转大豆GmPRP和SbPRP基因烟草对非生物胁迫耐受能力分析

为实现PRPs基因在植物抗逆基因工程中的应用,将大豆中的2个脯氨酸富集蛋白基因GmPRP和SbPRP构建到植物表达载体pRI101上,通过叶盘法转化烟草。共获得GmPRP阳性转基因烟草2株,SbPRP阳性转基因烟草4株。对转基因烟草植株进行高盐、干旱和低温胁迫处理。结果表明,高盐处理后,SbPRP转基因烟草的脯氨酸含量和可溶性糖含量分别显著和极显著高于野生型,丙二醛含量极显著低于野生型。干旱处理对GmPRP和SbPRP转基因烟草脯氨酸含量、可溶性糖含量和丙二醛含量的影响均不明显。低温处理后,GmPRP和SbPRP转基因烟草的脯氨酸含量均极显著高于野生型,丙二醛含量均低于野生型。由此推测SbPRP可以提高转基因烟草的耐盐性和耐寒性,GmPRP可以提高转基因烟草的耐寒性,为后续SbPRP和GmPRP的应用奠定基础。     

烟草转录因子NtNAC080在非生物胁迫下的表达分析及功能鉴定

NAC作为植物特有的转录因子,广泛参与植物生长发育、衰老及胁迫响应等生物学过程。为探究烟草NtNAC080在非生物胁迫响应中的功能,利用qRT-PCR技术分析了不同胁迫处理下NtNAC080的表达模式,结果表明,NtNAC080的表达受干旱、高盐胁迫以及ABA、MeJA和SA激素的诱导;以NtNAC080基因的敲除突变体及野生型(K326)烟株为材料,分析敲除株系在高盐和干旱胁迫下抗逆表型。试验表明,与野生型相比,2个敲除株系的耐盐抗旱能力均明显增强;干旱和盐胁迫下敲除株系的抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性以及可溶性蛋白、脯氨酸含量显著高于野生型,而丙二醛含量显著低于野生型。相反地,异源表达NtNAC080的转基因拟南芥与野生型(Col-0)相比对盐和干旱的耐受性明显减弱。qRT-PCR分析发现在干旱和盐处理后胁迫相关基因(NtDREB1A、NtKAT2、NtNHX1等)在NtNAC080基因敲除株系中表达水平显著高于野生型。以上结果表明,NtNAC080在烟草的非生物胁迫响应中起负调控作用,这可能是通过调控抗氧化酶活性及胁迫相关基因的表达来实现的。     

低温胁迫转CBF3基因烟草生理生化响应

为研究低温胁迫对转基因烟草的影响,进行了转CBF3基因烟草幼苗及对照(未转基因烟草)在15℃和4℃低温胁迫8h试验,结果表明:可溶性糖、可溶性蛋白、游离脯氨酸、丙二醛(MDA)含量以及过氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)活性均增加,在4℃低温下比15℃下的增加幅度大,转基因烟草的可溶性糖、可溶性蛋白、游离脯氨酸、MDA含量以及POD、SOD活性与对照存在极显著差异(P0.01)。说明转基因烟草幼苗获得了一定的抗寒能力。     

过表达截形苜蓿液泡膜H~+-PPase基因提高马铃薯的抗旱性

本研究以过表达截形苜蓿类型ⅠH~+-焦磷酸酶编码基因MtVP1的转基因马铃薯为材料,对其抗旱性进行了检测。结果显示:(1)在正常生长条件下,与野生型植株相比,两个转基因株系的叶片相对含水量、叶绿素含量、丙二醛含量和超氧化物歧化酶活性差异均不显著,而脯氨酸含量均高于野生型植株,其中OE2株系脯氨酸含量显著高于野生型植株。随着干旱胁迫的持续,两个转基因株系的叶片相对含水量、叶绿素含量的下降趋势平缓,其含量均显著高于野生型对照,且两个转基因株系的脯氨酸含量和SOD活性显著高于野生型对照,而转基因株系的MDA含量显著低于野生型植株。(2)转MtVP1马铃薯表现出表皮毛增多的新表型,茎和叶表面的表皮毛明显比野生型植株多。以上结果表明,Mt VP1基因的过表达提高了马铃薯的渗透调节能力,从而增强了马铃薯的抗旱性;还表明植物类型ⅠH~+-焦磷酸酶基因可能参与调控其他的代谢通路,具有更复杂的生理功能。     

转LEA基因烟草的NaHCO3抗性分析

本研究以转LEA基因烟草7个株系及非转基因对照烟草组培苗为材料,用不同浓度的NaHCO3处理,通过调查转基因烟草和对照烟草的相对电导率、POD活性、SOD活性、碱害指数、生根率等指标的变化,对LEA基因功能在NaHCO3的抗性方面进行初步探索性的研究。结果表明,在非碱胁迫条件下,各转基因株系与对照烟草的相对电导率差异不明显,各株系的相对电导率随着NaHCO3浓度的增加均呈上升趋势,但各转基因株系均小于对照烟草,当NaHCO3浓度在30mmol/L和40mmol/L时,转基因株系之间及转基因株系与对照间的差异达到了显著水平;在给予NaHCO3胁迫后,将各转基因株系各个处理POD活性、SOD活性取平均值后与对照烟草做比较,可以看出,对照烟草的POD活性、SOD活性变化较小,而转基因株系活性上升较为明显,且均在NaHCO3浓度为30mmol/L处达到活性最大值;在不同浓度NaHCO3胁迫下转基因烟草的受害程度明显小于对照;在相同浓度的NaHCO3胁迫下,转基因烟草生根较对照烟草早2￣3d,当NaHCO3浓度为30mmol/L时,转基因烟草碱害指数达到50%左右,且保持有10%￣30%左右生根率,而对照烟草受害程度较大,已经不能生根。综合以上分析结果表明,转基因烟草NaHCO3的耐受临界浓度为30mmol/L。在NaHCO3胁迫下,转基因烟草的碱害程度、膜损伤较对照烟草小,POD、SOD活性及生根率均高于对照烟草,说明LEA基因的导入提高了烟草的NaHCO3抗性。     

准噶尔无叶豆EsDREB2B基因在烟草中的抗逆功能分析

DREB(dehydration responsive element binding protein)转录因子在植物响应非生物胁迫上具有重要作用,是颇具潜力的植物抗逆育种候选基因。本研究旨在通过烟草体系,验证前期从准噶尔无叶豆中克隆的Es DREB2B基因在种子萌发和成苗成长阶段的抗逆功能,并初步探究其调控的下游靶基因。结果表明:转基因株系在干旱、高盐、冷和热胁迫处理下的萌发率都高于野生型烟草,其中盐和热胁迫下萌发率差异尤为显著;两月大转基因烟草与野生型植株进行干旱、高盐、冷和热胁迫处理后,转基因较野生型植株叶片萎蔫,黄化和伤害程度较轻,在热胁迫下差异最为显著;恢复培养后,大多野生型烟草表现为枯死状态,转基因植株则叶片萎蔫减轻并开始生长,并且转基因烟草存活率显著高于野生型,均达到了野生型的3~4倍。ERD10B和Hsp70基因在四种胁迫后的转基因烟草中的表达量均较野生型高,Hsp90在热胁迫下较野生型表达量升高,而Mn SOD,P5CS等基因的表达量变化不显著。以上结果表明,Es DREB2B基因能提高烟草抗干旱、高盐、冷和热胁迫的能力,是具有潜力的抗逆分子育种候选基因。     

转PuP5CS基因烟草对低温胁迫的生理响应

以朝鲜碱茅PuP5CS基因(HQ637435)为目的基因,构建了PuP5CS基因的正义表达载体和反义表达载体,通过农杆菌介导的叶盘法转化烟草,研究了PuP5CS基因对烟草耐寒性的影响。结果显示,低温胁迫下,正义转基因烟草体内可溶性糖、脯氨酸、叶绿素a和叶绿素b的含量均显著高于野生型烟草,丙二醛含量增幅显著低于野生型烟草,提高了转基因烟草的抗寒性,而反义转基因烟草体内各项生理指标变化不明显。     

棉花脂肪酸合成酶基因GhKAR和GhENR表达载体构建及其功能初探

酮脂酰ACP还原酶(β-ketoacyl-(ACP)reductase,KAR)和烯脂酰ACP还原酶(β-enoyl-(ACP)reductase,ENR)是脂肪酸合成过程中2个关键的还原酶,主要负责脂肪酸碳链的延伸。为明确棉花同源基因的功能,克隆了陆地棉Gh KAR和Gh ENR基因,并构建表达载体;应用花粉管通道法转化棉花,经过PCR检测和Southern杂交,筛选出阳性单拷贝植株,分析其后代株系中目的基因对油分含量以及抗寒性的影响。通过对转基因T4株系含油量的测定,发现转基因株系种子的含油量比野生型对照提高10.2%~14.1%,与对照差异极显著。通过气相色谱法分析转基因株系种子的脂肪酸成分,发现不饱和脂肪酸含量比野生型对照增加4.04%~6.02%。测定4℃低温胁迫下各个转基因株系不同时间生理指标的变化,结果表明:转基因株系的相对电导率和脯氨酸含量积累明显高于对照,而丙二醛含量低于对照,在不同胁迫时间与对照表现出显著或极显著差异,过表达的转基因株系的抗寒性有所提高。     

玉米胁迫诱导表达基因ZmSNAC1的功能分析

NAC转录因子是具有多种生物功能的植物特异转录调控因子,在植物生长发育、器官建成、激素调节和抵抗逆境等方面发挥着重要的作用。我们之前分离得到1个受干旱、盐、冷等非生物逆境胁迫和植物激素ABA诱导显著上调表达的玉米NAC家族成员ZmSNAC1,过表达转基因株系在苗期的耐脱水能力较野生型株系明显提高。在此基础上,本研究进一步对ZmSNAC1过表达转基因株系在植株生殖生长发育时期的抗旱性和耐盐性进行功能鉴定。结果表明,在干旱胁迫条件下,野生型株系相比转基因株系较存活率提高50%~52%,相对电导率降低17%~21%,叶绿素含量提高36%~47%,脯氨酸含量提高了17%~23%;在300mmol L^-1 NaCl胁迫条件下,转基因株系的存活率提高36~40%。ZmSNAC1可能作为一个正向调控因子在逆境胁迫信号转导过程中发挥重要作用。     

低温胁迫对转高山离子芥CbPLDα、CbPLDβ基因烟草抗氧化酶系统的影响

为研究高山离子芥Cb PLDα、Cb PLDβ转基因烟草对低温胁迫的生理响应,采用4、0℃低温胁迫,揭示了Cb PLDα、Cb PLDβ基因在植物抵抗低温中的作用。结果表明:随着4℃胁迫时间的延长,野生型烟草和转基因烟草的丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性以及抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性均呈增加趋势,过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)活性则呈先上升后下降趋势。0℃胁迫条件下,野生型烟草和转基因烟草的丙二醛(MDA)含量和过氧化氢酶(CAT)活性以及抗坏血酸过氧化物酶(APX)均先上升后下降,过氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)活性呈增加趋势。Cb PLDα、Cb PLDβ转基因活性烟草的MDA含量显著低于野生型烟草植株,而抗氧化酶活性显著高于野生型烟草对照,且转基因烟草对0℃低温胁迫的响应更积极敏感。Cb PLDα、Cb PLDβ基因的导入提高了烟草幼苗的抗低温能力。     

超量表达CsADH17基因提高烟草抗旱性及香气成分分析

乙醇脱氢酶是植物香气物质合成的脂肪酸代谢等途径中的关键酶之一,对茶叶芳香物质的形成有着重要作用,因此探究CsADH17基因有利于茶树的生长发育与品质提升。以本课题组前期筛选的CsADH17基因为研究对象,克隆CsADH17基因并构建植物表达载体,遗传转化烟草,对转基因烟草非生物胁迫下CsADH17的表达量和相关生理指标进行测定与分析。结果表明,对转基因与野生型烟草进行模拟干旱胁迫后,转基因烟草植株在干旱胁迫处理下的CsADH17基因相对表达量比野生型植株高。野生型烟草植株和CsADH17转基因烟草植株在干旱胁迫处理21 d后,超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)和抗坏血酸过氧化物酶(APX)的活性均高于野生型烟草;胁迫处理后,野生型烟草叶片中丙二醛(MDA)含量显著高于转基因烟草。香气成分分析,转基因烟草苯甲醛比野生型含量提高了44.4%,而烟碱含量比野生型提高不到5%。CsADH17基因在烟草干旱胁迫下具有抗旱作用,同时影响烟草的香气成分,为进一步揭示CsADH在茶树生长发育以及抗逆响应中提供参考。     

马铃薯HD-Zip I家族ATHB12基因的克隆及功能鉴定

HD-Zip I是一类植物特异转录因子, 在植物应对外界逆境胁迫过程中有重要的调控作用。本研究从马铃薯栽培品种甘农薯2号中克隆了HD-Zip I转录因子ATHB12基因, 其开放阅读框为759 bp, 编码252个氨基酸残基。该基因位于马铃薯1号染色体, 其启动子区含有ABRE、LTRECOREATCOR15和WBOXATNPR1等多种响应非生物胁迫(ABA、低温、脱水及高盐)的顺式作用元件。ATHB12基因在马铃薯根、茎和叶中均有表达, 其根中表达量最高。qRT-PCR分析证实该基因的表达受聚乙二醇(PEG)、NaCl和ABA诱导, 受低温抑制。构建了由组成型表达启动子CaMV 35S驱动的ATHB12基因的过表达载体, 通过农杆菌介导法转化马铃薯获得了转基因植株。干旱处理后, 转基因植株叶片中丙二醛含量显著低于非转基因植株(P<0.05), 而脯氨酸含量显著高于非转基因植株(P<0.05); 转基因植株根鲜重和干重均高于非转基因植株; 说明马铃薯ATHB12基因可能参与了逆境胁迫的响应。     

马铃薯HD-Zip Ⅰ家族ATHB12基因的克隆及功能鉴定

HD-Zip I是一类植物特异转录因子,在植物应对外界逆境胁迫过程中有重要的调控作用。本研究从马铃薯栽培品种甘农薯2号中克隆了HD-Zip I转录因子ATHB12基因,其开放阅读框为759 bp,编码252个氨基酸残基。该基因位于马铃薯第1染色体,其启动子区含有ABRE、LTRECOREATCOR15和WBOXATNPR1等多种响应非生物胁迫(ABA、低温、脱水和高盐)的顺式作用元件。ATHB12基因在马铃薯根、茎和叶中均有表达,其根中表达量最高。q RT-PCR分析证实该基因的表达受聚乙二醇(PEG)、Na Cl和ABA诱导,受低温抑制。构建了由组成型表达启动子Ca MV 35S驱动的ATHB12基因的过表达载体,通过农杆菌介导法转化马铃薯获得了转基因植株。干旱处理后,转基因植株叶片中丙二醛含量显著低于非转基因植株(P0.05),而脯氨酸含量显著高于非转基因植株(P0.05);转基因植株根鲜重和干重均高于非转基因植株;说明马铃薯ATHB12基因可能参与了逆境胁迫的响应。     

马铃薯StMAPK4响应低温胁迫的功能解析

马铃薯易受低温危害,造成减产。MAPK基因广泛参与多种环境胁迫,研究发现其参与低温调控。为探究马铃薯StMAPK4在响应低温胁迫过程中的功能,本研究以马铃薯栽培品种‘Atlantic’为试验材料,分析其在低温(4℃)胁迫下不同时间点在马铃薯根茎叶中的表达特性,并对StMAPK4基因进行生物信息学分析及对其编码的蛋白进行亚细胞定位分析,构建StMAPK4的过表达和RNAi干扰表达载体,转化马铃薯获得转基因植株,并分析了在4℃处理下非转基因(NT)、过表达和RNAi干扰表达转基因植株的超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)活性、脯氨酸(Pro)和丙二醛(MDA)含量的变化。结果显示,StMAPK4蛋白的等电点为4.97,属于酸性蛋白,该蛋白定位于细胞核和细胞膜;低温胁迫下,StMAPK4在根茎叶中的表达量显著升高;StMAPK4过表达植株的SOD、POD活性和脯氨酸含量较NT植株明显升高,而MDA含量明显降低;StMAPK4干扰表达植株的SOD、POD活性和脯氨酸含量较NT植株明显降低,而MDA含量明显升高;通过表型观察发现,非转基因和RNAi干扰表达植株的叶片萎蔫严重,而过表达植株的叶片受影响较小。因此,过表达StMAPK4基因可以增强马铃薯植株对低温胁迫的耐受性。     

马铃薯StMAPK4响应低温胁迫的功能解析

马铃薯易受低温危害,造成减产。MAPK基因广泛参与多种环境胁迫,研究发现其参与低温调控。为探究马铃薯StMAPK4在响应低温胁迫过程中的功能,本研究以马铃薯栽培品种‘Atlantic’为试验材料,分析其在低温(4℃)胁迫下不同时间点在马铃薯根茎叶中的表达特性,并对StMAPK4基因进行生物信息学分析及对其编码的蛋白进行亚细胞定位分析,构建StMAPK4的过表达和RNAi干扰表达载体,转化马铃薯获得转基因植株,并分析了在4℃处理下非转基因(NT)、过表达和RNAi干扰表达转基因植株的超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)活性、脯氨酸(Pro)和丙二醛(MDA)含量的变化。结果显示,StMAPK4蛋白的等电点为4.97,属于酸性蛋白,该蛋白定位于细胞核和细胞膜;低温胁迫下,StMAPK4在根茎叶中的表达量显著升高;StMAPK4过表达植株的SOD、POD活性和脯氨酸含量较NT植株明显升高,而MDA含量明显降低;StMAPK4干扰表达植株的SOD、POD活性和脯氨酸含量较NT植株明显降低,而MDA含量明显升高;通过表型观察发现,非转基因和RNAi干扰表达植株的叶片萎蔫严重,而过表达植株的叶片受影响较小。因此,过表达StMAPK4基因可以增强马铃薯植株对低温胁迫的耐受性。     

海岛棉GbMFT2基因能提高烟草的耐盐能力

MOTHER OF FT AND TFL1(MFT)属于磷脂酰乙醇胺结合蛋白(phosphatidyl ethanolamine-binding protein,PEBP)家族,该家族在被子植物中主要起着促进或抑制开花和控制株型的作用。本课题组前期从海岛棉(Gossypium barbadense)中克隆了一个MFT-like同源基因GbMFT2,发现其在种子中表达量较高,并且受ABA诱导。为了进一步探究该基因的功能,本研究首先检测了200 mmol/L Na Cl胁迫海岛棉0、1 h、3 h、6 h、12 h后基因的表达量,表明在盐诱导1 h GbMFT2基因的表达量最高。然后构建了过量表达载体p35S:GbMFT2,并通过农杆菌介导的叶盘法将其转化到普通烟草(Nicotiana tabacum cv.NC89)中,半定量RT-PCR表明GbMFT2基因在烟草中异位表达成功。利用0、100 mmol/L、200 mmol/L、300 mmol/L、400 mmol/L和500 mmol/L Na Cl胁迫不同的转基因株系,表明转基因烟草比野生型烟草更耐盐。再分别测量300 mmol/L Na Cl处理前后的野生型烟草和转基因烟草的脯氨酸含量、POD活性,发现处理后的野生型烟草的脯氨酸含量、POD活性均明显降低,而转基因烟草株系中的脯氨酸含量、POD活性均有明显的提升。研究结果表明,GbMFT2基因能够响应盐胁迫,并增加烟草的耐盐性。本研究可为研究植物MFT-like基因的功能提供了新思路,也为进一步解析棉花发育基因的功能提供了研究基础。     

Atfad8叶绿体转基因烟草对冷胁迫的生理响应

摘 要：采用5℃低温处理,研究Atfad8叶绿体转基因烟草对冷胁迫的生理响应。结果表明:随着低温胁迫时间的延长,烟草幼苗的丙二醛(MDA)含量和过氧化物酶(POD)活性呈增加趋势,超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性先上升后下降。 Atfad8叶绿体转基因烟草的MDA含量明显低于对照植株,而抗氧化酶活性明显高于对照植株。Atfad8基因的导入提高了烟草幼苗的耐冷害能力。     

转GHABF4转录因子棉花植株的耐盐性研究

AREB/ABFs转录因子家族基因主要参与干旱、高盐、低温等胁迫应答反应。为了获得具有较高耐盐水平的棉花新种质材料,通过农杆菌介导法将耐盐转录因子基因(GHABF4)导入陆地棉中棉35中,通过对转化植株的卡那霉素初步筛选及T1、T2、T3目的基因PCR的分子检测,获得T3转基因棉花纯合系。通过盐胁迫试验对5个T3转基因棉花株系和非转基因棉花对照进行耐盐性分析。结果表明,在200 mmol/L Na Cl胁迫下,与非转基因对照相比,5个转基因棉花株系株高提高2.5~4.4 cm,地上部分的鲜质量增加3.6%~11.8%;且抗氧化物酶SOD、POD、CAT活性以及叶绿素含量提高。在盐胁迫条件下,转GHABF4基因棉花表现出优良的生长和生理优势,转GHABF4基因能够提高棉花的抗盐能力。     

amiRNA技术沉默C-3氧化酶编码基因StCPD对马铃薯抗旱性的影响

CPD (constitutive photomorphogenesis and dwarf)基因编码C-3氧化酶, 为油菜素内酯(brassinosteroid, BR)生物合成途径中的限速酶, 在植物响应逆境胁迫过程中具重要调控作用。本研究利用人工microRNA (artificial microRNA, amiRNA)技术, 构建马铃薯CPD基因(StCPD)的干扰表达载体pCPB121-amiRcpd, 通过根癌农杆菌介导法将其转入马铃薯栽培品种“紫花白”, 获得转基因植株(Ci1~Ci5), 其中Ci1和Ci3的StCPD基因干扰程度分别为78%和90%。基因组织表达特异性分析表明, StCPD在马铃薯试管苗叶片中表达量最高, 是茎和根中表达量的3.05倍和1.65倍。转基因植株株高、茎粗、根长、鲜重及薯的大小和鲜重等指标均较非转基因(NT)植株显著下降, 表明StCPD基因干扰表达后, 植株的长势明显受到抑制。模拟干旱胁迫处理下, 转基因植株叶片中丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量显著高于NT植株, 而脯氨酸含量显著低于NT植株。转基因和NT马铃薯中, StCPD基因的表达量、MDA和脯氨酸含量均显著高于对照; 且随着胁迫处理时间延长, 基因表达量呈持续增强趋势, MDA和脯氨酸含量随之增加。结果表明, StCPD基因干扰表达能明显降低马铃薯对干旱胁迫的抵抗能力, 为进一步研究BR对马铃薯生长发育和对干旱胁迫的响应奠定了基础。     

转GhMAPK基因烟草植株的获得及其耐盐性分析

促丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPKs)是普遍存在于真核生物中的一类保守的丝氨酸/苏氨酸类蛋白激酶,在植物生长发育和多种生物、非生物胁迫信号转导过程中起着关键作用.GhMAPK是首个在棉花(Gossypium hirsutum)中克隆的MAPK基因,为了进一步研究其功能,本研究利用农杆菌介导法将GhMAPK转入本氏烟草,Northern杂交和Western杂交分析证实,在转基因植株中GhMAPK能够高效表达.烟草耐盐性分析显示,在高盐胁迫下,转基因植株种子萌发率高于野生型烟草,苗期转基因株系能正常生长;进一步试验证明,转基因植株中的抗氧化酶(POD、SOD)活性也有明显提高.这些结果表明,GhMAPK过表达的转基因植株可以通过有效清除活性氧来提高植物对盐胁迫的抗性,GhMAPK可能参与了植物高盐胁迫信号传递过程.