烟草NtNHX1-1基因特征分析

烟草是中国重要的经济作物之一。盐胁迫对烟草生产造成巨大危害,克隆盐胁迫响应基因,为从分子水平抵御盐胁迫提供基因资源。本研究克隆了Na+/H+反向转运蛋白基因。该基因编码的蛋白为膜蛋白,具有12个跨膜区。进化分析表明,Nt NHX1-1与番茄的Sl-NHX1遗传距离最近,相似性为95%,其次为甜辣椒的Ca-NHX2,相似性为94%。组织特性表达分析表明,NtNHX1-1基因在茎中表达最高、其次为叶、花和根。NaCl处理后NtNHX1-1基因的表达明显上调,表明该基因可能在烟草抵抗盐胁迫中发挥重要功能。通过调控NtNHX1-1基因的表达有望获得耐盐胁迫烟草新品系。     

烟草ERF基因NtRAP2-7的表达载体构建及表达模式分析

为了研究烟草Nt RAP2-7基因在非生物胁迫响应中的功能,采用同源克隆的方法,在烟草品种K326中克隆到1个ERF转录因子基因Nt RAP2-7。并利用生物信息学软件分析了该基因编码蛋白的理化性质、空间结构与系统进化关系。序列分析结果表明,该基因序列全长1 398 bp,共编码465个氨基酸残基,预测蛋白的分子量为51. 16 ku。该蛋白包含一个由3个β-折叠及1个α-螺旋组成的保守结构,并含有58个磷酸化位点。亚细胞定位预测表明,该蛋白主要定位于细胞核,并包含单分型的核定位信号序列。进化分析表明,Nt RAP2-7蛋白与林烟草RAP2-7蛋白序列同源性最高,为98%。运用q RT-PCR技术进行了该基因的表达模式分析,组织表达分析发现,Nt RAP2-7基因在烟草根、茎、叶、花中均有表达,但在根中的表达量最高。该基因的表达在低钾、高盐、干旱、ABA、H2O2处理下受到诱导和在低温处理下受到抑制,结果表明,烟草Nt RAP2-7基因参与了烟草的非生物胁迫应答反应。并利用双酶切法成功构建了p BI121-Nt RAP2-7过表达载体,为今后该基因在非生物胁迫下的功能研究奠定了基础。     

烟草β-胡萝卜素羟化酶基因的特征分析

β-胡萝卜素羟化酶基因在植物类胡萝卜素的合成代谢过程中起着关键的作用。烟草中的类胡萝卜素是烟叶香气物质的主要前体物之一。本研究克隆了烟草4个β-胡萝卜素羟化酶基因。烟草β-胡萝卜素羟化酶基因与其它作物的BCH基因具有相似的结构,由7个外显子和6个内含子组成。其编码的蛋白包含BCH蛋白的保守结构域,即脂肪酸羟化酶超家族保守域。进化分析表明,烟草Nt BCH蛋白与番茄、枸杞、辣椒等茄科作物的BCH蛋白遗传距离较近。组织特异性表达分析表明,Nt BCH1和Nt BCH2基因主要在叶和花中表达,Nt BCH3和Nt BCH4主要在根和花中表达。从本研究结果推断,可以通过调控Nt BCH1和Nt BCH2基因的表达控制烟叶中类胡萝卜素的含量。     

烟草K~+通道NtSKOR基因的克隆及表达分析

钾通道是植物吸收和转运K~+的主要蛋白质,SKOR属于Shaker通道外整流家族,在植物低钾胁迫反应中起关键作用。为了研究烟草NtSKOR基因在非生物逆境胁迫中的功能和作用,以普通烟草K326为试验材料,同源克隆一个NtSKOR基因c DNA全长,利用实时荧光定量PCR表征基因表达模式,结合生物信息学分析,对蛋白的理化性质、结构域、磷酸化位点和进化关系等进行初步预测。生物信息学分析表明,该基因全长2 484 bp,编码827个氨基酸残基,预测分子量为94. 75 ku,等电点为6.52。该蛋白最大二级结构元件为α-螺旋,最小为β-转角,含有6个跨膜结构域(S1～S6),具有丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸3种不同激酶磷酸化位点。进化分析表明,NtSKOR与美花烟草和绒毛状烟草SKOR蛋白同源性高,分别是99%和96%,故命名为NtSKOR。组织表达分析发现,该基因在烟草根、茎、叶、花中均有表达,其中根中表达量最高,花中表达量最低。逆境胁迫试验表明,该基因能快速响应低钾、高盐、干旱、H_2O_2、ABA和4℃等非生物逆境处理。由此推测,NtSKOR在烟草非生物逆境胁迫起着重要调节作用,为今后进一步深入研究NtSKOR功能提供了理论基础。     

烟草过氧化物酶基因NtPOD1的克隆及表达模式分析

为烟草过氧化物酶基因的功能及结构研究奠定理论基础,采用同源克隆的方法,从烤烟品种K326中克隆出了过氧化物酶基因Nt POD1的c DNA全长,并进行了生物信息学分析;同时,运用q RT-PCR的方法,分析了该基因的组织器官及逆境胁迫表达模式。结果显示,该基因c DNA全长981 bp,编码326个氨基酸残基,预测分子量为37.19 ku,等电点为8.89。生物信息学分析表明,该蛋白是一个亲水性蛋白,结构域中含有4个保守的二硫键和2个保守的钙结合位点,可能定位在细胞外(包括细胞壁),属于植物血红素依赖性过氧化物酶超家族的Ⅲ类分泌氧化酶,与渐窄叶烟草POD42、美花烟草POD42、马铃薯POD42等具有很高的同源性。该基因在烟草根、茎、叶、花中均有表达,其中叶中表达量最高,花中表达量最低。同时,Nt POD1的表达受高盐、干旱、低钾、ABA和H2O2诱导。结果表明,Nt POD1基因属于烟草的过氧化物酶,并可能在烟草非生物逆境胁迫响应中发挥作用。     

两个烟草多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因的克隆和表达分析

为了研究多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PGIP)在烟草中的生物学功能,运用生物信息学方法,结合RT-PCR和SMART RACE技术,从烟草中克隆到2个多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PGIP)基因c DNA和DNA全长序列,分别命名为Nt PGIP1(Gen Bank登录号:KF317203)和Nt PGIP2(Gen Bank登录号:KF317204)。Nt PGIP1基因全长为1 413 bp,编码338个氨基酸;Nt PGIP2基因全长为1 185 bp,编码329个氨基酸;两基因均没有内含子序列,核苷酸序列有50%的一致性,编码的氨基酸序列有54%的一致性。两基因编码蛋白均含有植物PGIP蛋白特有的重复保守序列LXXLXXLXXLXLXXNXLXGXIPXX。对PGIP基因在烟草不同组织表达量分析发现,两基因在根、茎、叶和芽中均有表达,其中均在茎中表达量最高,其次是根,叶中表达量很低。     

新疆哈密瓜AT2基因的克隆及初步功能验证

本研究利用RT-PCR技术从抗霜霉病哈密瓜(Cucumis melo L.)品种MR-1中克隆到AT2基因,其整编码区为1 229 bp,编码401个氨基酸,同源比对结果为99%,将其编码的丝氨酸乙醛酸转氨酶蛋白序列与多种物种进行系统进化树分析,结果显示,甜瓜与黄瓜SGT蛋白同源性较高,遗传距离最近,推测在同属中该蛋白进化相对保守。在线分析表明SGT蛋白不含信号肽及跨膜区,即该蛋白为非跨膜蛋白。RT-PCR分析表明AT2基因随着植株生长时期不同表达量不同,开花期表达量最高,幼苗期至开花期表达量呈上升趋势;且不同组织中,叶片表达量显著高于茎、根。构建了p CAMBIA2300-AT2植物表达载体,运用农杆菌介导法转化烟草,抗性筛选获得7株阳性转基因烟草;经q RT-PCR检测,AT2基因在不同株系转基因烟草T0代中表达量均高于野生型。通过对转基因烟草进行抗病性鉴定,转基因烟草对靶斑病、赤星病的抗性高于野生型烟草。本研究表明,过表达AT2基因能够提高烟草对部分真菌性病害的抗性。     

梨YUCCA基因家族的鉴定与生物信息学分析

YUCCA基因编码黄素单加氧酶,是IAA生物合成主要限速酶基因之一,在植物生长发育中起着重要调控作用。本研究对白梨全基因组数据库进行筛选鉴定,获得梨YUCCA基因家族基因14个,这些基因非均等地分布在8条染色体上。生物信息学分析发现,梨YUCCA基因长度相差较大,含有2或3个内含子;基因具有10个保守基序,其中黄素嘌呤二核苷酸结合位点和还原型辅酶Ⅱ结合位点为基因家族所共有。基因家族亲缘关系分析显示,梨YUCCA基因家族可以分为2个类群,与苹果YUCCA基因亲缘关系较近。亚细胞定位和结构分析显示,梨YUCCA基因均定位在细胞质中,受多种激素所诱导,多数成员具有相似的三级结构。本研究的开展为梨YUCCA基因功能解析提供了参考。     

马铃薯光敏色素作用因子基因PIF4的克隆及表达分析

本研究以栽培种马铃薯青薯9号为试验材料,利用同源克隆技术分离出一个光敏色素作用因子St PIF4基因,该基因开放阅读框长度为1 554 bp,编码517个氨基酸,含有HLH保守结构域;系统进化树分析表明,StPIF4与茄科植物聚为一类,和已测序的马铃薯DM亲缘关系最近。蛋白功能预测表明,StPIF4蛋白不具备信号肽位点和跨膜结构,其蛋白序列含有56个磷酸化位点,亚细胞定位于细胞核或细胞质中。RT-qPCR分析表明,StPIF4在根、茎、叶片、块茎和匍匐茎中均能表达,在叶片中相对表达量最高,根中较低。通过对StPIF4基因的克隆和表达分析,为深入马铃薯StPIF4的功能分析提供科学基础。     

苹果砧木YUCCA10a基因的克隆及其在嫁接树体的定量表达分析

为了研究M9矮化砧和八棱海棠砧YUCCA10a基因的结构特征及其嫁接树体的表达特征,从M9矮化砧和八棱海棠砧中克隆了YUCCA10a基因,并对该基因进行了序列分析以及不同时期2种砧木嫁接"烟富3"的定量表达分析。通过分析表明,该基因的编码序列为1 149 bp,推导编码382个氨基酸,预测蛋白质分子量为94 285.29 Da,理论等电点为5.08。实时荧光定量PCR结果表明,5月和10月份的M9矮化砧嫁接"烟富3"中YUCCA10a基因相对表达量明显低于八棱海棠砧,2种砧木嫁接的"烟富3"中YUCCA10a基因在10月份的相对表达量略高于5月份。本试验结果为研究M9矮化砧和八棱海棠砧YUCCA10a基因的结构特征和砧木对嫁接"烟富3"影响的机理方面提供理论依据。     

基于全基因组的番茄YUCCA基因家族生物信息学分析

YUCCA基因是植物在合成生长素过程中限速酶的编码基因,植物在生长发育过程中离不开生长素,也同样也离不开YUCCA基因。为深入研究番茄中的YUCCA基因,本研究利用生物信息学方法,在番茄全基因组范围内共鉴定出了17个YUCCA基因,并对17个YUCCA基因的基本信息、转录本结构、保守基序、顺式元件、染色体定位、系统发育以及表达模式进行了分析。结果表明,17个YUCCA基因分布在7条染色体上,并且可以分为三大类A、B、C。YUCCA基因的内含子在0~7之间分布。系统发育分析表明,同一条染色体上的YUCCA基因有明显的进化关系。通过以上分析,对后续深入研究番茄YUCCA基因家族提供了参考。     

棉花赤霉素不敏感矮化GID1同源基因的克隆和表达分析

作为赤霉素(GA)受体,GID1是其重要的信号传导组分。为研究GA在棉花发育(特别是纤维发育)中的作用,本文在EST序列的基础上克隆了6个棉花GID1同源基因(GhGID1-1~6)。多重序列分析表明,棉花GID1同源蛋白GhGID1-1~6与拟南芥和水稻的GID1蛋白高度同源,具有多个与GA和DELLA蛋白的结合位点以及激素敏感酯酶家族保守域HGG和GXSXG。定量RT-PCR分析表明,GhGID1-1~6基因在棉花不同器官和组织中表达水平有差异,其中GhGID1-1和GhGID1-2在花器官中高表达,GhGID1-4基因在纤维和根中优势表达。胚珠体外培养基中外加GA使GID1同源基因表达水平发生变化,GhGID1-1和GhGID1-2基因的表达水平明显受GA抑制。比较发现,在胚珠和纤维中优势表达的GID1同源基因不同,GID1基因表达水平随发育时期变化的趋势也不相同,表明棉花胚珠和纤维具有相对独立的GA信号识别系统。     

林烟草钾离子通道基因NKT6的克隆与表达定位分析

Shaker家族钾离子通道在植物钾的吸收转运及其他生命过程中发挥重要作用。本研究利用同源克隆的策略从林烟草中获得一个Shaker家族钾离子通道基因,命名为NKT6 (GenBank登录号为KC310448)。该基因cDNA序列全长2 317 bp,编码由681个氨基酸组成的蛋白,该蛋白与Shaker家族其他成员具有较高同源性。NKT6基因组CDS序列共含有11个外显子、10个内含子。系统进化树分析表明,NKT6蛋白是Shaker家族Group II的成员之一。荧光定量PCR分析发现,NKT6的表达量在林烟草的茎和腋芽中最高,在萼片、叶、花中其次,在根中最低。亚细胞定位结果表明,NKT6主要定位于细胞膜和核膜附近的内质网上。干旱与外源ABA胁迫处理下,NKT6的表达量均呈下降趋势。推测NKT6可能在林烟草气孔开放中发挥作用。     

珍珠黄杨BsGAI1基因的克隆及实时定量表达分析

DELLA蛋白是赤霉素信号传导通路中一类重要的负调节因子。本研究以珍珠黄杨叶片为试材,利用PCR技术和RACE技术克隆得到珍珠黄杨DELLA蛋白基因Bs GAI1。其c DNA全长2 576 bp,包括1 884 bp完整的ORF,能够编码含有627个氨基酸的蛋白。同时,蛋白相对分子质量为67.39 k D,等电点(p I)为4.99,并且总亲水性平均数为-0.162,预测该蛋白为亲水性蛋白。生物信息学研究表明,Bs GAI1编码蛋白具有DELLA蛋白的典型结构域。实时荧光定量表达分析表明,Bs GAI1基因在珍珠黄杨根、叶、茎和花中都有一定的表达,在根中表达量最低,茎中表达量最高。研究说明,Bs GAI1基因可能在珍珠黄杨茎节间缩短导致矮化的过程中扮演重要角色。     

水芹OjHSP90基因克隆及生物信息学分析

本研究从水芹中克隆得到一个HSP基因Oj HSP90,生物信息学分析表明:水芹Oj HSP90基因全长2 100 bp,编码699个氨基酸;Oj HSP90蛋白的理论分子量为80.3 k D,等电点为5.01,是一种亲水性的稳定蛋白;Oj HSP90蛋白的二级结构中,α-螺旋占52.93%,延伸链占16.74%,β-折叠占5.87%,无规则卷曲占24.46%;该蛋白的N端含有1个HSP90超家族蛋白保守的结构域YSNKEIFLRE,能够与ATP结合;进化树分析表明,Oj HSP90蛋白与拟南芥At HSP90蛋白和烟草Nt HSP90的相似度最高,分别为91.99%和92.13%。本研究旨在为进一步研究HSP90基因的功能以及研究水芹耐高温途径提供理论参考。     

大豆sbp基因表达方式分析及其启动子调控活性研究

研究大豆蔗糖结合蛋白基因(sbp)的表达方式及其启动子的调控活性,为揭示sbp基因表达本质及其启动子功能研究、利用提供理论依据。利用qRT-PCR方法,检测sbp基因在不同逆境胁迫条件下及不同组织中的表达方式;利用PCR方法,克隆sbp基因5'端上游序列并对其进行预测分析;在转基因烟草中,研究sbp基因启动子在干旱胁迫条件下及不同组织中的调控活性。sbp基因受干旱诱导上调,而在盐、低温、ABA诱导下表达下降。sbp基因在大豆根、茎、叶、花中的相对表达量低,而在种子中的相对表达量高。克隆获得sbp基因5'端上游942 bp序列,命名为SP,预测分析表明,SP序列中含有多种典型的种子特异表达元件及与激素、逆境诱导相关的元件。组织化学分析表明,在转基因烟草中,SP启动子驱动gus基因在干旱胁迫下及种子中高表达。推测SP启动子兼具干旱诱导表达活性和种子特异表达特性。     

木薯MeAnn1基因的克隆及表达分析

以华南8号木薯为材料,采用RT-PCR技术,克隆得到1个具有完整阅读框的木薯膜联蛋白基因,命名为MeAnn1(Gen Bank序列号为:KM975562),该基因CDS序列长度为951 bp,编码317个氨基酸。生物信息学分析发现,其理化性质、蛋白保守结构域及多个蛋白功能位点与已报道的植物膜联蛋白一致。进化树分析表明,木薯MeAnn1与Ptr Ann6、At Ann1、At Ann2、At Ann6和Ann Bj1具有较近的亲缘关系,具有59.9%~84%的序列相似性。细胞定位结果表明MeAnn1蛋白主要定位于细胞质和细胞核中。实时荧光定量PCR分析表明,木薯膜联蛋白基因MeAnn1的表达受多种非生物胁迫的诱导,其中低温胁迫下基因表达量上调幅度最大,为对照表达量的24倍;但对H2O2胁迫不敏感。本研究结果有助于进一步研究MeAnn1基因的功能及木薯抗逆的分子机理。     

玉米光周期敏感类Hd6基因的克隆和实时定量表达分析

水稻Hd6基因在调节水稻光周期敏感中起重要作用。本研究以热带玉米自交系CML288为材料, 利用同源基因克隆法结合3¢RACE技术克隆了与水稻Hd6基因同源的玉米类Hd6基因。该基因序列中999 bp的开放阅读框可编码332个氨基酸。BLAST分析发现, 该基因与玉米中编码蛋白激酶CK2的一个基因高度同源, 所推测的氨基酸序列包含2个CK2活性区域, 1个N末端区域, 1个ATP结合位点和1个丝氨酸/ 苏氨酸蛋白质激酶活性位点,与玉米、小麦、水稻和拟南芥的CK2氨基酸序列也有较高的同源性。建立了SYBR GREEN法实时荧光定量RT-PCR表达分析系统, 研究了不同光周期处理下类Hd6基因在光周期敏感自交系CML288茎尖和叶片中的表达。结果发现, 该基因在茎尖和叶片中均有表达。在短日条件下, 该基因在6~8叶期茎尖中的表达量存在明显差异, 在光周期敏感的7叶期出现表达高峰, 在叶片中的表达量均低于茎尖。在长日条件下, 该基因在茎尖中6叶期表达量较低, 在光周期敏感的9叶期在叶片中高量表达。由此可推测, 该基因与玉米光周期敏感密切相关, 可能在光周期敏感调节过程中发挥一定的作用。     

芍药分生组织决定基因APETALA2(AP2)的克隆及生物信息学分析

花分生组织决定基因APETALA2(AP2)属于植物ABCDE模型基因,在花器官发育过程中起着重要的调控作用。为进一步了解芍药AP2基因的生物学功能,利用RACE扩增和测序技术克隆plAP2基因序列,利用生物信息学在线程序对其序列特征、蛋白结构及功能、亚细胞定位进行预测,并利用MEGA 5.0构建不同植物AP2分子进化树,最后利用qPCR检测其在内外花瓣中的差异表达情况。结果显示,克隆获得芍药AP2基因(plAP2)cDNA序列全长1 935 bp,其ORF全长为1 578 bp,编码525个氨基酸。蛋白结构与功能分析表明,plAP2蛋白为亲水性不稳定蛋白,无跨膜结构和信号肽,表明为非分泌蛋白;核定位信号位于氨基酸序列139-147(KKSRRGPRS);二级结构包括α-螺旋(24%)、β-折叠(19%)、β-转角(28%)和无规则卷曲(28%);plAP2蛋白存在8个糖基化位点和64个磷酸化位点,plAP2蛋白包含2个相同的保守结构域:AP2/(Ethylene-Responsive factors,ERF)(151-213aa和243-306aa)。亚细胞定位主要在细胞质(45.0%)中,少量分布于微体、线粒体基质间隙和溶酶体;进化树分析表明,芍药AP2基因与牡丹高度同源且亲缘关系最近;qPCR检测显示外瓣AP2表达量均极显著高于内瓣(P0.01)。克隆出芍药AP2全长cDNA序列,系统地揭示了plAP2蛋白基本结构、功能位点区域、细胞定位以及组织表达情况,为今后深入研究plAP2基因功能提供基础素材和理论参考。     

参薯金属硫蛋白基因DaMT2a的克隆与表达分析

金属硫蛋白属于一类富含半胱氨酸,能够与重金属离子结合的低分子量蛋白质,在植物抗逆过程中起着重要作用。本研究从参薯中克隆了一个金属硫蛋白基因,命名为DaMT2a (与金属硫蛋白MT2a同源),序列分析显示克隆获得的金属硫蛋白基因的c DNA长度为540 bp,包含了3个外显子和2个内含子,编码79个氨基酸,具有金属硫蛋白基因家族的保守结构域。进化树分析表明DaMT2a属于金属硫蛋白Type2类成员。利用实时荧光定量PCR技术研究了其在正常组织及胁迫条件下的表达特性。结果表明DaMT2a主要在参薯的茎和雄花中大量表达,机械伤害可显著上调DaMT2a基因表达,高温处理则明显下调DaMT2a基因表达,乙烯利和脱落酸处理上调DaMT2a基因的表达。本研究为参薯抗逆相关金属硫蛋白基因的筛选和功能鉴定提供了参考依据。