茄子开花相关基因SmFT的克隆和表达分析

在光周期途径中,FT基因是决定植物开花时间的重要基因。本研究利用同源克隆的方法从"YZ-14"紫茄品种中分离克隆得到了FT基因,命名为Sm FT。序列分析表明,Sm FT基因的c DNA全长691 bp,开放阅读框为528 bp,编码176个氨基酸,与同科作物马铃薯中FT基因序列的相似性高达92%,与番茄中FT基因序列的相似性也能达到91%。成熟蛋白等电点为5.20,分子量为43.79 k D,荧光定量检测结果表明,Sm FT基因在紫茄的根、茎、叶、花瓣、果皮和果肉中均有表达,但表达水平具有组织特异性,其中,Sm FT基因在茎、叶和花中表达量较高,这可能与FT发挥作用的位置有关。本研究可为深入研究茄子的光周期反应机制提供了理论基础。     

黄灯笼辣椒CcCAD1基因的克隆与植物表达载体的构建

肉桂醇脱氢酶(cinnamyl alcohol dehydrogenase, CAD)在木质素生物合成中有着重要作用,为了探讨辣椒中CAD基因在木质素合成中的作用,本研究利用RT-PCR方法从黄灯笼辣椒幼嫩叶片中克隆得到CAD1基因全长cDNA,命名为CcCAD1。序列分析表明,CcCAD1 cDNA序列全长1 074 bp,编码357个氨基酸。同源比对显示其与番茄CAD1蛋白的一致性高达96.09%。荧光定量PCR检测结果显示,CcCAD1基因在辣椒根、茎、叶、胎座和果肉中的表达量差异显著,其相对表达量为叶果肉茎根胎座。利用Bam HⅠ和SacⅠ双酶切连接成功构建pBI121-CcCAD1植物表达载体,为CcCAD1基因转化以及后续的功能分析提供依据。     

玉米光周期敏感类Hd6基因的克隆和实时定量表达分析

水稻Hd6基因在调节水稻光周期敏感中起重要作用。本研究以热带玉米自交系CML288为材料, 利用同源基因克隆法结合3¢RACE技术克隆了与水稻Hd6基因同源的玉米类Hd6基因。该基因序列中999 bp的开放阅读框可编码332个氨基酸。BLAST分析发现, 该基因与玉米中编码蛋白激酶CK2的一个基因高度同源, 所推测的氨基酸序列包含2个CK2活性区域, 1个N末端区域, 1个ATP结合位点和1个丝氨酸/ 苏氨酸蛋白质激酶活性位点,与玉米、小麦、水稻和拟南芥的CK2氨基酸序列也有较高的同源性。建立了SYBR GREEN法实时荧光定量RT-PCR表达分析系统, 研究了不同光周期处理下类Hd6基因在光周期敏感自交系CML288茎尖和叶片中的表达。结果发现, 该基因在茎尖和叶片中均有表达。在短日条件下, 该基因在6~8叶期茎尖中的表达量存在明显差异, 在光周期敏感的7叶期出现表达高峰, 在叶片中的表达量均低于茎尖。在长日条件下, 该基因在茎尖中6叶期表达量较低, 在光周期敏感的9叶期在叶片中高量表达。由此可推测, 该基因与玉米光周期敏感密切相关, 可能在光周期敏感调节过程中发挥一定的作用。     

新疆哈密瓜AT2基因的克隆及初步功能验证

本研究利用RT-PCR技术从抗霜霉病哈密瓜(Cucumis melo L.)品种MR-1中克隆到AT2基因,其整编码区为1 229 bp,编码401个氨基酸,同源比对结果为99%,将其编码的丝氨酸乙醛酸转氨酶蛋白序列与多种物种进行系统进化树分析,结果显示,甜瓜与黄瓜SGT蛋白同源性较高,遗传距离最近,推测在同属中该蛋白进化相对保守。在线分析表明SGT蛋白不含信号肽及跨膜区,即该蛋白为非跨膜蛋白。RT-PCR分析表明AT2基因随着植株生长时期不同表达量不同,开花期表达量最高,幼苗期至开花期表达量呈上升趋势;且不同组织中,叶片表达量显著高于茎、根。构建了p CAMBIA2300-AT2植物表达载体,运用农杆菌介导法转化烟草,抗性筛选获得7株阳性转基因烟草;经q RT-PCR检测,AT2基因在不同株系转基因烟草T0代中表达量均高于野生型。通过对转基因烟草进行抗病性鉴定,转基因烟草对靶斑病、赤星病的抗性高于野生型烟草。本研究表明,过表达AT2基因能够提高烟草对部分真菌性病害的抗性。     

柠檬F-box基因的克隆及表达分析

本研究以香水柠檬幼嫩叶片为材料,在前期通过De Novo技术获得的F-box基因片段基础上设计引物,利用RT-PCR技术成功克隆出长度为585 bp的F-box基因,命名为LFB1,该基因编码194个氨基酸,该氨基酸序列在N端具有F-box结构域,生物信息学分析表明:该蛋白分子量为48.94 k D,等电点:5.2。进化分析发现其与克里曼丁桔(Citrus clementina)聚在一起。q RT-PCR分析表明:该基因在植株的根、茎、嫩叶、老叶、花蕾、花苞、幼果、成熟果中均有表达,LFB1基因在组织中的表达量是:茎老叶根花蕾成熟果嫩叶幼果;在花的不同器官的表达分析,发现该基因在雄蕊中的表达量最高,其它组织则相对较低,在雄蕊中基因的表达量是其它组织的10倍左右;在逆境胁迫下,该基因的表达量发生明显变化,表明该基因与植株的生长发育、花粉的发育以及环境胁迫可能有着一定的关系。     

水曲柳花发育相关FmFT基因克隆、表达及生物信息学分析

FT(FLOWERING LOCUS T)基因是植物多个开花途径的整合因子,在花发育中起重要作用。以水曲柳雌雄花发育转录组中FT序列为基础,通过PCR扩增获得该基因全长,命名为FmFT。其开放阅读框(ORF)为525 bp,编码174个氨基酸。生物信息学分析结果表明,其相对分子质量为19 795.2,等电点为5.90,是亲水性不稳定酸性蛋白;无跨膜区域,全部位于膜外;有1个PEBP保守结构域。同源比对结果显示,水曲柳FT基因编码的氨基酸序列与20个物种的FT蛋白序列同源性在83%~88%之间,与苹果(Malus domestica)同源性最高,为88%。系统进化结果显示,水曲柳FT蛋白单独聚为一类,与其他物种亲缘关系均较远。FmFT在水曲柳不同发育时期的雌雄花中的表达结果表明,在减数分裂时期和成熟孢子时期,雌雄花之间表达量差异显著。在雄花中,在减数分裂时期表达量达到最大值;在雌花中,表达量持续升高,在成熟胚囊时期达到最高值,是孢原细胞-大孢子母细胞时期的35.97倍,表明FmFT不仅在水曲柳雌雄花的发育中起着重要作用,且功能不同。     

玉米抗逆基因ZmqLTG3-1的克隆及功能分析

以玉米自交系豫82为材料,同源克隆了与水稻q LTG3-1基因同源的玉米Zmq LTG3-1基因。序列分析发现,该基因c DNA序列全长606bp,开放阅读框441bp,编码包含147个氨基酸的蛋白。该蛋白含有AAI_LTSS超蛋白家族的LTP(含8个半胱氨酸)保守结构,分子量为14.16k Da,等电点是8.3,与高粱、水稻的相似度分别为92%和88%。荧光定量RT-PCR分析结果表明,Zmq LTG3-1在玉米胚中的表达量最高,其次是茎尖,在叶、根等器官中的表达量较低;随着胚萌发时间的延长,其表达量逐渐增加,在萌发24h时呈现最高丰度表达,之后表达丰度与萌发时间呈现规律性下降。亚细胞定位结果表明,该基因所编码的产物被定位在细胞膜上,是一跨膜蛋白。通过农杆菌介导的花序侵染法将过表达载体OE-Zmq LTG3-1和空载体p CAMBIA1304转入拟南芥,在诸如干旱、高温和盐等非生物胁迫下,与对照相比,T3转基因植株的成活率显著提高,说明Zmq LTG3-1基因对于抵抗非生物胁迫发挥了重要作用。     

紫苏FAD3基因的克隆与表达分析

ω-3脂肪酸脱氢酶(ω-3 FAD)是植物脂肪酸合成途径的关键限速酶,通过调节该酶的过量表达,可以使植物中的α-亚麻酸(ALA)含量增加。本研究采用RT-PCR的方法,以紫苏L1品系为材料,克隆得到一个ω-3脂肪酸脱氢酶基因PfFAD3。生物信息学分析结果显示PfFAD3开放阅读框为1 176 bp,编码319个氨基酸,推测其蛋白分子量为44.7 k D,等电点为9.19;PfFAD3较为保守,具有四个富含组氨酸的保守区域。q RT-PCR结果表明,PfFAD3基因具有组织表达特异性,在种子中的表达量远高于其它器官。同时,研究了外源Me JA和温度对紫苏茎和叶中PfFAD3基因表达的影响,结果显示外源Me JA能够快速诱导叶片中PfFAD3基因表达量的上调,而抑制PfFAD3基因在茎中的表达;低温能够诱导叶片中PfFAD3基因表达量上调,而高温则抑制叶与茎中PfFAD3基因的表达,表明PfFAD3基因可能参与紫苏的防御反应。     

三个桑树肌动蛋白基因的克隆与组织表达分析

肌动蛋白基因在植物各种生理活动中具有极其重要的作用,通过同源克隆与反向PCR的方法,克隆了3个肌动蛋白基因的核心片段,其中一个为已报道的MaACT1,另两个分别被命名为MaACT2和MaACT3,进而PCR扩增获得MaACT1和MaACT2肌动蛋白全长CDS,其中MaACT2基因全长1 704 bp,由4个外显子和3个内含子组成,CDS为1 134 bp,编码377个氨基酸残基。采用RT-PCR的方法分析了3个基因在叶、茎、果、根等组织的表达情况以及在茎、叶和托叶的生长过程中的表达变化。MaACT1在茎中表达量较弱但有随着茎的生长逐渐增强的趋势,在幼叶中有较高的表达,MaACT2与MaACT3在根、茎、叶等组织中都有较高表达,MaACT3在叶、托叶和茎的各个发育时期表达都很稳定,可以作为桑树基因表达研究的内参基因。     

珍珠黄杨BsGAI1基因的克隆及实时定量表达分析

DELLA蛋白是赤霉素信号传导通路中一类重要的负调节因子。本研究以珍珠黄杨叶片为试材,利用PCR技术和RACE技术克隆得到珍珠黄杨DELLA蛋白基因Bs GAI1。其c DNA全长2 576 bp,包括1 884 bp完整的ORF,能够编码含有627个氨基酸的蛋白。同时,蛋白相对分子质量为67.39 k D,等电点(p I)为4.99,并且总亲水性平均数为-0.162,预测该蛋白为亲水性蛋白。生物信息学研究表明,Bs GAI1编码蛋白具有DELLA蛋白的典型结构域。实时荧光定量表达分析表明,Bs GAI1基因在珍珠黄杨根、叶、茎和花中都有一定的表达,在根中表达量最低,茎中表达量最高。研究说明,Bs GAI1基因可能在珍珠黄杨茎节间缩短导致矮化的过程中扮演重要角色。     

草莓CO同源基因FaCO-2的克隆及表达分析

以草莓(Fragaria×ananassa Duch.)品种花姬为试材,通过PCR和RT-PCR方法克隆出草莓CO同源基因FaCO-2的CDS和DNA全长序列,在此基础上通过实时定量PCR的方法检测了其在草莓植株各组织和花器官中的表达。结果表明,该基因DNA序列长度为1 882 bp,含1个内含子,其CDS长度为1 146 bp,编码382个氨基酸,与其他物种的CO同源基因氨基酸序列有较高的同源性,生物信息学分析表明该蛋白分子量为42 021.69 D,等电点pI=5.49。实时定量RT-PCR结果表明,在不同的组织、花器官中,FaC0-2的表达量存在差异,在充分展开的较大叶片中的表达量最高;在4轮花器官中,只在萼片中表达,而其他花器官中不表达。     

烟草过氧化物酶基因NtPOD1的克隆及表达模式分析

为烟草过氧化物酶基因的功能及结构研究奠定理论基础,采用同源克隆的方法,从烤烟品种K326中克隆出了过氧化物酶基因Nt POD1的c DNA全长,并进行了生物信息学分析;同时,运用q RT-PCR的方法,分析了该基因的组织器官及逆境胁迫表达模式。结果显示,该基因c DNA全长981 bp,编码326个氨基酸残基,预测分子量为37.19 ku,等电点为8.89。生物信息学分析表明,该蛋白是一个亲水性蛋白,结构域中含有4个保守的二硫键和2个保守的钙结合位点,可能定位在细胞外(包括细胞壁),属于植物血红素依赖性过氧化物酶超家族的Ⅲ类分泌氧化酶,与渐窄叶烟草POD42、美花烟草POD42、马铃薯POD42等具有很高的同源性。该基因在烟草根、茎、叶、花中均有表达,其中叶中表达量最高,花中表达量最低。同时,Nt POD1的表达受高盐、干旱、低钾、ABA和H2O2诱导。结果表明,Nt POD1基因属于烟草的过氧化物酶,并可能在烟草非生物逆境胁迫响应中发挥作用。     

棉花SNC2基因的克隆及表达分析

以陆地棉(Gossypium hirsutum)TM-1为材料,利用同源克隆技术从棉花中分离出SNC2基因,以actin基因为内参,采用半定量RT-PCR分析该基因在棉花组织中的表达,并采用实时定量RT-PCR分析不同棉花品种经大丽轮枝菌侵染后,SNC2基因在不同时段、不同组织的表达水平。研究分析发现该基因CDS序列长度为1 308 bp,编码435个氨基酸,蛋白的等电点(p I)为6.98,理论分子量为46.93 k D,命名为SNC2,Gen Bank登录号为AOO35322.1,SNC2基因编码多肽链中包含信号肽和跨膜结构域,且亚细胞定位于质膜,编码受体类蛋白。组织表达分析显示SNC2基因在根、侧根、茎、叶和花中均有表达,茎中的表达量较高,而在苞片组织中基本不表达。该基因在接菌后的感病品种军棉1号的根和耐病品种中棉49号的茎中呈现不断上升的趋势,而在两个棉花品种的其他组织中呈现出"升-降-升"的趋势,且在不同抗性的棉花品种中的表达存在差异,暗示SNC2基因可能在不同抗性品种抵御生物胁迫过程中扮演重要角色,研究结果为进一步研究SNC2基因的功能及应用该基因提供帮助。     

灯盏乙素生物合成关键酶基因的克隆与表达分析

灯盏乙素是灯盏花的主要药用成分,研究灯盏乙素合成的相关基因对培育高品质的灯盏花品种有重要意义。本研究通过转录组测序和RT-PCR获得灯盏花黄酮6-羟化酶(flavone 6-hydroxylase,F6H)和7-O-葡糖醛酸转移酶(flavonoid 7-O glucuronosyltransferases,F7GAT)基因c DNA全长,分别命名为EbF6H1、EbF6H2和EbF7GAT。生物信息学软件分析表明灯盏花F6H1 c DNA全长1 478 bp,编码492个氨基酸残基;F6H2 c DNA全长1 524 bp,编码507个氨基酸残基;F7GAT c DNA全长1 311 bp,编码436个氨基酸残基。荧光定量PCR表明F6H1主要在根中表达;F6H2在叶片中表达量最高,其次是根和茎;F7GAT在叶中的表达量显著高于其它器官。HPLC分析表明,叶片中灯盏乙素含量最高,其次是茎和花,在根中未检测到。根中总绿原酸的含量最高,其次是叶,显著高于茎和花。本研究有助于进一步探明基因功能和活性成分积累的关系。     

甘蔗乙烯信号转导途径关键基因CTR1的克隆与表达分析

为了研究CTR1基因与甘蔗糖分积累的关系,本研究利用同源克隆的方法,以甘蔗品种‘桂糖28’(GT28)幼嫩叶片的cDNA为模板,成功克隆得到2103 bp的甘蔗CTR1基因(ScCTR1;GenBank登录号为MK158246)。ScCTR1基因的开放阅读框(ORF)序列长1656 bp,编码551个氨基酸,预测蛋白质的分子质量为62.78 kD。ScCTR1蛋白具有CTR1同源蛋白典型的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶结构域。实时荧光定量PCR结果表明,ScCTR1基因在茎和叶中都有表达,在茎中其表达量呈先增加后降低的趋势,在未成熟叶、成熟叶和老叶中,其基因表达呈降低的趋势。本研究结果对阐明乙烯调控甘蔗茎糖分积累和叶发育的机理提供了重要的参考依据。     

白菜S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶BrSAMDC基因的克隆、表达及生物信息学分析

S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶(S-adenosylmethionine decarboxylase, SAMDC)是生物体内亚精胺合成过程中的限速酶,在植物生长发育及抗逆境胁迫方面起到重要的调节作用。本研究通过RT-PCR技术从大白菜栽培种Chiifu-401中克隆得到一个BrSAMDC基因,并对其进行表达特性及其蛋白的结构与功能进行生物信息学分析。结果表明,BrSAMDC的cDNA扩增序列为1 566 bp,CDS区为1 107 bp,编码368个氨基酸。定量PCR结果显示,BrSAMDC基因在白菜的各个组织均有较高表达,其中角果中的表达量最高,其次为花、茎和根,而在叶片中的表达量最低。BrSAMDC蛋白分子量为40.52 kD,属于亲水、稳定蛋白;预测其分布于细胞核内,不存在信号肽和跨膜结构域;二级结构中以无规则卷曲和α-螺旋为主,三级结构同源建模成功。14种植物SAMDC蛋白的序列对比分析显示,均含有LSESSLF结构域和PEST结构域,且十分保守;十字花科的SAMDC蛋白同源性较高,且其氨基酸的进化与植物分化具有一致性。本研究为白菜SAMDC基因的功能研究及应用提供数据基础。     

陆地棉干旱胁迫基因GhRBCO的克隆与表达分析

Rubisco蛋白(ritmlose-1,5-bisphosphosphate carboxylase/oxygenase,Rubisco)的上调表达是植物应对非生物胁迫的特征之一。本研究在前期蛋白质组学分析的结果上,利用同源克隆获得陆地棉‘KK1543’在干旱胁迫下差异表达的基因GhRBCO。GhRBCO基因编码区长747 bp,编码249个氨基酸;比对氨基酸序列及同源性分析发现,GhRBCO与其它植物中的RBCO蛋白的一致性较高,表明该基因在进化过程中是相当保守的。系统进化树结果显示,GhRBCO与雷蒙德氏棉、亚洲棉和黄花嵩的同源性最高。利用荧光定量PCR技术在15%PEG胁迫下研究该基因表达变化,表达量在棉花的根、茎和叶中都表现为先缓慢升高后降低的变化趋势,在根中表达量在24 h达到第一次最高;在茎中于12 h表达量最低。该基因的表达量在棉花的根、茎、叶中都呈上调表达水平。结果表明,GhRBCO基因可能参与棉花调节非生物胁迫机制。本研究结果为进一步研究GhRBCO基因的功能奠定了一定的基础。     

MADS-box基因GmAGL15在大豆种子发育过程中的表达

以同源序列法克隆了大豆MADS-box基因GmAGL15, 序列分析表明, 该基因编码的氨基酸与拟南芥AGL15蛋白的同源性为61%, 其中在MADS区的同源性为84.3%, K区的同源性为63.2%。半定量RT-PCR分析表明, GmAGL15在幼胚中高度表达, 而没有检测到在根、茎、叶和花中的表达。荧光定量RT-PCR分析发现, GmAGL15在大豆种子发育的不同时期均有不同程度的表达, 其中在开花后15 d的幼胚中表达量较高, 而在开花后30 d的幼胚中表达量最高。以上结果显示, 基因GmAGL15对于大豆种子发育的调控可能有重要作用。     

黑喉石斛DoCOL10基因克隆及在花发育过程中的表达模式分析

CO (CONSTANS)是植物成花诱导中光周期途径的关键基因。为探明黑喉石斛(Dendrobium ochreatum)CO同源基因在其花发育过程中的表达模式,以黑喉石斛不同时期叶片为试验材料,基于转录组测序结果,结合同源克隆和3'RACE克隆技术得到黑喉石斛CO同源基因,命名为DoCOL10。DoCOL10基因编码区长度为1 263 bp,共编码421个氨基酸;该基因编码的氨基酸序列有2个完整且相连的B-box元件和1个CCT结构域,属于CO家族第1类,为CO同源基因;Do COL10不具备跨膜结构域和信号肽,为亲水性蛋白;进化树分析结果显示,DoCOL10与兰科植物如铁皮石斛、小兰屿蝴蝶兰、墨兰等的同源基因的氨基酸序列亲缘关系最为接近,单子叶和双子叶植物之间CO进化较远,处在不同分枝中。Real-time PCR分析结果显示,DoCOL10的表达量在花芽始分化阶段出现显著上调并达到峰值,随着花芽形成呈下降趋势;DoCOL10不仅在叶片中高表达,其在花芽中的表达量也处于较高水平,在花器官中也有一定表达。为深入研究DoCOL10基因在黑喉石斛嫩茎成花机制中的作用提供理论依据。     

香樟IDI基因克隆及表达分析

为了克隆香樟异戊烯基焦磷酸异构酶(isopentenyl diphosphate isomerase,IDI)基因,并进行生物信息学分析,为香樟植物萜类化合物的生物合成研究提供基础。本研究以香樟植物为试样,在转录组测序数据的基础上设计引物,应用RT-PCR技术克隆香樟IDI基因,通过实时定量PCR方法检测IDI基因在香樟根、茎和叶中表达量,利用生物信息学方法对IDI基因编码的蛋白进行表征。结果表明,香樟IDI基因长度868 bp,开放读码框(ORF)为708 bp,编码235个氨基酸,编码蛋白的分子量为27.04 kD,等电点为5.13,蛋白的二级序列结构主要为α-螺旋。经预测香樟IDI是一个定位于细胞质,不含信号肽的亲水性稳定蛋白,具有异戊烯基焦磷酸异构酶的特征结构域。系统进化树分析表明,香樟IDI与野生型马来西亚蕉的亲缘关系较近。实时定量PCR结果表明,IDI在香樟茎中的表达量高于根和叶。本研究成功从香樟中克隆了IDI基因并进行了表征分析,为深入研究香樟IDI基因在萜类合成中的功能提供帮助。