水稻OsGLYI11.2基因启动子的克隆及表达分析

启动子对基因时空表达的调控具有关键作用。本研究利用PCR克隆了一个水稻乙二醛酶(Glyoxalase)基因Os GLYI11.2的启动子区域片段(GenBank:AB017042.1),利用PlantCARE对该片段进行了顺式作用元件分析;构建了pOsGLYI11.2∷GUS表达载体并通过农杆菌介导转入水稻中,通过检测转基因植株中GUS基因在不同器官中的表达,分析了启动子的表达调控模式。结果显示：该启动子含有调控基因表达的7类调控顺式元件,能驱动GUS基因在水稻不同组织中(胚,胚芽鞘,花)表达。说明本研究所克隆的OsGLYI11.2基因上游2 120 bp的DNA片段具有启动子活性,能够驱动报告基因的表达。本研究结果可为进一步研究OsGLYI11.2基因在水稻中的功能及其相关调控机制提供基础。     

白桦4CL基因启动子克隆及表达分析

为研究4-香豆酸辅酶A连接酶基因(4CL)在白桦木质素合成代谢过程中的组织特异性表达,利用染色体步移法克隆其启动子,用该启动子定向置换pBI121载体的35S启动子,构建重组载体P_(4CL)::GUS。利用瞬时转化法将重组载体转入白桦实生苗茎后进行GUS染色。结果显示:获得了4CL基因编码区起始密码子上游长1344 bp的启动子序列,该启动子除分布有TATA-box、CAAT-box等基本的转录起始元件外,还存在多个顺式作用元件序列位点,包括35S启动子作用元件ASF,参与脱落酸响应的顺式作用元件ABRE,参与茉莉酸甲酯响应的顺式调控元件CGTCA-motif,以及光反应元件G-Box、ACE、4CL-CMA2b等;启动子表达分析结果显示经过瞬时侵染的白桦茎段被染成蓝色。以上结果表明克隆获得的4CL基因启动子具有启动子表达活性,其可能参与了白桦木质部的发育。     

茉莉花MK基因及启动子克隆与表达分析

甲羟戊酸激酶在植物萜类化合物合成中具有重要作用。本研究以茉莉花转录组测序数据为基础,利用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,从双瓣茉莉花中获得甲羟戊酸激酶(mevalonate kinase,MK)基因,命名为JsMK(GenBank登录号为MH311040)。测序结果显示JsMK全长cDNA为1608 bp,包含开放阅读框(ORF)1164 bp,编码387个氨基酸。生物信息学分析结果表明该基因编码的蛋白可能定位于细胞质中,为非亲水性稳定蛋白,含有与其他MK蛋白所共有的3个保守区,以及GHMP家族特有的N端保守区和C端保守区。Blast比对和系统进化树分析结果表明,JsMK蛋白与野生油橄榄、长春花等多种植物的MK蛋白同源性较高。采用染色体步移技术(Genenome walking technique)扩增MK基因5’端上游调控序列,获得709 bp启动子序列,PlantCare分析表明该序列含有大量基本顺式作用元件TATAbox、CAATbox,还存在生长素(IAA)、茉莉酸甲酯(MeJA)、脱落酸(ABA)等激素响应激素及多个光响应顺式调控元件。利用实时荧光定量PCR检测Js MK在IAA、MeJA、ABA处理下的表达水平。结果表明,JsMK同时受IAA、MeJA及ABA不同程度的诱导表达,其中MeJA对其诱导最明显。本研究通过从茉莉花中克隆并分析JsMK基因及其启动子序列,为进一步研究JsMK基因在萜类合成调控的功能提供科学依据。     

水稻新基因OsCPSF7启动子克隆及其时空表达特性分析

CPSF(cleavage and polyadenylation specificity factor),真核细胞mRNA3'端前体加工中起主导作用的蛋白因子。然而迄今对植物和水稻CPSF家族基因及其表达调控元件的克隆和功能的研究还不多。本研究克隆了水稻中一个未知功能基因OsCPSF7的上游2 330 bp启动子区域,构建植物融合表达载体pOsCPSF7:GUS,并获得了转基因水稻植株。组织化学染色结果表明,OsCPSF7基因启动子具有表达活性,可驱动GUS报告基因,在转基因水稻植株不同发育时期的叶枕、叶舌、茎间、小穗及种子柱头基部、胚和胚乳的连接部位均有强烈的表达。结果表明OsCPSF7基因启动子可能参与调控信号转导、逆境应答以及水稻生长和发育。该研究结果为进一步研究水稻OsCPSF7基因启动子的功能及其相关调控机制奠定了基础。     

荔枝GRX基因启动子的克隆与瞬时表达分析

为了研究荔枝GRX基因的调控机理,本研究利用PCR的方法克隆了该基因上游1 996 bp的启动子片段并对其功能进行了初步分析,结果表明:荔枝GRX基因启动子序列中含有大量的TATA-box和CAAT-box保守元件,以及ARE、HSE、MBS、TC-rich repeats、TGA-element等各种转录调控相关的顺式作用元件。基因枪表达分析表明,该启动子能驱动GUS基因在荔枝的花、叶、根、果皮以及果核中表达而在果肉中不表达,具有组织特异性。为进一步研究荔枝GRX基因的表达模式和调控机理提供了基础与依据。     

甘蓝型油菜BnaFIL基因启动子的克隆与表达分析

为了进一步了解启动子在甘蓝型油菜FIL基因(BnaFIL)表达调控中的作用,根据甘蓝型油菜基因组数据,以甘蓝型油菜叶片提取的DNA为模板,对甘蓝型油菜BnaFIL基因的启动子序列pBnaFIL进行克隆,长度为1 326 bp。采用PlantCARE在线分析软件对该启动子序列进行生物信息学序列分析,结果表明,该序列含有参与光反应的部分保守DNA模块以及CAAT-box和TATA-box等核心启动子必备元件,与分生组织表达有关的顺式作用的调控元件CAT-box以及光敏反应元件。通过该启动子序列替换pBI121植物表达载体上的CaMV35S启动子,使该启动子与GUS基因融合获得pBnaFIL-GUS表达载体,将载体通过农杆菌花序浸染的方法转入拟南芥中,获得了早花启动子重组质粒阳性转基因株系和晚花启动子重组质粒阳性转基因株系。之后对转基因拟南芥植株进行GUS染色分析,对启动子的表达效果进行了检测,最终在不同的转基因拟南芥植株中均发现了GUS基因的表达。结果表明,早花材料与晚花材料中启动子表达强弱存在差异,早花材料启动子的驱动基因表达效果比晚花材料启动子的驱动效果要好,由此推断,启动子的驱动效果...     

水稻OsAAA1基因启动子的分离与克隆

水稻稻瘟病抗性新基因OsAAA1是一种诱导型的广谱抗病基因,但OsAAA1的表达模式及调控机理未知。为了研究OsAAA1的表达模式及调控机理,通过对OsAAA1启动子序列的生物信息学分析,克隆了3个OsAAA1启动子区域的缺失体,将上述缺失体转入植物双元表达载体DX2181G中。通过菌落PCR、质粒PCR检测和质粒DNA酶切鉴定并测序确认,结果表明以上3个启动子系列缺失载体构建成功。为进一步研究OsAAA1启动子的表达模式及该基因的调控机理提供了参考依据。     

文心兰生物钟基因OnELF3启动子克隆与表达分析

为了解文心兰生物钟基因OnELF3的转录调控,本研究采用TAIL-PCR技术从文心兰基因组中克隆到OnELF3基因起始密码子上游2 204 bp的启动子序列。使用BDGP、PlantCARE和PLACE在线软件对OnELF3基因启动子的转录起始位点与顺式作用元件进行预测。结果表明启动子序列除包含TATA-box和CAAT-box等启动子基本元件外,还包含组织特异性元件、光调控元件、植物激素响应元件、胁迫反应响应元件和昼夜节律调控元件等。为探究OnELF3启动子的表达活性,构建pCAMBIA1301-p OnELF3p:GUS载体,利用农杆菌介导法,转化烟草与拟南芥。烟草叶片瞬时转化表明克隆的OnELF3启动子序列具有启动子活性。转化拟南芥结果表明,OnELF3启动子能够驱动下游的GUS基因在T2代拟南芥中稳定表达,GUS组织染色显示该启动子呈现发育与组织特异性表达。这些结果为进一步研究文心兰OnELF3基因的转录表达调控与相关功能分析提供基础。     

水稻金属硫蛋白基因(MT2bL)启动子的克隆与表达分析

金属硫蛋白(metallothionein,MT)富含半胱氨酸,而且能够结合多种金属离子,调控细胞内金属代谢的平衡。本研究根据水稻在减数分裂期、开花期和开花后5 d的基因芯片数据结果,从水稻品种黎榆B(O.sativa L.ssp.japonica C.V.Liyu B)基因组中克隆得到了一个植物MT-2类基因Metallothionein2b-Like(Os MT2b L)的启动子序列,序列全长2 063 bp。利用植物启动子区域顺式作用元件数据库(PLACE)分析表明该启动子序列含有5个CURE(copper-response element)元件(GTAC)以及多个其它顺式作用元件。构建了多个启动子融合表达载体(p Ca MV35S::GUS,p MT2b L::GUS,p Ubi1::GUS,p CYC::GUS和p ACT1::GUS),并通过根癌农杆菌介导转化水稻愈伤组织获得了转基因植株。GUS组织染色结果分析表明,Os MT2b L基因启动子在水稻幼苗期的胚根、胚芽和胚芽鞘中具有高水平的GUS表达活性,特别是在胚根根尖和胚芽顶端的GUS表达活性较高;在减数分裂期的植株叶片、颖壳和开花10 d后的未成熟种子中GUS表达活性也较高;GUS蛋白荧光定量分析结果表明,Os MT2b L基因启动子在水稻叶片中驱动GUS基因表达的活性比Ca MV35S基因启动子高出3倍以上。     

水稻胆碱单加氧酶基因的克隆与表达分析

高等植物中甜菜碱由胆碱经两步氧化反应合成,其中由胆碱单加氧酶(CMO)催化第一步氧化反应,甜菜碱醛脱氢酶(BADH)催化第二步氧化反应.采用生物信息学技术和RT-PCR的方法从水稻幼苗组织中分离得到了水稻CMO基因的cDNA克隆,将其命名为OsCMO.该基因含有10个外显子和9个内含子,其开放阅读框编码一条长为410个氨基酸残基的多肽,与拟南芥、山菠菜、苋、碱蓬和甜菜等植物的胆碱单加氧酶的氨基酸序列的一致性50%～62%.mRNA分析表明OsCMO基因在水稻幼苗组织中的表达受高盐、低温和干旱等胁迫的上调诱导表达,表明该基因可能在抵御非生物胁迫中发挥重要作用.     

地被菊CmGATA8基因及启动子克隆与表达分析

地被菊花色艳丽、花型整齐、花香清新淡雅,但在东北地区很多地被菊品种不能越冬.本试验以地被菊'YINGJIE'为材料,克隆CmGATA8,全长为1 152 bp,最大开放阅读框(ORF) 951 bp,编码317个氨基酸,包含一个GATA结构域;CmGATA8分子量为34.75 ku,等电点为6.07,不稳定系数为59....     

甜荞FaesFUL4基因的克隆与表达分析

本研究采用同源克隆的方法,从甜荞(Fagopyrum esculentum Moench.)品种‘北早生’中分离出调控果实发育的FaesFUL4基因,该基因的cDNA序列全长795 bp,包含一个长为714 bp完整的开放阅读框,共编码237个氨基酸和1个终止密码子。分子系统发生分析和同源蛋白比对结果显示:FaesFUL4蛋白属于A类MADS-box基因家族AP1/SQUA亚家族的euFUL进化系,含有MADS、I、K和C末端四个明显的结构域,且C末端转录激活区含有2个保守的模体(Motif):FUL motif和paleoAP1 motif。基因表达的组织特异性分析表明:FaesFUL4基因主要在甜荞叶片、花序和果实中表达,在根和茎中有微量表达,其在花序中的相对表达量最高。进一步分析基因在果实不同发育时期的表达量发现,其在果实迅速膨大期表达量最高。因此推测该基因不但参与调控花器官的发育过程,且对于维持果实的正常发育具有重要作用。     

甘蓝型油菜BnLPAT4启动子的克隆及表达分析

植物溶血磷脂酸酰基转移酶(lysophospholipid acid acyltansferase,LPAT)是在植物不同组织中调控溶血磷脂酸生成各种磷脂酸的代谢流的关键酶。本研究采用同源克隆的方法,从甘蓝型油菜湘油15中克隆BnLPAT4基因翻译起始位点上游的调控序列,长度为1 326 bp。Plantcare在线分析表明:该序列含有CAAT-box和TATA-box等核心启动子原件,同时还有多个光响应元件、逆境胁迫响应元件、激素应答元件等。将该启动子与GUS基因融合,构建pBnLPAT4:GUS植物表达载体,通过农杆菌介导法获得拟南芥T3代转基因株系。GUS组织化学染色显示,幼苗期的转基因拟南芥在叶和根部均具有GUS活性,成熟期在莲座叶、花瓣、花萼、花托及果荚中表达,而花药及种子中未检测到GUS活性。     

醋栗番茄NHX4基因及其启动子序列的克隆与分析

本研究在醋栗番茄基因组鸟枪序列的基础上,基于同源序列的保守性,克隆了醋栗番茄液泡膜Na~+/H~+逆向转运蛋白4基因(SpNHX4)的cDNA序列,对其响应盐胁迫的表达模式进行了分析。通过染色体步行法克隆了该基因的启动子区域,并通过生物学软件对该基因编码的蛋白和启动子序列进行分析。结果显示,SpNHX4的c DNA序列包含1 611 bp的开放阅读框,编码536个氨基酸。SpNHX4多肽链中疏水性氨基酸占多数,具有12个明显的跨膜结构区,符合跨膜蛋白的特征。荧光定量PCR结果显示,在NaCl胁迫条件下,SpNHX4在醋栗番茄根、茎和叶中的表达均上调,其中在叶中的表达量变化最为显著。通过PlantCARE软件对SpNHX4上游1 857 bp的启动子序列进行顺式元件预测,发现该启动子区域包含番茄典型的TATA-box"TTTTA"序列和CAAT-box转录增强子序列"CCAAT"。此外,还存在多个与激素、逆境、光诱导相关的元件。这些结果为进一步研究SpNHX4的功能和转录调控机制提供资料。     

柽柳GRAS转录因子基因启动子克隆和表达分析

克隆获得柽柳GRAS 转录因子基因启动子序列,并对其表达模式进行分析,从而初步探究GRAS转录因子基因的表达特征和功能。CTAB法提取刚毛柽柳基因组DNA,按照Genome Walking Kit 说明克隆GRAS 转录因子基因启动子序列,将克隆获得的GRAS 转录因子基因启动子序列定向替换pCAMB1301 载体上的35S启动子序列,构建融合表达载体,以驱动GUS 基因表达,瞬时侵染拟南芥后进行GUS 基因的染色。成功克隆获得刚毛柽柳936 bp 的GRAS 转录因子基因启动子序列。PLACE 和PlantCARE 数据库分析结果表明该启动子不仅包含启动子区的核心元件CAAT-box 和TATA-box,还含有多个与逆境应答有关的顺式调控元件。成功将GRAS 基因启动子序列定向置换pCAMBIA1301 的35S 启动子,构建重组载体PGRAS::GUS。瞬时转化拟南芥后GUS 染色,结果显示转基因拟南芥叶片被染色而根部着色较浅。初步表明克隆获得的GRAS 基因启动子具有启动子表达活性,其可能参与了柽柳的抗逆应答,为进一步分析该基因的抗逆功能和抗逆机制奠定了基础。     

水稻26kDa球蛋白基因启动子克隆及序列分析

以水稻品种日本晴基因组总DNA为模板,采用PCR扩增获得约900bp大小的DNA片段,回收该片段并与pUCm-T载体连接,转化感受态大肠杆菌.进行PCR检测和酶切鉴定,选取阳性克隆进行测序分析.测序结果显示,该片段含904个核苷酸对;采用vector NTI软件将本试验中克隆的序列与Genbank（AY427575）公布的日本晴球蛋白基因启动子序列比对,有9个核苷酸差异,同源性为99%,证实本试验中克隆的DNA序列为水稻球蛋白基因启动子;在重要功能区段上,两者核苷酸序列完全一致.本研究认为造成长期不在一个环境中种植的同一水稻品种球蛋白基因启动子序列差异的原因之一,可能是核苷酸中性突变.水稻球蛋白基因启动子的成功克隆,为今后开展水稻等重要农作物转基因研究奠定基础.     

小叶杨TMM基因启动子克隆及表达模式分析

气孔作为植物与外界进行气体交换的通道,对植物自身的生长发育至关重要。研究表明植物TMM蛋白与植物气孔的形成发育密切相关。本研究利用PCR技术克隆了小叶杨(Populus simonii Carr.)TMM基因5’端上游的调控序列pPsTMM,长度为2336 bp。生物信息学分析结果表明:小叶杨启动子pPsTMM除了含有TATA-box、CAAT-box等核心启动子元件之外,还含有多种光响应元件、植物激素响应元件、抗逆胁迫相关元件以及生理代谢和生长发育相关元件等,说明转录活性还可能受到光、植物激素、逆境胁迫等因素诱导。利用双酶切法构建植物表达载体pBI121-pPsTMM-GUS,叶盘法稳定遗传转化烟草,GUS化学组织染色显示GUS主要集中在叶芽起始发育部位表达,说明pPsTMM启动活性具有组织特异性。对非生物胁迫的转基因烟草进行GUS化学染色以及进行荧光定量PCR,结果显示pPsTMM对不同因素的非生物胁迫响应程度存在差异性,干旱和盐胁迫下启动活性很低,高温和低温对其调控作用也不明显,但对外在施加的植物激素(GA,NAA,ABA)和水杨酸(SA)响应程度很高,说明pPsTMM启动子对物理因素的响应值要远低于化学因素的诱导。本研究为进一步阐明TMM蛋白表达模式与小叶杨气孔发育特性及抗旱性之间的分子机制提供理论基础。     

GmCYP78A5基因启动子的克隆及表达分析

利用PCR技术从大豆(Glycine max L.Merrill)中分离了细胞色素P450基因(cytochrome P450,CYP-78A5)的启动子,序列分析结果表明,扩增片段大小为1 650 bp,与已报道序列的相应区域同源性达99.21%。RT-PCR结果表明,CYP78A5基因在大豆不同组织中的表达存在差异,在未成熟种子中表达水平较高,在茎(上胚轴与下胚轴)中有微弱表达,而在根、叶、花组织中不表达。将该启动子片段与GUS报告基因融合在一起,构建了植物表达载体,并用农杆菌介导法导入了烟草(Nicotiana tabacum)中。对转基因烟草植株中的GUS表达分析表明,Gm CYP78A5启动子可驱动GUS报告基因在转基因烟草的幼苗根上部组织、花器官的花萼和花柄组织及种子中高效表达,而在其他部位均未检测GUS活性。     

蔗糖合酶基因启动子克隆及其转基因水稻植物中特异性表达

以水稻品种"明恢63"基因组DNA为模板, 用PCR方法克隆出水稻蔗糖合酶基因起始密码子以前(包括第一内含子)的上游序列RSP1及其不包括第一内含子的上游调控序列RSP2. 测序结果显示, 在重要的功能区段上, 克隆的序列与Wang(1992)等的报道基本一致. 构建了由RSP1和RSP2驱动报告基因Gus的植物表达载体, 并用于农杆菌介导法水稻遗传