小麦miR164及其靶基因NAC的克隆与表达载体构建

miRNA对植物的生长发育及逆境适应起到重要的调控作用。为探究miR164基因的功能及其参与胁迫的响应机制,我们首先检测了小麦miR164及其靶基因NAC2D在受到内质网胁迫后表达水平的变化,并通过克隆miR164及NAC家族的几个基因(NAC6A,NAC2D,NAC8,NAC1),分别构建其表达载体。分析表明:miR164与NAC2D在受到内质网胁迫诱导剂二硫苏糖醇(DTT)处理后,miR164上调表达,NAC2D下调表达,而经内质网胁迫缓解剂熊去氧胆酸(UDCA)处理后,两基因表达水平变化呈现出相反的趋势,表明miR164可能参与小麦幼苗内质网胁迫响应的调控。进而我们对NAC家族的几个基因分别进行克隆,并成功构建了它们的植物表达载体,为进一步探索miR164的功能及其调控机制提供了重要基础。     

多抗马铃薯病毒及类病毒的amiRNA双元表达载体的构建及遗传转化

马铃薯病毒及类病毒病害严重影响了中国马铃薯的生产。为了培育抗病毒及类病毒的马铃薯新材料,本研究采用人工miRNA(artificial microRNA,amiRNA)策略,以马铃薯X病毒(potato virus X,PVX)与马铃薯Y病毒(potato virus Y,PVY)编码沉默抑制子P25蛋白和HC-pro蛋白的基因为靶标,利用5'RACE技术对P25基因、HC-Pro基因潜在的剪切热点进行预测。再采用overlapping PCR技术,以拟南芥mi R159a前体为骨架,设计特异性引物,构建分别靶向P25和HC-Pro基因的amiRNA表达载体。同时构建靶向马铃薯内源基因Virp1的amiRNA表达载体,将构建完成的三个amiRNA表达载体串联获得amiRNAs三联体,分别转入根癌农杆菌菌株EHA105,并用农杆菌介导法转化马铃薯品种克新13。经PCR鉴定,结果表明,目的基因片段已成功转入马铃薯中。     

鹰嘴豆miR164基因家族的生物信息学分析及靶基因预测

miR164是植物特有的一类miRNA,参与调控植物的生长发育和对逆境胁迫的响应.为深入理解Car-miR164的功能和调控机制,本研究通过全基因组手段鉴定鹰嘴豆Car-mmiR164家族成员并预测靶基因功能,在PmiREN中获得Car-miR164家族5个成员的序列,通过染色体定位技术表明其位于鹰嘴豆Ca3、Ca4和...     

辽宁绒山羊皮肤毛囊mir-1298-5p靶基因预测及表达载体构建

探讨辽宁绒山羊皮肤毛囊不同发育时期mir-1298-5p的调控作用及其与靶基因的潜在关系,为mir-1298-5p与其靶基因对皮肤毛囊发育作用提供理论依据。以辽宁绒山羊皮肤毛囊组织为材料,通过miRNA的分离、表达、靶基因预测筛选及靶位点3'UTR表达载体构建,采用RT-PCR进行表达检测,在线靶基因预测软件预测mir-1298-5p的靶基因,并对其靶基因TGF-βR1的靶位点进行克隆测序、缺失突变。结果表明：靶基因预测发现TGF-β R1的3'UTR存在mir-1298-5p种子区结合位点,且mir-1298-5p及其靶基因TGF-β R1均在皮肤毛囊不同发育时期呈现差异性表达。mir-1298-5p对皮肤毛囊周期性发育可能起到一定的调控作用,并成功构建了TGF-βR1 3'UTR表达载体,为后期过表达转染体系的建立和功能基因的验证奠定了基础。     

马铃薯晚疫病菌应答WRKY基因的结构功能预测与植物表达载体构建

WRKY是一类广泛参与高等植物各种抗逆调控活动的转录因子,可以通过激活下游相关信号转导途径调节自身的应激反应,进而增强植物抗逆性。本研究通过RNA-Seq从马铃薯(Solanum tuberosum)中筛选出一个晚疫病菌诱导WRKY转录因子基因StWRKY。采用RT-PCR技术获得该基因CDS全长,并对其进行序列分析及结构功能预测。根据StWRKY蛋白序列进行同源性搜索,得到与其蛋白序列相似度较高的其他物种的蛋白序列,使用MEGA7软件对St WRKY蛋白序列及其同源序列进行多序列比对分析并构建了系统进化树。利用在线工具ProtParam对StWRKY进行氨基酸理化性质分析;利用SMART在线工具进行蛋白序列分析;利用SWISS-MODEL在线工具和PredictProtein在线平台分别对StWRKY蛋白二级结构和三级结构进行分析。结果表明,StWRKY核苷酸序列CDS全长为957 bp,编码含318个氨基酸的蛋白质,预测蛋白分子量为36.17 k D,等电点为6.49。既不是分泌蛋白也不是膜蛋白,未发现跨膜区、信号肽和复合螺旋区。StWRKY三维空间结构主要由无规卷曲以及β-折叠组成。通过XcmⅠ酶切、连接将StWRKY装载到pCXSN载体上,构建了该基因的超表达载体pCXSN-StWRKY。StWRKY基因的克隆,为进一步从分子水平上验证其抗晚疫病的生物学功能以及揭示马铃薯生物胁迫抗逆机制奠定基础,并为马铃薯抗病育种提供新的基因资源。     

鹰嘴豆miRNA中miR156家族的生物信息学分析及靶基因预测

为了揭示鹰嘴豆Car-miR156基因家族的进化过程和表达模式,对Car-miR156家族8个成员的序列进行生物信息学分析及靶基因预测。染色体定位结果表明7个Car-miR156基因定位在鹰嘴豆Ca4、Ca5、Ca6和Ca7四条染色体上,而Car-miR156g定位在scaffold1580上。序列比对发现8个Car-miR156基因的成熟序列具有高度一致性,仅在5'端第1、14和15个碱基存在差异。二级结构分析结果表明,8个Car-miR156成员的前体序列都能形成稳定的茎环结构,Car-miR156h成熟的miRNA序列位于3'端,Car-miR156a/b/c/d/e/f/g成熟的miRNA序列位于5'端。此外,Car-miR156a/d/f/g与大豆的miR156家族成员亲缘关系较近,Car-miR156e与拟南芥Ath-miR156j聚在一个分支,而Car-miR156b单独为一个分支。靶基因预测表明SQUAMOSA启动子结合蛋白家族成员(SPL2/3/6/7/9/13A)是Car-miR156的靶基因,Car-miR156a/c/d/e/f/g/h还能够靶向调控大刍草颖片架构1类基因。转录组数据分析表明,Car-miR156a/c/d/f在鹰嘴豆8个组织中都有表达,Car-miR156b在根中不表达,Car-miR156e在茎和花中不表达。这些研究结果为研究鹰嘴豆Car-miR156家族成员的表达及其靶基因的功能提供了基础。     

杨树响应细菌性溃疡病菌侵染的miRNA靶基因预测及分析

欧美杨细菌性溃疡病是由Lonsdalea quercina subsp.Populi引起的枝干病害,给杨树的生长和生存带来极大危害.miRNA是植物响应逆境胁迫的重要调控分子,为鉴定杨树中响应欧美杨细菌性溃疡病菌侵染的miRNA靶基因,以期为林木抗病分子育种提供新的候选基因,本研究以miRBase数据库中杨树全部miR...     

马铃薯质体表达载体构建及GFP基因在块茎中的瞬时表达

利用高等植物质体基因组在进化中高度保守的特点, 根据烟草质体基因组全序列设计合成引物, PCR扩增并克隆了马铃薯质体的trnI-trnA基因片段。将测序正确的trnI基因和trnA基因作为定点整合外源基因的同源重组片段, 构建成包含Prrn-gfp-aadA-TpsbA表达盒的马铃薯质体定点转化载体pBMLSIA-GFP, 酶切鉴定表明, 所构建载体符合预期设计。采用该载体对马铃薯块茎进行基因枪法转化, 结果表明, GFP基因可在质体特异性启动子Prrn及终止子TpsbA的调控下在马铃薯块茎中瞬时高量表达, 经基因枪轰击后马铃薯块茎在紫外投射仪下产生很强的绿色荧光, 在距离为6 cm, 压力1 100 psi轰击2枪的条件下产生的绿色荧光最强。马铃薯块茎可溶性蛋白SDS-PAGE电泳分析表明, GFP蛋白表达量约占总可溶性蛋白的15.4%~30.2%, 均达到了较高的表达水平。该载体对后期马铃薯质体转化体系的建立和其他功能基因导入马铃薯质体进行性状改良具有重要应用价值。     

马铃薯StNCED1基因过表达载体的构建及其遗传转化

马铃薯块茎的休眠和发芽对于块茎生产和加工极为重要,延长块茎休眠期有助于降低块茎水分和养分的消耗,从而提高其应用价值。本研究用PCR方法从马铃薯中克隆了9-顺式-环氧类胡萝卜素双氧合酶(NCED)编码基因St NCED1,并构建了马铃薯块茎特异表达启动子CIPP驱动的St NCED1基因的植物过表达载体p BIC-St NCED1,然后通过根癌农杆菌介导法转化马铃薯栽培品种"陇薯3号"获得转化植株,经卡那霉素抗性筛选得到5株抗性苗,PCR检测证明St NCED1基因已整合到马铃薯的基因组中。qRT-PCR检测表明St NCED1基因在转基因植株试管薯中的表达量分别比未转基因的对照增加2.10~8.09倍。该研究有助于培育块茎休眠期延长的马铃薯新种质。     

绿色荧光蛋白基因银耳表达载体构建及表达

以银耳芽孢为材料,由载体pEGFP、pCAMBIA1300经过Hind III和EcoRⅠ双酶切、连接、转化,重组质粒酶切验证,笔者成功构建了由双孢蘑菇gpd启动子调控EGFP基因的银耳真核表达载体,命名pCB-BEGFP。采用电击转化法将携带EGFP基因的银耳表达载体pCB-BEGFP转化到银耳芽孢。提取4个转化子基因组DNA,用EGFP基因特异引物 PCR扩增,电泳结果表明有与EGFP基因大小一致的特异带出现;荧光显微镜观察在再生培养基上的转化子可看到很强的绿光;其中一个转化子蛋白SDS-PAGE电泳,结果发现在大约27kD处有一明显的蛋白条带出现,与预期的蛋白分子量相近。以上结果证明EGFP基因转入银耳芽孢中,双孢蘑菇启动子可以调控外源基因的在银耳芽孢中正确表达。     

马铃薯miR159的克隆及人工表达载体构建

MicroRNAs(miRNAs)是一类非编码小分子RNA,是体内重要的内源性基因调节因子,主要是在转录后水平调控靶基因的表达。本研究是通过人工microRNA技术(artificial microRNA,简称amiRNA),与PCR技术克隆得到了701 bp的miR159片段,然后将获得的miR159片段通过双酶切后链接到植物表达载体p CPB121,构建了马铃薯amiR159表达载体。经PCR和酶切分析鉴定,确认载体构建成功。为后期通过马铃薯的遗传转化研究miR159/MYB的调控模式提供了帮助。     

马铃薯小热激蛋白基因sHSP-F的克隆及植物表达载体的构建

热激蛋白(heat shock proteins,HSP)是生物体在不利环境条件因素刺激下应激合成的一组在进化上高度保守的蛋白质。前期转录组测序的结果发现马铃薯Favorita的小热激蛋白(small heat shock proteins,s HSPs)基因(PGSC0003DMG400009255)在接种晚疫病菌(Phytophthora infestans)24 h后表达量显著上调。因此,以马铃薯Favorita为材料,根据PGSC0003DMG400009255基因序列设计引物,并在引物5'端加上Bam HⅠ和SalⅠ酶切位点,从接种P.infestans 24小时后的Favorita的RNA中通过RT-PCR的方法获得PGSC0003DMG400009255的基因片段,并命名为s HSP-F,该基因最大开放阅读框(ORF)为594 bp,编码197个氨基酸。通过酶切连接将s HSP-F连接至表达载体p CAMBIA1301中。通过测序和酶切验证,表明s HSP-F基因成功克隆到表达载体中,该工作为进一步研究该基因的功能提供了基础。     

苋菜AmPCS基因的克隆及表达载体构建

合成植物络合素(PCs)是高等植物减轻重金属毒害的重要机制。通过对镉超积累苋菜品种天星米植物络合素合成酶基因(PCS)的克隆及表达载体构建,旨在为植物修复镉污染土壤奠定基础。依据同源克隆原理,通过RT-PCR和RACE方法克隆苋菜PCS基因。序列分析表明:苋菜PCS基因cDNA全长1 770 bp,包含完整的阅读框,编码485个氨基酸;苋菜PCs合成酶与拟南芥、遏蓝菜、芥菜及油菜PCs合成酶相似性为91.96%～95.67%,其氨基酸序列N端有1个Pfam:Phytochelatin结构域(功能为催化合成植物络合素)、C端有1个Pfam:Phytochelatin_C结构域(功能为重金属离子感应器)。因此,推断苋菜PCS基因编码蛋白是PCS-like家族的新成员,具有催化合成植物络合素的功能,将它在GenBank注册,序列号为:JN979370,命名为AmPCS。在AmPCS基因的编码区加入BamH I和Sac I酶切位点,双酶切植物表达载体pBI-121和带有酶切位点的PCR产物,成功获得苋菜PCS基因正义表达载体pBI-PCS。     

金花茶CnLCYE基因cDNA克隆及表达载体构建

利用RT-PCR和RACE技术,从珍稀观赏植物金花茶(Camellia nitidissima)花瓣中克隆得到了一个番茄红素ε-环化酶(lycopeneε-cyclase,LCYE)基因c DNA全长,命名为CnLCYE。碱基序列分析显示,CnLCYE基因全长2 149 bp,包含291 bp的5'非翻译区(untranslated regions,UTR)、265 bp的3'UTR和1 593 bp编码530个氨基酸的开放阅读框。该基因编码的蛋白质含有2个跨膜结构域,一个NADB_Rossmann superfamily结构域以及番茄红素ε-环化酶结构域(PLN02697)。CnLCYE蛋白二级结构以无规则卷曲为主,其次为α-螺旋,β-折叠所占比例最少。氨基酸序列比对分析结果显示,CnLCYE与茄科、蔷薇科等植物LCYE蛋白同源性都在70%以上,与普洱茶(Camellia sinensis var.assamica)LCYE同源性最高。根据该CnLCYE全长序列设计带有KpnⅠ和Bam HⅠ位点的全长扩增引物扩增基因全长,用KpnⅠ和Bam HⅠ双酶切后与表达载体p CAMBIA1300连接,成功构建了CnLCYE基因的正义表达载体,为深入研究CnLCYE基因的功能及其对花色的调控作用提供了帮助。     

脐橙CsCAB基因的克隆及表达载体构建

从脐橙果皮褐变相关基因的cDNA抑制差减文库中,获得了一个CAB基因家族的同源EST序列,通过快速扩增cDNA末端(RACE)方法成功克隆得到984bp的CsCAB全长基因(GenBank登录号EF010854)。序列分析结果表明,CsCAB包含一个621bp的开放阅读框(ORF),编码207个氨基酸;CsCAB蛋白与钙结合蛋白具有很高的同源性,且具有钙结合蛋白的保守结构域EF-hand。并构建了脐橙CsCAB基因的正、反义植物表达载体pCAMBIA1301-CABs和pCAMBIA1301-CABas,为该基因的功能研究奠定了基础。     

马铃薯RPP13基因RNAi载体的构建及遗传转化

RPP13是一种能够通过识别病原物效应子诱发植物免疫反应的典型R基因。植物病毒学实验室前期对马铃薯纺锤块茎类病毒(PSTVd)所侵染的5个马铃薯品种进行了转录组测序分析,发现RPP13基因在5个马铃薯品种中均上调。为了研究该基因在马铃薯中是否与PSTVd抗性相关,应用DNAMAN 8.0软件对转录组测序所得到的RPP13上调基因序列进行序列比对分析,选取其共同的保守区域作为沉默对象,构建了以该保守区域为臂,马铃薯体细胞胚发生激酶类似受体基因(SERK1)(登录号为EF175216)内含子为环的茎环结构反向重复序列RNAi载体pROKⅡ-RPP13,通过冻融法将pROKⅡ-RPP13载体转入农杆菌LBA4404中,应用农杆菌介导的马铃薯遗传转化方法转化马铃薯品种民丰红,以苗龄28 d的健康马铃薯叶片为材料,经过预培养2 d、农杆菌浸染10 min、黑暗条件下共培养2 d,应用抗性筛选培养基诱导生根、生芽,将再生植株进行PCR检测,筛选得到3株阳性转基因植株;以马铃薯的ef1a基因作为内参基因,利用实时荧光定量PCR技术检测马铃薯转化植株中RPP13基因的表达量。结果表明：所获得的3株转基...     

葡萄糖氧化酶基因植物表达载体的构建

为进一步开展转基因研究创造条件,用限制性内切酶将葡萄糖氧化酶(GOD)基因从pMD/GO载体上切下,定向连接到植物表达载体pROKⅡ的CaMV35S启动子下游和NOS终止子上游,成功地构建了GOD基因植物表达载体pROK/GO。利用冻融法将此表达载体导入根癌农杆菌LBA4404中,提取转化质粒,经PCR和酶切鉴定表明,GOD基因植物表达双元载体构建成功。     

油茶SAD基因原核表达载体构建

为研究油茶种子SAD基因的预期功能,以报道的油茶SAD的CDS为模板设计引物,RT-PCR及TA克隆获得含有酶切位点的CDS片段。经过PCR及测序验证序列的正确性后,将PCR扩增产物双酶切后与同样经双酶切的原核表达载体pET30a连接,转化BL21（DE3）菌株。菌液PCR所得条带与预期一致,对于重组质粒的双酶切后两类产物电泳的条带分布符合经验分布规律。多种鉴定结果表明已成功构建适宜于原核表达用的重组载体。