郁金香碎色病毒RT-PCR检测方法的建立

郁金香病毒病的发生可导致郁金香切花及鳞茎品质下降,严重制约郁金香产业的发展。因此,建立快速、准确的郁金香病毒检测体系是减少病毒对郁金香的危害、恢复种性的关键问题。本研究选取对郁金香危害最严重的郁金香碎色病毒(TBV)作为研究对象,分别选取了8个感染TBV的郁金香感病植株和健康植株为材料,基于TBV核酸序列设计了21对特异引物组合,建立RT-PCR病毒检测体系,并将该检测体系用筛选出的特异性引物在8个材料中进行了验证。结果表明,共有10对引物组合可从带有TBV的感病植株中扩增出目的条带,序列结果与GenBank中登录的TBV序列同源性达90%以上,该检测体系稳定、可靠,特异性引物组合有广泛的适用性。     

红芽芋茎尖低温疗法脱毒的RT-PCR检测

为了了解红芽芋茎尖低温疗法再生苗的脱毒情况,本研究对其进行芋花叶病毒(DsMV)、黄瓜花叶病毒(CMV)和芋羽状斑驳病毒(TFMoV)的RT-PCR检测。大田苗均检出芋花叶病毒(DsMV)和黄瓜花叶病毒(CMV);对于芋花叶病毒(DsMV),玻璃化法低温疗法脱毒率为50%,包埋玻璃化法低温疗法脱毒率为100%,包埋脱水法低温疗法脱毒率为50%,小滴玻璃化法低温疗法脱毒率为75%,茎尖常规培养脱毒率为75%,说明包埋玻璃化法低温疗法有利于脱除芋花叶病毒;对于黄瓜花叶病毒(CMV),玻璃化法低温疗法脱毒率和包埋玻璃化法低温疗法脱毒率均为100%,包埋脱水法低温疗法脱毒率为75%,小滴玻璃化法低温疗法脱毒率为75%,茎尖常规培养脱毒率为50%,说明4种低温疗法脱毒均有利于脱除黄瓜花叶病毒,但玻璃化法低温疗法和包埋玻璃化法低温疗法两种脱毒方式效果更佳。4种低温疗法再生苗、茎尖常规培养再生苗和大田苗中均未检出芋羽状斑驳病毒(TFMoV)。究其原因,可能采用的引物为甘薯羽状斑驳病毒引物,而甘薯和芋头是不同物种,可能病毒序列不一样,且NCBI基因库里没有FMo V的任何信息,完全没有参考序列设计引物,还有待于进一步研究。本实验可为红芽芋脱毒苗的规模化生产提供一定技术基础和理论依据。     

郁金香种球退化的原因及防治

问:怎样才能避免和防止郁金香品种退化? 刘福林答:造成郁金香种球退化的原因较多,主要有: 1、病毒病这是造成郁金香种球退化的主要原因之一。常见危害郁金香的有碎色病毒和花叶病毒两种。受碎色病毒侵染的植株花     

银川、徐州和赤峰地区番茄病毒病种类的鉴定

对2021年发生在银川、徐州、赤峰的番茄叶片出现黄绿相间的斑驳、叶片皱缩卷曲、植株矮化等疑似番茄病毒病的症状进行了鉴定。利用12种番茄病毒病的特异性引物进行RT-PCR检测，发现所检测的不同地区样品中，侵染番茄最多的病毒为黄瓜花叶病毒（CMV），检出率为60.00%，其次是番茄斑萎病毒（TSWV），检出率为46.67%。通过核苷酸序列比对发现，检测出的这2种病毒与CMV(AJ131619.1)和TSWV(MK318839.1)同源性最高，相似度分别为97%和99%。同时，基于CMV和TSWV基因序列构建系统发育树表明，宁夏银川地区番茄病毒样本为CMV和TSWV复合侵染。     

山东葫芦科蔬菜上病毒病种类检测及黄瓜花叶病毒分离物的亚组鉴定

为了检测和鉴定山东地区葫芦科蔬菜上病毒病种类,从山东诸地11个蔬菜种植区采集了867个葫芦科蔬菜疑似感病样品。利用黄瓜花叶病毒、黄瓜绿斑驳花叶病毒、西瓜花叶病毒、烟草花叶病毒、小西葫芦黄花叶病毒、南瓜花叶病毒、甜瓜黄斑病毒、瓜类褪绿黄化病毒、李属坏死环斑病毒及甜瓜坏死斑点病毒等特异性引物对疑似感病样品分别进行RT-PCR检测,各病毒检出率分别为34.8%,10.4%,20.0%,41.7%,27.0%,7.8%,2.6%,1.7%,0,0.9%。表明除PNRSV外,其他9种病毒在山东各地均有发生,且CMV和TMV发病率较高,2种或2种以上病毒复合侵染也很普遍。同时为明确山东地区CMV分离物的株系分化状况,选取11个地区有代表性的CMV阳性样品,测定其外壳蛋白(Coat protein,CP)和RNA3核苷酸序列并进行序列比对和进化分析,结果显示侵染山东地区葫芦科蔬菜的CMV分离物均属于IB亚组,与韩国分离物As(AF013291)相似性最高,未发现其他株系。     

应用RNA沉默技术获取抗黄瓜花叶病毒(CMV)和烟草花叶病毒(TMV)转基因烟草

RNA沉默是迄今最为有效的抗病毒策略,利用该策略不但能获得免疫转基因植株,且所得植株不易与其他病毒基因重组或异源包壳、生物安全性较高。将本实验室已构建的携带有烟草花叶病毒(TMV)部分移动蛋白基因(ΔMP)和黄瓜花叶病毒(CMV)部分复制酶基因(ΔRep)反向重复结构的植物表达载体pBIN438-MP-Rep(i/r),用农杆菌浸润法转化普通烟草品种K326,共得196株转化植株,经卡那霉素筛选和PCR检测发现128株为阳性转基因株;PCR-Southern和RT-PCR分析表明外源基因已整合到烟草基因组并在转录水平上得到表达;ELISA结果显示20.3%的转基因植株对CMV和TMV复合侵染表现免疫性。本结果为利用RNA沉默技术进行植物抗多种病毒育种提供重要数据,为防治其他多种病毒复合侵染提供借鉴。     

三种无花果病毒的多重RT-PCR检测

为了快速检测危害无花果的病毒种类,本研究建立了一种同时检测3种无花果病毒的多重RT-PCR检测体系,包括无花果斑点相关病毒(fig fleck-associated virus, FFkaV)、无花果叶斑相关病毒(fig leaf mottleassociated virus, FLMaV)和无花果花叶病毒(fig mosaic virus, FMV)。根据三种病毒基因保守区域设计特异性引物,分别对cDNA用量、dNTPs用量、EasyPfu DNA聚合酶用量、Mg SO4用量、退火温度和引物组合进行优化,并利用RT-PCR进行验证。结果显示,总体积为25μL的反应体系中EasyPfu DNA聚合酶(2.5 U/μL)用量0.7μL、cDNA用量1.0μL、dNTPs (2.5 mmol/L)用量2.5μL、Mg SO4(50 mmol/L)用量1.2μL、引物组合为1.5μL,1.0μL,0.3μL、ddH2O为14μL、退火温度56℃时能够扩增出清晰的目的条带,该检测体系的检测极限为6.8 ng/μL的cDNA。田间样品的检测结果表明,该方法能够快速、准确地检测这3种无花果病毒,可用于田间无花果样品的检测。本研究建立的多重RT-PCR检测体系为无花果病毒的检测与防控提供技术支持。     

利用RT-PCR对黄瓜病毒病毒原种类进行检测

根据黄瓜花叶病毒(CMV)的复制酶序列和西瓜花叶病毒2号(WMV-2)、烟草花叶病毒(TMV)、黄瓜绿斑花叶病毒(CGMMV)的外壳蛋白基因序列以及南瓜花叶病毒(SQMV)的运动蛋白序列设计、合成引物,以感病组织和健康组织总RNA为模板,进行cDNA合成和PCR扩增。对2002～2003年采集的98份黄瓜病毒病样本进行了检测,结果表明,天津地区黄瓜主要毒原种类有CMV,WMV-2和TMV,感染率分别为样本数的96．94％,77．55％和38．67％,CMV和WMV-2 2种病毒的复合感染率为76．53％,3种病毒的复合感染率达到14．67％。     

基因芯片技术检测黄瓜花叶病毒、烟草花叶病毒和马铃薯Y病毒

黄瓜花叶病毒、烟草花叶病毒和马铃薯Y病毒是世界性分布的重要植物病毒,对农业生产危害较大.农作物感病多为复合侵染,症状表现较为复杂,急需建立快速、准确、能够一次检测多种病毒的检测方法.本研究根据3种病毒的外壳蛋白基因序列,设计引物和探针,制备基因芯片;用Cy3标记下游引物,RT-PCR扩增产物与芯片杂交,荧光扫描仪检测并...     

辣椒三种病毒的多重RT-PCR同步检测

本研究根据辣椒轻斑驳病毒(PMMo V)、烟草花叶病毒(TMV)和黄瓜花叶病毒(CMV)的外壳蛋白(CP)编码序列设计了3对PCR检测引物,并初步建立了同步检测以上3种辣椒病毒的多重RT-PCR方法。以被感染了3种病毒的叶片的总RNA作为模板,可同时扩增到324 bp(TMV)、220 bp(PMMo V)和112 bp(CMV)的3个目标条带,在电泳图上清晰可辨。测序结果表明所扩增产物确为待检病毒靶序列。除阳性对照外,该多重RT-PCR体系不对ORSV、PVX和PVY等同属或不同属的其它病毒发生反应;该体系可检测到104倍稀释的病毒c DNA模板。同时,以建立的三重RT-PCR法对10份田间辣椒病样进行检测,其结果与单重RT-PCR结果一致,说明该法检测结果可靠,可用于PMMo V、TMV和CMV 3种辣椒病毒的同步检测。     

侵染南瓜的西瓜花叶病毒和黄瓜花叶病毒CP基因的克隆和序列分析

采用RT-PCR的方法,用马铃薯Y病毒属病毒3′-末端序列的简并引物和黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus, CMV）外壳蛋白（CP）基因的特异引物,对采自山东聊城的一表现花叶、黄化、蕨叶及果实畸形的南瓜样品进行了检测,同时扩增到了西瓜花叶病毒（Watermelon mosaic virus, WMV）和CMV 2种病毒的基因组片段,说明该样品受到WMV和CMV 2种病毒的复合侵染。这2个病毒分离物分别被命名为WMV-liaocheng和CMV-liaocheng。序列测定及分析结果表明,它们与其它相应病毒分离物CP基因核苷酸序列的同源性分别为91.2-98.0%和77.0-97.9%,推导的氨基酸序列同源性分别为96.4-98.5%和81.2-99.1%。根据完整CP 基因核苷酸序列构建的系统进化树显示：18个WMV分离物可分为3组,其中WMV-liaocheng 与HLJ、CHN及Habenaria等分离物表现出较近的亲缘关系,形成Ⅲ组;30个CMV分为两个亚组,其中CMV-liaocheng属于亚组I,CMV-liaocheng可能发生过重组。     

甜瓜种子中黄瓜花叶病毒和小西葫芦黄花叶病毒的RT-LAMP可视化检测方法

本研究旨在针对甜瓜种子中携带的黄瓜花叶病毒(CMV)和小西葫芦黄花叶病毒(ZYMV),建立可视化环介导等温扩增检测方法。根据CMV和ZYMV外壳蛋白(CP)基因的保守序列,分别设计并筛选出2套特异性环介导等温扩增(LAMP)引物,通过对反应体系中主要影响因素的优化,建立适用于快速检测CMV和ZYMV的RT-LAMP检测方法。对优化后的2种LAMP检测方法进行特异性和灵敏度验证。结果表明,建立的2种LAMP检测方法分别能够特异性地检测出CMV和ZYMV,检测灵敏度较常规RT-PCR分别高出10倍和100倍,并且可通过肉眼观察直接对反应结果进行判定。该方法的建立为基层及现场快速检测甜瓜种子的带毒情况提供了新方法。     

乌头花叶病病原物的分子鉴定

研究旨在通过逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）从分子方面鉴定附子地道产区四川江油乌头花叶病植株的病原物种类及分析其特性。通过对黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus, CMV）的外壳蛋白基因(Coat Protein,CP)设计特异引物,对江油中坝附子GAP生产基地的乌头花叶病植株进行克隆、转化并测序。结果表明：从江油花叶病乌头植株中克隆得到基因大小为375 bp的片段,鉴定为黄瓜花叶病毒,命名为CMV-FZ,该序列为一段有效的长为375 nt的氨基酸编码区,推测编码125个氨基酸残基。依据外壳蛋白核苷酸序列建立了CMV不同分离物的系统进化树并对该序列进行蛋白组学分析,CMV-FZ与国内外已报道代表性CMV亚组分离物CP基因的核苷酸与氨基酸的序列相似性为74.8%~98.2%和73.4%~99.2%,其中与与CMV亚组II的核苷酸和氨基酸序列相似性为96.1%-98.2%和96.0%-99.2%,该分离物与中国分离物（CMV-PCT2）氨基酸序列相似性最高,达到99.2%。遗传进化分析显示,CMV-FZ与中国分离物（Zin和Hubei-1）和美国分离物（DKRD）亲缘关系较近,聚在同一分支,属于CMV亚组II。以上结果表明伴有花叶症状的乌头受到黄瓜花叶病毒的侵染。     

湖北省蔬菜病毒病主要毒原种类基本明确

<正>华中农业大学植物科学技术学院和江阴苏利化学股份有限公司研究人员采用斑点酶联免疫吸附法(DotELISA)和RT-PCR法,对2013～2014年采自湖北省7个地区的966份疑似感染病毒的蔬菜样本进行了黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)、烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,     

甜瓜中一种由蚜虫传播的花叶病毒新抗源

病毒病是造成甜瓜(Cucumis milo L.)严重产量损失的主要病害。侵害南瓜作物的病毒有50多种，其中黄瓜花叶病毒(CMV)、两瓜花叶病毒(WMV)、小西葫芦黄色花叶病毒(ZYMV)和番木瓜环斑病毒-W(PRSV—W)是甜瓜作物中最流行的病毒。培育抗性品种是防治病毒的最佳方法。1998年Lecoq等人     

作物病虫害分类介绍及其防治图谱——黄瓜病毒病及其防治图谱

<正>黄瓜病毒病又叫黄瓜花叶病,在各蔬菜产区均有发生,是黄瓜生产中极其重要的一种常见性病害,在黄瓜生长过程中可单独或复合侵染引起危害。不同年份以及不同地区之间发生程度有所差异,春季保护地栽培和秋季露地栽培黄瓜发生较重,病株率达30%以上,对黄瓜产量和品质均有明显影响。发病原因:黄瓜病毒病主要由颗粒状的黄瓜花叶病毒(图1)、甜瓜花叶病毒和杆状RNA类的烟草花叶病毒(图2)等三种病毒引起。黄瓜花叶病毒有很宽的寄主范围,可侵染1000多种双子叶和单子叶植物。甜瓜     

草石蚕的茎尖分生组织培养和脱病毒系的应用价值

草石蚕(Stachys sieboldii Miq.)是我国的特产蔬菜之一.病毒侵染是引起草石蚕种性退化的主要原因.经血清学和电镜鉴定,北京地区的草石蚕至少受到三种病毒感染,即苜蓿花叶病毒(AMV)、烟草花叶病毒(TMV)和另一种不知名的长线条形病毒.为了恢复草石蚕原有的种性,采用茎尖分生组织培养技术成功地获得了脱病毒植株.用试管苗茎段扦插法离体快速繁殖优良脱毒母株,理论上年繁殖率可达5,000万倍以上.离体贮存试验表明,可将脱毒母株在23±2℃的培养室内离体保存8—9个月.1985年小面积试种结果:脱毒系每公顷产31.15吨,块茎单重4.16克,分别比罹毒母系增加1.7倍和1.2倍.块茎营养分析表明,脱毒系粗蛋白含量达21.62%,较罹病毒系高39.57%,氨基酸总含量平均增加30%以上.本文最后还讨论了草石蚕组培脱毒技术的应用问题.     

作物病虫害分类介绍及其防治图谱——白菜软腐病及其防治图谱

<正>白菜病毒病又称"孤丁病"、"抽风病",与霜霉病、软腐病并称大白菜三大病害,一般流行年份可造成10%左右的产量损失,部分重发年份可减产30%以上,严重地区甚至绝收,严重影响大白菜的产量和质量。发病原因:白菜病毒病可由线条状的芜青花叶病毒(图1)、球状的黄瓜花叶病毒(CMV、图2)和杆状RNA的烟草花叶病毒(TMV、图3)等多种病毒引起。这些病毒可在白菜、甘蓝、萝卜等采种植株上越冬,也可在宿根作     

马铃薯脱毒种薯（苗）病毒检测技术研究进展

马铃薯系无性繁殖作物,易受病毒侵染而造成植株体内病毒积累,导致种性退化,品质和产量下降.本文主要介绍了常见马铃薯病毒病类型的种类表现、传播途径,脱毒种薯(苗)的检测方法及其应用,讨论了三类检测方法的优缺点,并对RT-PCR检测方法进行了美好展望.     

冬瓜SSR-PCR体系优化及引物筛选

本研究利用L16(54)正交试验设计研究了影响冬瓜SSR-PCR的五个因子(10×Buffer(含Mg2+),d NTP,DNA,引物,r Taq),研究结果表明Buffer(含Mg2+)和r Taq对PCR影响最明显,最终筛选出最佳反应体系:10×Buffer 2.0μL(1×Buffer),d NTP 2.0μL(200μmol/μL),DNA 0.6μL(6 ng/μL),引物0.4μL(0.2μmol/L)。体系体积为20μL,循环数为35。引物筛选程序为:94℃预变性3 min,94℃变性45 s,58℃~68℃复性30 s,5个循环,每个循环退火温度降2℃,72℃延伸1 min,94℃变性30 s,50℃~58℃复性1 min,8个循环,每个循环退火温度降低1℃,72℃延伸1 min,94℃变性30 s,50℃复性30 s,72℃延伸1 min,共30个循环,72℃延伸7 min。本研究建立了适合冬瓜的SSR反应体系和引物多态性筛选程序。