酸/乙烯途径信号通路打开。q RT-PCR结果基本能够和转录组测序结果相拟合,说明在假禾谷镰孢侵染胁迫下,脱落酸的信号传导被抑制可能是中抗品种周麦24对假禾谷镰孢产生一定的抗性的生理基础。     

巴西橡胶树HbNAC55的克隆及表达分析

在前期巴西橡胶树胶乳转录组测序的基础上,利用q RT-PCR技术,从巴西橡胶树中克隆得到1个NAC转录因子基因,命名为Hb NAC55。Hb NAC55全长1 755 bp,该基因编码584个氨基酸,蛋白质分子量为65.06 ku,等电点为4.79。蛋白结构分析发现,该蛋白含有一个NAM结构域,具有典型的NAC类蛋白的结构特征,与木薯、胡杨、可可、土瓶草、梅、胡桃、甜橙等物种的NAC家族成员具有较高的同源性,分别为81%、61%、56%、57%、55%和53%。通过q RT-PCR发现Hb NAC55在橡胶树胶乳中表达量最高。茉莉酸和乙烯均能诱导胶乳中Hb NAC55表达上调,其中茉莉酸甲酯处理12 h后Hb NAC55表达量提高了近6倍,乙烯处理48 h后HNAC55表达量提高了近1.7倍。本研究将为进一步研究Hb NAC55在巴西橡胶树中的功能提供了帮助。     

结球甘蓝类钙调素蛋白基因BoCML39的克隆与表达分析

类钙调素蛋白作为钙调素蛋白的家族之一,调控植物生长发育、激素调控、病原菌防御及各种胁迫。本研究以结球甘蓝为试验材料,通过克隆获得BoCML39基因,其开放阅读框(ORF)为510 bp,编码169个氨基酸,不含内含子。预测BoCML39蛋白分子量为19.25 k D,等电点为4.35,为亲水蛋白,含有4个EF-hand结构域;系统发育树表明结球甘蓝BoCML39蛋白与白菜CML39蛋白处于同一进化枝,与油菜CML39蛋白、甘蓝CML39蛋白的亲缘关系近;三级结构预测发现该蛋白包含9个α-螺旋结构、5个β-转角、2个β-折叠、7个无规则卷曲和4个似小球状的钙离子结构。qPCR表明干旱(PEG6000,150 g/L)、盐(NaCl,200 mmol/L)、低温(4℃)、高温(37℃)、过氧化氢(H2O2,30 mmol/L)、脱落酸(ABA,100μmol/L)、水杨酸(SA,2 mmol/L)、茉莉酸甲酯(MeJA,100μmol/L)不同处理条件均能上调结球甘蓝叶和根中BoCML39的表达。研究结果初步证实BoCML39基因响应逆境胁迫(PEG6000,Na Cl,4℃,37℃)、活性氧(H2O2)和激素(ABA,SA,MeJA)调控,为Bo CML39参与植物逆境、活性氧和激素调控信号途径及其功能研究提供科学依据。     

棉花GhTGA1与GhTGA9.2基因克隆及表达特征分析

为了揭示棉花GhTGA1与GhTGA9. 2基因的生物学功能,利用RT-PCR技术,从抗枯萎病棉花品种中棉所12号中克隆了TGA转录因子基因GhTGA1与GhTGA9. 2。生物信息学分析表明,2个基因开放阅读框(ORF)长分别为1 281,1461 bp,分别编码405,486个氨基酸。序列分析表明,2个基因均含有b ZIP和DOG1结构域,属于b ZIP亚家族TGA转录因子基因。利用实时荧光定量(qRT-PCR)技术进行表达特征分析表明,GhTGA1基因能被枯萎病菌、乙烯(ET)、茉莉酸(JA)诱导上调表达,水杨酸(SA)诱导后,在各处理时间点,该基因表达量均低于Mock,以上结果表明,GhTGA1基因可能通过参与乙烯(ET)和茉莉酸(JA)信号通路调控棉花对枯萎病的抗性;枯萎病处理后,GhTGA9. 2基因在各时间点表达量均低于Mock,呈下调表达,但能被激素(ET、JA、SA)诱导上调表达。结果表明,GhTGA9. 2基因可能通过激素(ET、JA、SA)途径参与胁迫应答,通过对GhTGA1与GhTGA9. 2基因表达特征分析为后续研究提供基础。     

甘蓝型油菜CBF基因家族的鉴定和表达分析

低温是影响植物生长发育的重要环境胁迫因子,ICE1(inducer of CBF expression1)-CBF(C-repeat(CRT)-binding factors)-COR(cold responsive)在植物响应低温胁迫的信号途径中具有重要作用。为探究CBF(C-repeat-binding factors)基因在甘蓝型油菜(Brassica napus L.)中的进化以及在低温胁迫应答反应中的功能,本研究以4个拟南芥CBF基因为基础序列,鉴定出11个甘蓝型油菜、6个白菜和5个甘蓝CBF基因,并对它们的分子特性、蛋白保守结构域和系统进化树、基因结构及基因染色体分布、甘蓝型油菜CBF基因组织表达模式以及不同逆境和激素处理下的表达模式进行系统的比较分析。结果表明,在11个甘蓝型油菜CBF基因中,可分为亚组Ⅰ(CBF1/2/3)和亚组Ⅱ (CBF4) 2个亚组。转录组测序结果表明,所有甘蓝型油菜CBF基因受低温诱导表达,其中亚组Ib的4个基因对冷胁迫响应迅速且持续时间长,亚组Ⅱ中2个基因对冷胁迫响应表达较弱,但它们在根中表达量明显高于叶片,并且参与盐胁迫和渗透胁迫响应;甘蓝型...     

巴西橡胶树HbMADS5的克隆及表达分析

在前期巴西橡胶树胶乳转录组测序的基础上,通过PCR克隆了1个编码巴西橡胶树MADS-box转录因子的基因,命名为Hb MADS5。Hb MADS5全长1 077 bp,编码358个氨基酸,推测Hb MADS5蛋白分子量为40.75 k D,等电点为6.38。氨基酸序列比对分析表明,Hb MADS5具有MADS-box家族典型的MADS-box保守结构域,与蓖麻、葡萄、麻风树、甜橙、木本棉、蒺藜状苜蓿等物种的MADS-box家族成员具有较高的同源性,分别为79%、74%、72%、70%、65%和59%。Hb MADS5与麻风树中的1个MADS-box成员亲缘关系最近。Hb MADS5在巴西橡胶树根、茎、叶、花和胶乳等中都有表达,其中在胶乳中表达量最高,在根中表达量最低;茉莉酸甲酯和乙烯能诱导Hb MADS5的表达,茉莉酸甲酯处理12 h后Hb MADS5表达量提高了10倍,乙烯处理48 h后Hb MADS5表达量提高了2倍。本研究将为进一步研究Hb MADS5在巴西橡胶树中的功能提供了帮助。     

棉花酰基辅酶A结合蛋白(ACBP)家族基因的发掘及在非生物胁迫抗性中的功能鉴定

酰基辅酶A结合蛋白(ACBP)家族基因在植物正常生长发育、响应逆境胁迫及生物膜修复等方面具有重要作用。本研究基于陆地棉(Gossypium hirsutum)遗传标准系TM-1基因组序列信息,鉴定并获得21个棉花ACBP家族基因成员的全序列和染色体定位等信息。聚类分析表明这21个基因分属于I~IV类。依据与拟南芥的同源性,将棉花ACBP家族基因命名为GhACBP1~GhACBP6等6大亚类。转录组分析表明,该家族基因在不同组织、不同发育时期表达差异较大。不同逆境诱导分析表明,GhACBP1、GhACBP3和GhACBP6显著受盐、旱、低温、高温逆境胁迫诱导,而GhACBP4和GhACBP5对逆境胁迫响应不强烈。进一步分析表明,GhACBP3和GhACBP6的表达受过氧化氢(H2O2)、水杨酸(SA)、茉莉酸(JA)、脱落酸(ABA)和乙烯(ET)的诱导。病毒诱导的基因沉默(VIGS)试验表明,沉默GhACBP3和GhACBP6亚类基因会降低棉花植株对干旱和盐的耐性。目标基因沉默后,植株干物质积累下降,株高变矮,超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)活性降低,丙二醛(MDA)含量升高,表明GhACBP3和GhACBP6在棉花抗旱、耐盐中发挥作用。研究为利用ACBP家族基因进行棉花抗逆性研究及应用提供参考。     

不同激素信号途径在植物抗病中的相互作用研究进展

植物的抗病反应中,激素发挥着至关重要的作用。不同激素对于植物抵御不同种病原菌的作用方式并不相同。然而多种激素的信号途径之间在抗病反应中并不相互独立,而是存在相互作用。这种相互作用的存在使植物能高效协调体内不同激素信号途径的抗性,是抵御不同病原菌入侵的有效方法。本文综述了植物激素水杨酸、茉莉酸、乙烯、脱落酸、生长素和赤霉素在抗病反应中的作用以及这些激素信号途径之间的相互作用。     

褪黑素和茉莉酸甲酯基质育秧对水稻耐低温胁迫的调控作用

早稻育秧过程中易遭受低温冷害,引起水稻减产。因此,有必要研制耐低温的水稻育秧基质来保障早稻生产。本研究以我们实验室自己研制的发酵基质作为研究对象,外源添加褪黑素和茉莉酸甲酯后,分别在水稻萌发阶段和水稻生长7 d后进行为期3 d的低温处理,然后测定水稻的萌发状况、理化性质和基因表达,从而明确2种不同激素对早稻秧苗耐低温胁迫的调控机制。结果表明,褪黑素和茉莉酸甲酯均显著提高水稻在低温条件下的发芽率和发芽势;两者均能提高水稻在低温条件下的生长,包括提高株高、根长、根条数、干物重、叶龄和养分含量。在低温条件下,褪黑素和茉莉酸甲酯均能通过调节水稻体内抗氧化系统酶的活性和降低水稻体内过氧化氢与丙二醛含量来缓解低温胁迫导致的脂质过氧化损伤。褪黑素和茉莉酸甲酯均能提高低温条件下水稻体内的脯氨酸含量和叶绿素含量,降低脱落酸的含量,而茉莉酸甲酯则单独提高了水稻体内GA₃的含量。褪黑素和茉莉酸甲酯对水稻耐冷基因存在不同的调控作用,在低温条件下,两者均显著上调OsCDPK7和OsLti6b,显著下调OsWRKY45基因的表达,褪黑素单独上调OsFer1基因的表达,茉莉酸甲酯单独上调OsT...     

巴西橡胶树伤害诱导蛋白基因的克隆及表达分析

为了研究橡胶树在逆境胁迫下的分子机制,根据巴西橡胶树抑制消减(SSH)文库和NCBI数据库中的伤害诱导蛋白基因拼接序列设计嵌套引物,通过RACE技术获得基因的完整开放阅读框,命名为HbWUN1。序列分析表明HbWUN1长872 bp,含有390 bp的开放阅读框,编码129个氨基酸。生物信息学分析结果表明HbWUN1不含信号肽和跨膜结构,为亲水性蛋白。进化分析结果显示,橡胶树HbWUN1与拟南芥NP_974279.1聚成一类。RT-PCR分析结果表明HbWUN1表达无组织特异性,在胶乳中表达量最高。在叶片不同发育时期HbWUN1表达存在变化,在衰老期最高。此外,低温、伤害、高盐、乙烯和茉莉酸处理均调控HbWUN1表达,推测其可能在橡胶树逆境反应中发挥作用。     

巴西橡胶树JAZ家族基因的克隆和表达分析

茉莉酸是调控橡胶树创伤反应及产排胶的重要激素,JAZ蛋白是茉莉酸信号途径中重要的负调控因子。目前,巴西橡胶树中已报道7个JAZ基因。本研究结合Genebank中已有的橡胶c DNA序列和本实验室转录组测序数据,通过电子克隆的方法获得5个橡胶JAZ基因全长序列,分别命名为HbJAZ3、HbJAZ4、HbJAZ5、HbJAZ6和HbJAZ12,并通过RT-PCR技术成功扩增得到HbJAZ3、HbJA5、HbJAZ6、HbJAZ12等4个基因的编码区。最后采用定量RT-PCR技术分析发现,4个橡胶JAZ基因在橡胶不同组织中的表达有明显,以及其在伤诱导和茉莉酸处理后的差异表达,发现4个橡胶JAZ基因的表达都受到茉莉酸及创伤处理的影响,说明这些JAZ蛋白参与橡胶茉莉酸调控的创伤反应,本研究为阐明橡胶产排胶调控机理打下基础。     

橡胶草多聚泛素基因TkUBQ6基因的克隆及其表达分析

泛素/26S蛋白酶体途径(ubiquitin/26S proteasome pathway, UPP)调控植物生长发育以及抗病抗逆反应等过程,多聚泛素蛋白(UBQ)为泛素单体聚合而成的聚泛素蛋白,主要参与UPP途径的蛋白质水解过程,是一个可重复利用的信号分子,可以识别靶蛋白。为鉴定橡胶草中UBQ基因的结构与功能,本研究从橡胶草品系‘1151’中克隆得到一个多聚泛素基因,命名为‘TkUBQ6’。该基因编码区cDNA为462 bp,编码153个氨基酸。序列比对分析发现,不同物种的UBQ蛋白具有高度的相似性,而TkUBQ6的蛋白序列与同属菊科的莴苣Ls UBQ6相似性达到100%。采用实时荧光定量RT-PCR (RT-qPCR)对TkUBQ6基因的表达模式进行分析发现,该基因在橡胶草不同组织中均有表达。在PEG-6000模拟干旱胁迫、甘露醇介导的渗透压胁迫以及NaCl高盐胁迫处理下,TkUBQ6表达显著提高。在植物激素茉莉酸甲酯(MeJA)和脱落酸(ABA)诱导下,TkU-BQ6基因表达也明显上调;而乙烯利(ET)处理后,该基因的表达在24 h内先显著下调之后小幅度上调。本研究结果表明,TkUBQ6参与橡胶草的抗逆和激素信号的转导过程,为进一步解析橡胶草TkUBQ6的生物学功能提供了参考依据。     

草莓FvARF2的克隆、组织表达分析及对外源激素的响应

ARFs家族基因广泛参与植物生长发育的调控过程。为了研究草莓生长素响应因子FvARF2在草莓生长发育过程中的功能,以‘丰香’草莓为实验材料,利用RT-PCR技术克隆草莓FvARF2基因,对其序列特征进行生物信息学分析,并利用Real-time PCR技术分析了Fv ARF2在草莓不同组织(包括根,茎,叶,花,绿果, 1/2红果及红熟果)及外源激素生长素(IAA)、乙烯利(C2H4)、脱落酸(ABA)处理下的表达模式。结果表明,Fv ARF2基因开放阅读框为2 469 bp,编码822个氨基酸;预测其分子量和等电点分别为91.1 kD和6.11,具有保守的B3 DNA结合结构域和生长素响应因子保守结构域;该基因启动子区含有生长素、ABA、茉莉酸甲酯及胁迫相关的顺式作用元件。进化分析表明FvARF2与甜樱桃ARF2B基因亲缘关系最近;Real-time PCR结果表明,FvARF2基因表达量存在组织表达差异,且对外源IAA、ABA和乙烯有显著性应答反应,说明该基因可能参与了生长素、ABA和乙烯调控草莓发育的信号转导过程。本研究为后继研究草莓FvARF2的功能和作用机制作为参考依据。     

12个辣椒microRNA的靶标预测及表达分析

为了探索12个辣椒microRNA的时空表达及胁迫响应。根据辣椒中已鉴定和注释的microRNA信息,进行靶标预测和时空表达分析。靶标除转录因子外,还有ABC transporter、WD40和锌指结构等。辣椒中miRNA表达具有组织特异性,并且miRNA在果实发育中也起作用。同时,对辣椒进行脱落酸、茉莉酸甲酯、高温、低温、盐和辣椒疫病病原菌处理。采用实时荧光定量PCR检测12个miRNA在不同处理下的表达情况。结果发现micro RNA对胁迫有响应,对胁迫呈现出显著性表达差异,miR4414b受疫病胁迫上调表达,miR167在脱落酸胁迫下下调表达,miR396d经脱落酸、茉莉酸甲酯和疫病诱导后,显著上调表达。miR156在高温和低温胁迫下下调,靶标转录因子SBP可能上调,适应胁迫反应。但miR156a经NaCl诱导后显著上调表达,可能导致靶标下调表达。miR171c经脱落酸、茉莉酸甲酯和疫病处理显著下调,靶标GRAS基因可能上调抵抗胁迫,本研究对辣椒中miRNA的进一步研究提供帮助。     

普通菜豆镰孢菌枯萎病抗病相关基因PvCaM1的克隆及表达分析

钙调素蛋白(calmodulin,CaM)作为植物细胞内介导多种功能的Ca²⁺结合蛋白,在调节植物的生长发育和抗病性方面具有重要作用。利用普通菜豆(Phaseolus vulgaris L.)表达序列标签(EST)克隆了含有编码普通菜豆CaM基因的cDNA序列。序列分析表明,cDNA片段长713 bp,命名为PvCaM1,具有一个453 bp的开放阅读框(ORF),GenBank登录号为JN418801,该基因编码150个氨基酸,预测蛋白质分子质量为17.16 kD。蛋白质结构分析表明,PvCaM1蛋白含有4个Ca²⁺结合结构域(EF-hand)。同源分析结果显示,PvCaM1基因与百脉根、西瓜的CaM基因亲缘关系最近,分别达到77%和76%。荧光定量PCR分析表明,PvCaM1基因受尖孢镰孢菌菜豆专化型FOP-DM01菌株诱导表达,接种病原菌96 h,抗病品种260205根中PvCaM1基因的表达量达到最高,而感病品种BRB-130达到最低,260205叶中PvCaM1基因的表达量均高于BRB-130,而且叶中的表达量高于根和茎中的表达量。PvCaM1基因表达量也受外源植物激素脱落酸、茉莉酸甲酯和乙烯利诱导上调,在根、茎、叶中均有不同程度的表达。本研究表明PvCaM1基因可能通过脱落酸、茉莉酸和乙烯等信号途径参与菜豆对FOP-DM01菌株的防御反应,推测菜豆PvCaM1基因与镰孢菌枯萎病的抗病性有一定关联。     

水稻植物激素响应低温胁迫反应的转录组分析

植物激素在调节和控制植物生长发育、代谢过程、应对逆境等方面具有重要的作用。为明确水稻苗期植物激素对低温的应答机制,本研究以野生型粳稻品种‘中花11’为研究材料,经低温处理后,利用RNA-Seq技术分析植物激素调控水稻幼苗对低温胁迫的应答模式。通过转录组测序,共获得9.9×10~7条干净的序列,筛选出2 044个差异表达基因(DEGs)。首先,GO富集分析结果表明差异表达基因主要富集在生物学过程、细胞组分和分子功能三个方面。进一步的KEGG通路分析表明,差异表达基因主要富集在代谢途径、次生代谢生物合成、植物激素信号转导等途径。其中植物激素信号转导中低温应答的差异表达基因为31个,分别为25个上调表达基因和6个下调表达基因;主要参与了茉莉酸和脱落酸信号途径。这些研究结果对水稻苗期植物激素的低温应答机制完善和栽培调控具有重要的参考价值。     

棉花GhWRKY106-1的克隆与表达分析

为了研究WRKY转录因子对棉花抗枯萎病的作用机理,发掘抗枯萎病基因资源,本实验以枯萎病菌诱导棉花根部基因表达谱中筛选出的WRKY基因片段为探针,利用电子克隆结合RT-PCR技术,从陆地棉"中棉所12"根部c DNA克隆得到一个WRKY基因,命名为Gh WRKY106-1(登录号:KP202869)。序列分析表明,该基因开放阅读框全长918 bp,编码306个氨基酸,含有1个WRKY结构域和一个典型的C2HC锌指结构,属于典型的第Ⅲ类WRKY家族转录因子。q RT-PCR检测该基因在"中棉所12号"中的表达特性结果分析表明:枯萎病菌诱导后,该基因的表达量表现出先升高后降低的趋势,并且在处理后3 h基因的表达量达到最大。激素处理:茉莉酸(JA)、水杨酸(SA)和乙烯(ET)胁迫后Gh WRKY106-1基因表达量均发生变化,其中茉莉酸在处理后4 h基因的表达量达到最大,而水杨酸和乙烯诱导响应最强烈的时间均在3 h;并且水杨酸诱导Gh WRKY106-1基因的表达较茉莉酸强烈,而乙烯的表达量在处理前期又明显高于水杨酸和茉莉酸,因此推测该基因在棉花对枯萎菌的抗性反应中起着一定作用,可为今后棉花抗枯萎病研究提供依据。