红麻液泡膜质子泵H~+-PPase(Hcvp1)基因的克隆、序列分析和表达

为了阐明红麻耐盐机理,以耐盐性较强的中红麻16号为材料,从红麻耐盐转录组测序结果中获得了1个与AVP1基因高度相似的Unigene,根据该片段的序列设计引物,直接进行PCR扩增,经Sanger测序获得该基因全长c DNA序列。对该基因序列进行生物信息学分析表明:该基因全长2 298 bp,开放阅读框为2 298 bp,编码765个氨基酸,其编码蛋白质的分子量和等电点分别为80.2 k Da和5.25,与雷蒙德氏棉、甜橙、毛果杨、烟草和大豆的H+-PPase基因核苷酸序列的相似性分别为90%,85%,85%,83%,83%,蛋白质序列的相似性分别为96%,93%,91%,93%,94%,说明该基因与AVP1为同源基因,命名为Hcvp1。qRT-PCR分析表明,该基因的表达量随着Na Cl浓度的增加而增加。这将为Hcvp1基因的功能验证和红麻耐盐机理的研究奠定坚实的基础。     

过表达谷子液泡H~+-ATPase E亚基基因在拟南芥中的耐盐性

V-H+-ATPase在植物生长、发育和胁迫响应等生物学过程中发挥重要作用。本研究通过序列比对,从谷子中克隆到V-H+-ATPase E亚基基因Si VHA-E。进化树分析显示,Si VHA-E基因在进化上属于E1/E3亚族,与玉米V-H+-ATPase E亚基基因Zm VHA-EL亲缘关系较近。表达谱分析结果显示,Si VHA-E在高盐、茉莉酸甲酯(Me JA)、水杨酸(SA)和脱落酸(ABA)处理下表达上调,在低温和低氮处理下表达下调。亚细胞定位分析表明Si VHA-E定位于液泡膜上。遗传转化拟南芥的耐盐性鉴定表明,在盐处理条件下,转基因株系的种子萌发率、幼苗主根长、植株鲜重及存活率显著高于野生型的。与野生型拟南芥植株相比,Si VHA-E过表达植株体内Na+含量减少,体内相对含水量提高。此外,ABA萌发试验结果显示,在种子萌发后期,Si VHA-E过表达植株对ABA更加敏感。研究表明,谷子Si VHA-E可以显著提高拟南芥耐盐性,这可能与其正向调控ABA信号途径以及减少植株体内Na+积累和水分散失有关。     

百脉根液泡膜H+-PPase基因LcVP1植物表达载体构建与转基因毛白杨的获得

为通过基因工程手段进行杨树耐盐性状的遗传改良,本文分析已克隆的百脉根液泡膜H+-PPase基因LcVP1的cDNA序列,根据其与植物表达中间载体pGN上的酶切位点设计一对带酶切位点的特异性引物,以测序质粒为模板,PCR扩增百脉根液泡膜H+-PPase基因开放阅读框片段。双酶切PCR回收产物和pGN载体,将目的片段定向连接构建成植物表达载体pGVP,并转入根癌农杆菌;在此基础上,利用根癌农杆菌介导的叶盘转化法,将百脉根液泡膜H+-PPase基因转入毛白杨基因组中。转基因杨树的获得,为获得耐盐性提高的杨树品系提供了基础。     

棉花液泡膜H~+-ATPase A亚基的克隆及表达载体的构建

液泡膜H+-ATPase在植物应对非生物胁迫中起着十分重要的作用,对其关键亚基基因的克隆及分析,有助于阐释V-ATPase在逆境下的调节及响应机制。本研究利用RT-PCR技术从棉花中克隆了一个液泡膜H+-ATPase亚基A基因,命名为Gh VHA-A。该基因ORF为1 872 bp,编码623个氨基酸,预测的蛋白质理论分子量为68.41 k D,等电点为5.17。通过氨基酸序列比对和系统进化树分析发现,Gh VHA-A与可可V-ATPase A亚基的同源性最高,达到97.9%,在进化上亲缘关系较近;且在编码蛋白的氨基酸序列上有两个与ATP或GTP的磷酸基团相互作用的保守结构域GAFGCGKT和PSVNWLISYS,说明A亚基是相对保守的。本研究构建了植物表达载体p CAMBIA 1304-VHA-A,并转入到根癌农杆菌(GV3101)中,为后续研究棉花V-ATPase A亚基基因在干旱胁迫应答中的功能奠定试验基础。     

刚毛柽柳液泡膜H~+转运无机焦磷酸酶ThVP3的克隆与表达分析

通过对刚毛柽柳转录组的分析,获得并克隆了1个H~+-PPase基因cDNA全长,命名为ThVP3。序列分析结果表明:ThVP3全长3 500 bp,包含2 406 bp完整的开放读码框,618的5'非编码区和476 bp的3'非编码区。该cDNA编码1个801个氨基酸的多肽,等电点为5.67,推测分子质量为84.86 k D。通过与其他物种的氨基酸多序列比对及系统进化树分析,发现ThVP3氨基酸序列与AtVP2(拟南芥)一致性达88%,属于Ⅱ型VP成员。ThVP3基因有15个跨膜区,并具有高度保守的3个结构域(CS1,CS2,CS3)。相对荧光定量RT-PCR结果表明,ThVP3在高盐及干旱胁迫下均呈现为表达上调,但在各胁迫时间点和不同组织中的表达模式有所差异,0.4 mol/L Na Cl胁迫处理下,地下部分3 h达到最大值后有不同程度的降低,地上部分24 h达到最大值,与地下部分比,地上部分呈现较高的表达量;20%(w/v)PEG 6000胁迫处理下,地下部分在3 h和12 h达到峰值,地上部分表达量逐渐升高,24 h达到最大值后逐渐降低,96 h达到第2个峰值。ThVP3的表达受盐旱胁迫的诱导,推测其可能在柽柳的胁迫应答中起着重要的作用。     

甜菜液泡膜Na~+/H~+逆向转运蛋白BvNHX基因RNAi载体构建及遗传转化

液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白介导的Na+区域化在植物适应盐胁迫中起着重要作用。本研究以甜菜(Beta vulgaris L.)叶片总RNA为模板,采用RT-PCR方法扩增液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因BvNHX的靶片段,以中间载体pHANNIBAL和表达载体pART27为基础,采用酶切和连接的方法,构建CaMV 35S启动子驱动的含BvNHX基因片段反向重复序列的RNAi植物表达载体pARB,通过冻融法将其导入根癌农杆菌GV3101,并转入甜菜幼苗获得BvNHX-RNAi转化株系。半定量RT-PCR分析结果表明该干扰载体能特异性地导致转化植株BvNHX基因表达的沉默。这将为解析BvNHX在甜菜体内Na+区域化中的功能及其在甜菜适应盐渍生境中的作用机制提供帮助。     

过量表达星星草(Puccinellia tenuiflora)液泡型H~+-ATP酶c亚基基因提高转基因酵母的耐盐性

植物液泡型H+-ATP酶(V-ATPase)在次级转运与应对多种逆境胁迫中具有重要作用。本研究克隆并解析了能够生长在盐碱地上的野生星星草V-ATPase c亚基基因(Put VHA-c)的功能。本研究利用荧光蛋白(GFP)标记结合内涵体染色的方法研究了Put VHA-c蛋白在酵母细胞中的定位,并利用转基因酵母分析了Put VHA-c基因在盐胁迫中的作用。共定位实验显示Put VHA-c-GFP融合蛋白主要定位在酵母细胞的内涵体上。Northern杂交和实时定量PCR显示在星星草悬浮细胞中Put VHA-c基因的表达能够被盐胁迫所诱导。研究结果结合过表达Put VHA-c的转基因酵母具有更高的耐盐性的发现,说明Put VHA-c基因参与着盐胁迫的应答。     

过表达马铃薯气孔密度调节因子StEPF1增强拟南芥抗旱性

表皮模式因子1 (epidermal patterning factor 1,EPF1)是气孔发育的负调控因子,对于植物生长发育和环境胁迫响应至关重要.为了明确马铃薯EPF1在气孔发育过程中的功能,本研究从'大西洋'(Atlantic)马铃薯品种中克隆得到气孔密度表皮模式因子StEPF1,并对该基因的表达特性及功能进行...     

甘蔗Na~+/H~+逆转运蛋白基因的克隆与表达分析

Na~+/H~+逆向转运蛋白基因SOS1(salt overly sensitive 1)是植物耐盐性的必需基因之一,在植物抵御盐胁迫过程中发挥十分重要的作用。本研究以小麦EST序列KJ563230为探针,利用电子克隆技术结合RT-PCR,获得一条甘蔗SOS1基因的cDNA序列,命名为ScSOS1(GenBank登录号为KT003285)。序列分析结果表明,该基因全长1403 bp,包含一个1272 bp的开放阅读框,编码423个氨基酸的蛋白质。ScSOS1蛋白的相对分子质量为47.6 kD,理论等电点(pI)为9.12。氨基酸序列分析表明,ScSOS1蛋白具有一个CAP-ED superfamily结构域。生物信息学预测显示,ScSOS1的编码蛋白为亲水性蛋白,不存在信号肽,二级结构元件多为无规则卷曲,主要参与中间代谢。实时荧光定量PCR分析表明,ScSOS1基因的表达具有组织特异性,在甘蔗叶鞘、蔗皮、蔗髓、侧芽和根中均有表达,其中在叶鞘中的表达量最高,根中的表达量最低。此外在NaCl、PEG、ABA、SA和MeJA的胁迫过程中,该基因表达均受到调控,其中受NaCl和PEG诱导后上调表达,均在24 h表达量达最高,分别约为对照组的1.5倍和4.0倍。推测该基因的表达与甘蔗耐盐性和抗渗透胁迫有关。     

马铃薯StNCED1基因过表达载体的构建及其遗传转化

马铃薯块茎的休眠和发芽对于块茎生产和加工极为重要,延长块茎休眠期有助于降低块茎水分和养分的消耗,从而提高其应用价值。本研究用PCR方法从马铃薯中克隆了9-顺式-环氧类胡萝卜素双氧合酶(NCED)编码基因St NCED1,并构建了马铃薯块茎特异表达启动子CIPP驱动的St NCED1基因的植物过表达载体p BIC-St NCED1,然后通过根癌农杆菌介导法转化马铃薯栽培品种"陇薯3号"获得转化植株,经卡那霉素抗性筛选得到5株抗性苗,PCR检测证明St NCED1基因已整合到马铃薯的基因组中。qRT-PCR检测表明St NCED1基因在转基因植株试管薯中的表达量分别比未转基因的对照增加2.10~8.09倍。该研究有助于培育块茎休眠期延长的马铃薯新种质。     

截形叶螨取食对马铃薯酶活性的影响

为明确截形叶螨(Tetranychus truncatus)取食刺激对不同耐旱型马铃薯(Solanum tuberosum)品种酶活性的影响,选择2个马铃薯品种（‘荷兰15号’,早熟,干旱敏感型品种;‘陇薯10号’,晚熟,耐旱型品种）,在人工接螨后,测定7天内马铃薯叶片5种防御酶(CAT、POD、PPO、PAL、LOX)活性的变化。CAT、POD、PPO、PAL、LOX等5种酶活性在受螨害刺激后均表现出不同程度的升高,在时序上都表现为先升高后下降的趋势,且在3天后显著高于CK（未接螨的健康植株）,5种酶均参与了植物机体对害螨的防御反应,以促进受害植株体内自由氧的消减,通过木质素、花青素、生物碱等苯丙素类化合物、氢过氧化物等含量的提高来增强机体防御能力;在螨害7天后,5种酶活性都显著下降,且显著低于CK,说明叶螨在长时间危害后可能导致植株机体紊乱,植株不能很好地持续维持高效的对螨害的防御响应。2个马铃薯品种在叶螨为害后同一时间内,从CAT、PPO和PAL活性变化角度分析,干旱敏感型马铃薯品种表现出较高的抗螨性;被叶螨取食为害后耐旱型马铃薯品种POD活性较高,但干旱敏感型马铃薯品种POD活性增长幅度更大;2个品种在LOX活性上无显著差异。总体分析可得,干旱敏感型马铃薯比耐旱型品种有更高的抗螨性。研究结果可为马铃薯叶螨的科学防治和品种选育提供理论依据。     

超量表达苹果酸脱氢酶基因提高苜蓿对铝毒的耐受性

在酸性土壤中,铝毒是许多作物正常生产的主要限制因子。虽可通过施用生石灰来改良土壤酸碱度,但只能改善土壤表层,在实际应用中受到很大限制。紫花苜蓿作为一种非常重要的牧草、饲料,在酸性土壤条件下苜蓿生长缓慢甚至死亡。我国南方水热资源丰富,但土壤多偏酸性,限制了苜蓿南移。有机酸能螯合铝离子,减轻铝对植物根系的危害。苹果酸是游离铝离子的有效螯合剂,而苹果酸脱氢酶(Malate Dehydrogenase,MDH)催化草酰乙酸形成苹果酸。本研究在苜蓿中超量表达苹果酸脱氢酶基因,通过抗生素筛选、组织化学染色和PCR扩增等技术鉴定出转化植株,并对转化株系进行了耐铝胁迫试验,比较分析了转基因株系与非转基因株系的的相对伸长量,转基因株系根相对伸长量比对照高出3．6％～22．5％。说明超量表达neMDH基因可提高了转基因苜蓿对铝毒的耐受性。     

甘蔗Ca~(2+)/H~+反向运转体基因的克隆与表达分析

CAX(Ca~(2+)/H~+antiporter)是植物细胞膜Ca~(2+)主动运输体系的一个大类。本研究以高粱的CAX1基因(GenBank登录号为XM_002441593)为探针,利用电子克隆并结合RT-PCR技术,获得甘蔗CAX1基因的1条cDNA序列,命名为Sc CAX1(GenBank登录号为KT799799)。生物信息学分析显示,ScCAX1基因全长784 bp,包含1个645 bp的开放阅读框,编码1个214个氨基酸的蛋白质。ScCAX1蛋白被定位于叶绿体类囊体膜,为稳定的疏水性蛋白,不存在信号肽。蛋白二级结构元件多为α-螺旋,具有1个Na_Ca_ex superfamily。实时荧光定量PCR分析表明,甘蔗ScCAX1基因的表达具有组织特异性,在各组织中均表达,但在茎中表达量最低,叶中的表达量最高。在PEG、NaCl、SA、ABA和Me JA胁迫过程中,ScCAX1基因的表达均受到调控。其中ABA、SA和PEG胁迫下表达量上调,均在胁迫24 h达到最大值。SA胁迫24 h的表达量为对照的5.47倍,而ABA胁迫24 h的表达量为对照的3.5倍。NaCl胁迫6 h的表达量达最大值,为对照的2.14倍。推测ScCAX1基因能够响应逆境胁迫,其表达可能与甘蔗的抗盐、抗渗透胁迫性状有关。     

超量表达CsADH17基因提高烟草抗旱性及香气成分分析

乙醇脱氢酶是植物香气物质合成的脂肪酸代谢等途径中的关键酶之一,对茶叶芳香物质的形成有着重要作用,因此探究CsADH17基因有利于茶树的生长发育与品质提升。以本课题组前期筛选的CsADH17基因为研究对象,克隆CsADH17基因并构建植物表达载体,遗传转化烟草,对转基因烟草非生物胁迫下CsADH17的表达量和相关生理指标进行测定与分析。结果表明,对转基因与野生型烟草进行模拟干旱胁迫后,转基因烟草植株在干旱胁迫处理下的CsADH17基因相对表达量比野生型植株高。野生型烟草植株和CsADH17转基因烟草植株在干旱胁迫处理21 d后,超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)和抗坏血酸过氧化物酶(APX)的活性均高于野生型烟草;胁迫处理后,野生型烟草叶片中丙二醛(MDA)含量显著高于转基因烟草。香气成分分析,转基因烟草苯甲醛比野生型含量提高了44.4%,而烟碱含量比野生型提高不到5%。CsADH17基因在烟草干旱胁迫下具有抗旱作用,同时影响烟草的香气成分,为进一步揭示CsADH在茶树生长发育以及抗逆响应中提供参考。     

W6基因的过表达提高转基因烟草的耐盐性

W6基因是由普通小麦地方品种小白麦cDNA文库中克隆获得的ERF类转录因子, 属于ERF IV家族。将W6基因构建在由组成型CaMV35S强启动子控制的双子叶转化载体pBI121上, 通过农杆菌介导法将其转入烟草新华1号。利用RT-PCR技术分析W6基因的过量表达对下游抗性基因表达水平的影响, 并测定高盐胁迫下转基因烟草的SOD酶活性和叶绿素含量。结果显示, 所检测的转基因烟草阳性株中W6基因均有不同程度的表达, 其耐盐性明显提高。W6基因的表达诱导并增强了含有GCC box的PR(pathogenesis-related)基因和含有DRE/CRT元件的COR/RD基因的表达。在高盐胁迫下, 转基因烟草的SOD酶活性和叶绿素含量明显高于对照。W6基因既能诱导抗病相关的PR基因表达又能诱导与提高非生物胁迫能力的COR/RD基因表达, 可能与生物胁迫和非生物胁迫相关, 证实转录因子W6参与了耐盐胁迫相关基因的调节, W6基因的过表达提高了转基因烟草的耐盐性。     

过表达TaJRL53基因提高了小麦赤霉病抗性

Jacalin-related lectins(JRLs)是一种含有Jacalin结构域的植物凝集素,在植物应对生物胁迫和非生物胁迫过程中发挥重要作用。根据其糖结合特性被划分为半乳糖特异性JRL(gJRLs)和甘露糖或葡萄糖特异性JRL(mJRLs)两类。前期研究表明普通小麦TaJRL53编码一个具有Jacalin结构域和Dirigent结构域的蛋白,并能在赤霉菌的诱导下上调表达。由赤霉菌侵染引起的小麦赤霉病是一种毁灭性的病害,它不仅能够导致大幅度减产,而且使感病的麦粒品质下降。受真菌毒素污染的籽粒,严重影响人畜健康。为分析该基因在抗赤霉病方面的作用,本研究利用VIGS系统在小麦中沉默TaJRL53,导致了其对赤霉病的抗性减弱。通过基因枪的方法将该基因的过量表达载体导入到感赤霉病小麦品种中,增强了赤霉病抗性,其病小穗数,病轴长都明显缩短。在赤霉菌侵染后,ROS合成途径相关基因、JA信号通路中的主要标志基因、JA合成基因及病程相关蛋白基因在TaJRL53过量表达的转基因植株中明显高于它们在野生型中的表达量,因此推测TaJRL53提高小麦赤霉病抗性可能跟ROS和JA合成,JA信号转导途径有关。本研究增进了对小麦JRLs家族基因功能的了解,为解析TaJRL53抗赤霉病机制奠定了基础。     

过表达TaJRL53基因提高了小麦赤霉病抗性

小麦——偃麦草杂种夭亡与不孕现象是多式多样的,表现在各个发育时期,概括可分为九种。其产生原因比较复杂,它受亲本遗传特性的制约,又受外界环境条件的影响,也因个体发育的年龄等而有变化。作者认为,采用以下四种方法配合使用,是克服小麦——偃麦草杂种夭亡与不孕的有效方法：1、在选择适合性强的杂交亲本的基础上,     

玉米液泡ATP酶亚基A基因的克隆及表达分析

V-ATPase在植物应对非生物胁迫中起着十分重要的作用, 对其关键亚基基因的克隆及分析有助于阐释其在逆境下的调节及响应机制。本文利用RACE技术从玉米自交系CN165花期水分胁迫下的总RNA中克隆出液泡ATP酶亚基A基因, 命名为ZmVHA-A。该基因cDNA全长2 414 bp, 含5′-UTR(293 bp)、3′-UTR(257 bp)及编码区(1 863 bp), 编码620个氨基酸。序列比对及结构域预测结果表明, ZmVHA-A基因编码的氨基酸序列与亲缘关系比较接近的禾本科作物如水稻、小麦和大麦的氨基酸序列同源性分别达92.7%、89.8%和89.8%, 且在编码蛋白的氨基酸序列上有两个与核苷酸的磷酸基团相互作用的保守结构域“GAFGCGKT”和“PSVNWLISYS”, 可见该亚基是相对保守的。Northern杂交分析结果表明, ZmVHA-A基因在花丝中被水分胁迫诱导表达且在苗期对盐胁迫、冷处理和ABA处理具有不同的表达响应方式, 因此认为VHA-A基因是一个比较保守的功能亚基,并且通过转录表达调节参与了V-ATPase对逆境胁迫的适应。