普通小麦MYB转录因子Tamyb59的克隆及表达分析

为进一步挖掘小麦逆境胁迫响应基因在植物非生物逆境胁迫应答中的作用,探究小麦逆境胁迫响应机制,从前期转录组结果中筛选出1个编码MYB蛋白的基因,暂命名为Tamyb59,通过PCR技术扩增Tamyb59的全长;利用NCBI和DNAMAN软件进行基因序列比对和保守结构域的分析;利用Expasy和TMHMM等在线软件进行氨基酸组成、亲水系数分析;采用MEGA 6. 0软件构建系统进化树;构建pMDC83-GFP融合表达载体,进行基因表达的亚细胞定位分析。采用qRT-PCR分析了基因在不同非生物胁迫处理过程中不同组织的表达特性,并利用SAS数据处理软件进行差异显著性分析。结果表明:该基因含有典型的SANT保守结构域,CDS序列全长为522 bp,编码173个氨基酸,编码蛋白分子质量为19. 7 ku,理论等电点为7. 61。基因系统进化分析结果表明,Tamyb59与山羊草、粳稻、玉米等9种植物MYB转录因子有52. 0%～85. 6%的同源性,其中与谷子的MYB蛋白同源性最高。亚细胞定位结果显示,Tamyb59基因编码蛋白定位在细胞核。利用qRT-PCR分析了基因在不同非生物胁迫处理过程中不同组织的表达特性,组织表达特异性分析显示,Tamyb59基因在小麦根中的表达量较高,茎、叶和幼穗中表达量较低; PEG和盐胁迫处理过程中,Tamyb59基因的表达均呈现先上升后下降的趋势,说明Tamyb59基因对不同非生物胁迫有不同的响应。     

紫花苜蓿转录因子MsNF-YB4的克隆及其耐盐作用的评价

核因子Y的B亚基(NF-YB)可以在植物的生长、发育和抗逆响应中调节多种基因的表达,在植物的各种生理活动中发挥重要作用。紫花苜蓿是重要的牧草,具有较强的抗逆能力。本研究从紫花苜蓿中克隆了一个NF-YB基因,即MsNF-YB4(Gen Bank登录号为KX966286)。该基因的开放阅读框长度为405 bp,编码134个氨基酸残基。经过比对发现,该基因与蒺藜苜蓿的NF-YB4(Mt NF-YB4)在m RNA的编码区内同源性为92%,而在蛋白水平上的同源性为94%。通过比对分析,发现MsNF-YB4含有典型的NF-YB转录因子保守结构域。我们通过qPCR的方法对MsNF-YB4基因的表达模式进行了分析,结果发现,在盐碱和干旱胁迫下,根瘤和根中的表达量显著上调,暗示该基因在盐碱和干旱胁迫的响应中发挥作用。我们构建了植物表达载体pCBC-MsNF-YB4,并通过农杆菌介导法获得了过量表达MsNF-YB4基因的转基因烟草。对T1代转基因烟草的耐盐性测试结果表明,MsNF-YB4基因的表达提高了转基因烟草的耐盐性,转基因烟草幼苗可以在含有1.4%Na Cl的培养基上生长。这些结果表明,MsNF-YB4在紫花苜蓿的盐胁迫响应中发挥重要作用。     

木薯转录因子基因MeHDZ14的克隆与分析

HD-Zip家族基因在植物生长发育和逆境胁迫中起重要作用。为了研究MeHDZ14基因在非生物胁迫(尤其是干旱)应答中的作用,选用对干旱信号反应灵敏、相对耐旱的木薯品种"SC124"作为实验材料,利用RT-PCR克隆了MeHDZ14基因。生物信息学分析发现,MeHDZ14基因编码的蛋白具有典型的HD-Zip保守结构域。将该基因编码的蛋白与GFP融合,亚细胞MeHDZ14:GFP重组蛋白定位于细胞核。同时,酵母Y187中的转录自激活试验结果也表明,MeHDZ14蛋白具有明显转录自激活功能。推断MeHDZ14是一个典型的HD-Zip I转录因子。MeHDZ14启动子区具有多个ABA响应元件ABRE(ABA response element)。基因差异表达分析结果表明,MeHDZ14基因在叶片和根中的表达受干旱胁迫的诱导,并对外源ABA具有明显的响应。因此,认为MeHDZ14基因通过ABA依赖信号传导途径参与调控木薯干旱响应。此外,还发现MeHDZ14基因的编码区虽然存在数个SNP,但表现出高度保守性,且在不同木薯品种中的表达对干旱胁迫均有明显的响应,为进一步研究该基因的功能奠定了基础。     

烟草磷酸酶基因NtPP2C16的克隆、表达载体构建及表达分析

2C型丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶(PP2C-type protein phosphatases,PP2C)是ABA信号转导途径中的关键组分,在植物生长发育、细胞周期调节及应对逆境胁迫的过程中发挥重要的作用。为探究PP2C基因在烟草适应非生物胁迫中的功能,从烟草栽培品种K326中克隆到了一个PP2C同源基因,该基因开放阅读框为1 617 bp,编码538个氨基酸残基。同源性分析结果显示,该基因所编码的蛋白与绒毛状烟草PP2C16的亲缘关系最近,故命名为NtPP2C16。生物信息学分析表明,NtPP2C16催化区域上具有PP2C家族进化中相对保守的11个结构亚区。qRT-PCR研究分析结果表明:该基因的表达显著受ABA和H_2O_2 2种信号分子诱导,并且响应干旱、高盐、低温和低钾胁迫。成功构建NtPP2C16-pBI121过表达载体,为解析NtPP2C16参与烟草非生物逆境胁迫响应提供一定的理论依据。     

小麦胁迫相关基因TaLEAL3的克隆及分子特性分析

第3组LEA蛋白(late embryogenesis abundant protein)介导干旱、高温、高盐等非生物胁迫响应, 关于普通小麦LEA基因的研究鲜有报道。利用噬菌体原位杂交技术, 从小麦苗期干旱胁迫条件构建的cDNA文库中筛选出LEA蛋白基因TaLEAL3, 其全长750 bp, 编码区长501 bp, 编码166个氨基酸, 含有一个明显的核定位信号区。氨基酸同源性分析发现, TaLEAL3属于第3组LEA蛋白, 序列中含有由11个氨基酸组成的3个不完全重复的基序和α-螺旋的LEA结构。电子定位结果显示, TaLEAL3基因位于4BL、4DL和5AL染色体上, 主要在茎中表达, 而在根中几乎无表达。实时荧光定量PCR分析表明, 在干旱、低温和ABA诱导下, TaLEAL3基因表达量明显增加。在该基因上游1.7 kb序列处, 预测具有启动子的核心序列和增强子序列, 及与干旱和低温等多种逆境胁迫相关的调控序列。本研究为深入分析小麦LEA蛋白基因的功能, 初步解析LEA蛋白的作用机制提供了数据。     

木薯MePYL8基因克隆及表达分析

脱落酸介导的核心信号通路在植物应答非生物胁迫的过程中具有重要功能,而PYL蛋白是该信号通路中ABA的受体,因此研究PYL家族基因有助于完善对该信号通路的理解。本研究利用PCR技术从木薯栽培种KU50中克隆得到一个PYL家族基因,命名为MePYL8,该基因的开放阅读框全长为579 bp,编码193个氨基酸。对其进行序列比对表明MePYL8与橡胶树和麻疯树中的氨基酸序列同源性最高,进化树分析显示MePYL8与拟南芥PYL8/RCAR3的亲缘关系最近。此外,利用荧光定量PCR对MePYL8进行多种处理下的表达分析,结果显示:MePYL8在转录水平受到ABA、高盐胁迫和干旱胁迫的诱导作用,同时受到氧化胁迫的抑制作用,表明MePYL8在多种非生物胁迫下的信号转导通路中可能具有重要的功能。本研究为后续深入研究该基因的功能和分子调控机制提供理论依据,为作物抗逆育种提供潜在的资源。     

甜菜ERF转录因子基因克隆及非生物胁迫响应分析

ERF(Ethylene-responsive element binding factors)是调控植物生长发育和响应胁迫的重要转录因子，在植物应对生物及非生物胁迫反应、调控胁迫相关功能基因的表达、提高植物的抗逆性中起着重要的作用。分析甜菜ERF转录因子基因在非生物胁迫下的表达规律，旨在为深入研究ERF转录因子在甜菜逆境胁迫应答中的作用机制提供理论依据。本研究以高糖型甜菜品系‘BS02’为试材，利用RT-PCR方法克隆得到Bv＿ammr基因，并对其进行生物信息学分析。该基因CDS区长906 bp，编码301个氨基酸。蛋白质分子量为33.19 kD，理论等电点为8.61，其二级结构以无规则卷曲和α-螺旋为主，具有一个AP2保守结构域；氨基酸序列的同源性和进化树分析显示其编码蛋白与马兜铃菌毛所编码的蛋白亲缘关系较近。采用实时荧光定量PCR方法观测非生物胁迫下该基因表达模式，结果表明，Bv＿ammr基因对低温、高温、干旱、盐、ABA等非生物胁迫有不同程度响应。     

黄瓜独脚金内酯信号转导基因CsMAX2的克隆与表达分析

独脚金内酯(strigolactone, SL)是一类新型植物激素,MAX2基因是独脚金内酯信号转导途径中的关键基因。本研究从黄瓜中克隆了CsMAX2基因,其编码715个氨基酸。生物信息学分析表明CsMAX2是一类亲水性蛋白,具有保守的F-box/LRR-repeat结构域,与南瓜中的MAX2基因亲缘关系最近,并且该蛋白与SL合成通路中的D27、CCD7与CCD8等蛋白均有互作关系。启动子分析表明该基因有多个响应非生物胁迫与激素应答的顺式作用元件。表达特性分析表明,CsMAX2在黄瓜的幼茎和幼叶中表达量较高;CsMAX2在黄瓜根与叶中积极响应干旱胁迫诱导上调表达;在盐胁迫条件下,Cs MAX2基因在根与叶中的表达量相反;同时发现CsMAX2也参与了ABA信号转导途径。本研究初步分析了Cs MAX2基因的蛋白特性及表达特性,为CsMAX2在黄瓜独脚金内酯信号转导途径中响应非生物胁迫提供了帮助。     

小麦wzy2-1基因的克隆及功能分析

脱水素是一类植物胚胎发育后期丰富蛋白(late embryogenesis abundant protein, LEA蛋白),属于LEA D-11家族,植物受非生物胁迫会大量表达。利用同源克隆技术,从郑引1号小麦中克隆了1个Kn型脱水素基因,命名为wzy2-1。该基因全长1740bp,编码579个氨基酸,含有9个保守的K片段,与大麦的Dhn5基因具有较高同源性。生物信息学预测该蛋白属于高度亲水性的无序蛋白。通过该蛋白对大肠杆菌的保护作用研究表明,WZY2-1蛋白能够提高大肠杆菌对低温、高温、高盐以及高渗胁迫的耐受性。荧光实时定量PCR分析表明,wzy2-1基因受低温、盐渍、干旱诱导表达,但不受外源ABA诱导,说明wzy2-1基因属于非ABA依赖型脱水素基因。     

拟南芥中AtACO3基因启动子DNA甲基化的调控机制

RNA介导的DNA甲基化途径(RdDM)在基因表达调控过程中起重要作用。沉默抑制因子(repressor of silencing 1, ROS1)能负调控RdDM途径。定量RT-PCR(quantitative RT-PCR, RT-qPCR)被利用检测拟南芥(Arabidopsis thaliana)中ABA途径相关基因AtACO3表达水平,结果表明非生物胁迫诱导后AtACO3表达水平显著上调。重亚硫酸盐测序结果证明非生物胁迫诱导该基因启动子重复序列的DNA去甲基化,并导致该基因的转录激活。进一步研究证实ROS1在诱导该基因启动子DNA去甲基化的过程中起作用。本研究揭示了非生物胁迫诱导逆境响应基因AtACO3表达的分子机制,为探索植物适应非生物胁迫的表观遗传调控机制提供了科学依据。     

葡萄VvMSA基因的克隆及表达特性分析

为了解VvMSA基因的功能,以抗性葡萄品种Vidal Blanc组培苗为试材,克隆得到VvMSA基因,对其序列进行了生物信息学分析,并利用实时定量PCR分析了其组织表达特性和多种非生物胁迫和信号应答表达特性。结果表明,VvMSA基因片段大小为450 bp,编码149个氨基酸序列。生物信息学分析结果显示,VvMSA蛋白分子量约为16.703 k Da,等电点为5.68,不稳定系数为41.71,推测为不稳定蛋白。VvMSA含有65个氨基酸组成的ABA/WDS保守结构域。在进化上属于单独一个分支,它和已报道过的番茄Le ASR1分别属于同一个祖先进化出的2个分支。实时荧光定量PCR分析显示,VvMSA在葡萄不同组织中均有表达,花中表达量最高。多种逆境胁迫因子如盐、干旱和低温等能诱导VvMSA不同程度的上调表达,盐胁迫3 h时诱导表达量最高。同时,VvMSA受逆境胁迫信号分子NO和H_2S不同程度诱导表达上调,而SA则抑制VvMSA表达。激素ABA、GA_3、IAA和ET均能不同程度诱导VvMSA表达上调,并且VvMSA盐处理下的表达模式与ABA诱导的类似。综合以上结果推断VvMSA可能通过调控ABA信号途径来调节葡萄对盐胁迫应答。     

花生果糖-1,6-二磷酸醛缩酶基因AhFBA1的克隆与表达

以花生品种花育33为试材, 根据cDNA文库中已知的果糖-1,6-二磷酸醛缩酶 (fructose-1,6-bisphosphate aldolase, FBA) 基因全长序列设计引物, 通过RT-PCR克隆到该基因, 命名为AhFBA1。AhFBA1全长为1489 bp, 开放阅读框为1200 bp, 编码400个氨基酸。预测该基因编码的蛋白含有Glycolytic保守结构域, 可能定位于叶绿体中。蛋白序列比对和进化树分析表明, 花生与大豆(Glycine max)、苜蓿(Medicago truncatula)、鹰嘴豆(Cicer arietinum)和菜豆(Phaseolus vulgaris)等豆科植物中的FBA序列相似性最高, 亲缘关系最近。荧光定量PCR结果显示, 在高盐和干旱胁迫下, AhFBA1在花生叶和根中的表达均受明显诱导, 说明该基因可能参与花生对高盐和干旱胁迫的适应性调控; AhFBA1在花生根和叶中均受ABA的明显诱导, 说明该基因对花生非生物胁迫的调控可能是依赖ABA的。     

玉米液泡ATP酶亚基A基因的克隆及表达分析

V-ATPase在植物应对非生物胁迫中起着十分重要的作用, 对其关键亚基基因的克隆及分析有助于阐释其在逆境下的调节及响应机制。本文利用RACE技术从玉米自交系CN165花期水分胁迫下的总RNA中克隆出液泡ATP酶亚基A基因, 命名为ZmVHA-A。该基因cDNA全长2 414 bp, 含5′-UTR(293 bp)、3′-UTR(257 bp)及编码区(1 863 bp), 编码620个氨基酸。序列比对及结构域预测结果表明, ZmVHA-A基因编码的氨基酸序列与亲缘关系比较接近的禾本科作物如水稻、小麦和大麦的氨基酸序列同源性分别达92.7%、89.8%和89.8%, 且在编码蛋白的氨基酸序列上有两个与核苷酸的磷酸基团相互作用的保守结构域“GAFGCGKT”和“PSVNWLISYS”, 可见该亚基是相对保守的。Northern杂交分析结果表明, ZmVHA-A基因在花丝中被水分胁迫诱导表达且在苗期对盐胁迫、冷处理和ABA处理具有不同的表达响应方式, 因此认为VHA-A基因是一个比较保守的功能亚基,并且通过转录表达调节参与了V-ATPase对逆境胁迫的适应。     

烟草过氧化物酶基因NtPOD1的克隆及表达模式分析

为烟草过氧化物酶基因的功能及结构研究奠定理论基础,采用同源克隆的方法,从烤烟品种K326中克隆出了过氧化物酶基因Nt POD1的c DNA全长,并进行了生物信息学分析;同时,运用q RT-PCR的方法,分析了该基因的组织器官及逆境胁迫表达模式。结果显示,该基因c DNA全长981 bp,编码326个氨基酸残基,预测分子量为37.19 ku,等电点为8.89。生物信息学分析表明,该蛋白是一个亲水性蛋白,结构域中含有4个保守的二硫键和2个保守的钙结合位点,可能定位在细胞外(包括细胞壁),属于植物血红素依赖性过氧化物酶超家族的Ⅲ类分泌氧化酶,与渐窄叶烟草POD42、美花烟草POD42、马铃薯POD42等具有很高的同源性。该基因在烟草根、茎、叶、花中均有表达,其中叶中表达量最高,花中表达量最低。同时,Nt POD1的表达受高盐、干旱、低钾、ABA和H2O2诱导。结果表明,Nt POD1基因属于烟草的过氧化物酶,并可能在烟草非生物逆境胁迫响应中发挥作用。     

小麦抗坏血酸过氧化物酶TaAPX基因克隆与表达分析

为了研究非生物胁迫处理下小麦抗坏血酸过氧化物酶(APX)的作用,以小麦百农207为试验材料,根据小麦APX基因序列,采用RT-PCR技术对小麦APX基因进行克隆、生物信息学分析及组织表达模式分析;对小麦进行非生物胁迫处理,分析小麦APX基因在环境胁迫条件下的表达特征。结果表明,TaAPX基因包含876 bp的开放阅读框,编码1个291个氨基酸组成的蛋白质,分子质量为31.73 ku,等电点为7.74,分子式C_(1417)H_(2246)N_(394)O_(423)S_5,TaAPX可能是两性蛋白,无信号肽,为非分泌蛋白。蛋白质序列比对和进化树分析表明,小麦与大麦的APX编码蛋白的氨基酸全长序列相似性最高达到97.25%,亲缘关系最近。实时荧光定量PCR分析表明,TaAPX在小麦幼根、茎、茎节、幼叶、叶鞘、雌蕊和雄蕊中均有表达,其中在幼叶中表达量最高,其次是茎、茎节,在幼根、叶鞘中表达量较低,在雌、雄蕊中表达量最低。在非生物胁迫条件下该基因受干旱、低温胁迫表达增强,而在NaCl胁迫和渗透胁迫下表达降低。综上,获得了TaAPX基因的编码区序列,分析发现其响应干旱、低温和盐等逆境胁迫,提示该基因可能与小麦抗逆境机制密切相关。     

谷子磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(PEPC)对逆境胁迫的响应

为解析谷子磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC,Phosphoenolpyruvate carboxylase)在非生物逆境胁迫下的响应特征。从谷子基因组中鉴定出一个Si PEPC(Seita. 1G020700)基因,利用相关软件对其氨基酸序列、蛋白特征、功能、信号途径、顺势应答元件等参数特征进行分析和预测,随后分析了该基因在幼苗期逆境胁迫下的动态表达模式及在拔节期、抽穗期、灌浆期不同光照处理和干旱胁迫下的表达。结果表明,该基因位于谷子1号染色体,基因组序列长6 652 bp,编码965个氨基酸,基因无可变剪切、不含内含子;功能域分析显示,该基因含PEPC基因的特征结构域;多序列比对发现,该PEPC蛋白与其他植物PEPC蛋白非常相似,具有非常保守的序列结构。实时荧光定量PCR分析表明,Si PEPC(Seita. 1G020700)在ABA、低温、PEG、高盐胁迫下表达量均有所上调,其中,在ABA处理时,表达量呈现波动,在12 h被诱导达到峰值。在低温处理时,表达量持续上升,在24 h达到峰值;在PEG和Na Cl处理时表达量整体呈上升趋势,均在12 h达到峰值,在24 h其表达量均急剧下降。进一步研究表明,Si PEPC基因在拔节期和抽穗期正常光照强度下参与了对干旱胁迫的响应,推测Si PEPC(Seita. 1G020700)基因参与了谷子对非生物逆境的应答,可能在干旱和其他逆境胁迫信号途径中起关键作用。     

棉花GhbHLH基因的克隆与表达分析

bHLH(basic helix-loop-helix,bHLH)家族基因在植物生长发育和非生物胁迫应答中发挥着重要的作用。本研究从前期构建的棉花cDNA文库中发掘得到一个新的GhbHLH基因,该基因开放阅读框全长600 bp,编码199个氨基酸,序列分析表明,该基因具有典型的helix-loop-helix结构域。荧光定量PCR表明,GhbHLH在棉花根、茎、叶和纤维中均有表达,并且能够受高盐、PEG、低温、ABA和Me JA等的诱导表达,亚细胞定位结果表明,GhbHLH在细胞核内表达。推测该基因可能作为调控因子在棉花非生物胁迫应答中发挥作用。     

棉花精氨酸酶基因GhARG1 cDNA的克隆与表达分析

为了深入研究棉花精氨酸酶基因对非生物胁迫的响应以及生理功能,利用电子克隆和RT-PCR技术从棉花中获得了精氨酸酶ORF序列Gh ARG1,盐渍、PEG6000胁迫及ABA、SA和MeJA处理棉花幼苗,并原核表达棉花精氨酸酶基因。生物信息学分析表明,其ORF序列长度为1 023 bp,编码340个氨基酸,具有典型的精氨酸酶保守结构域。q RT-PCR技术分析表明,在叶片中该基因转录水平上受盐渍、PEG6000胁迫及ABA、SA处理的诱导,而对MeJA下调其表达。将Gh ARG1完整的编码序列融合到原核表达载体p Cold-TF中,经过IPTG诱导及SDS-PAGE检测表明,Gh ARG1编码产物的分子量约为37 ku,与预期相符。p Cold-Gh ARG1重组菌粗酶液中精氨酸酶活性是对照菌的6倍。研究表明,棉花内源性精氨酸酶基因Gh ARG1可能通过ABA、SA信号途径参与棉花对盐渍和干旱胁迫的响应,且其克隆表达产物具有精氨酸酶活性,为开展其生理功能研究奠定了基础。     

普通小麦春化处理过程中wcor14a基因的表达分析

为进一步完善普通小麦春化特性理论基础,从不同春化特性小麦品种RNA-Seq结果中筛选得到一个春化诱导上调表达的EST序列Unigene3230,经NCBI比对与小麦wcor14a基因序列一致。为进一步明确该基因在春化过程中的功能,利用荧光定量PCR分析了wcor14a基因在非生物胁迫下的表达特性,结果显示,wcor14a基因能够响应低温、ABA、干旱等非生物胁迫。对wcor14a基因在不同春化发育特性小麦品种中的表达分析表明,该基因在不同发育特性小麦品种中的表达总体表现为春性半冬性冬性强冬性,而且表达时间表现为冬性和强冬性早于春性和半冬性。     

扁桃AcCBF2基因的克隆及其在逆境胁迫下的表达分析

本研究根据扁桃生物信息学数据库,采用PCR的方法从扁桃(Amygdalus communis L.)中克隆了一个CBF转录因子基因,命名AcCBF2,基因开放阅读框(open reading frame,ORF)为717 bp,编码238个氨基酸,预测其分子量26.59 kD,等电点为5.29。氨基酸多重序列比对显示,AcCBF2基因编码的氨基酸与其它植物冷胁迫相关的CBF氨基酸序列具有高度同源性,含有一个AP2功能结构域和2个特征基序;系统发育树分析显示,AcCBF2基因属于DREB家族中的A-1亚族,荧光定量显示,AcCBF2基因只对低温和干旱胁迫有响应,对盐胁迫和ABA(脱落酸)没有明显响应。在低温胁迫下,表达量上调;而在干旱胁迫下,表达量先上调后下调。初步预测AcCBF2基因可能对扁桃非生物胁迫有重要的调控作用。