木薯干旱胁迫下离区发育相关基因MeAP2-2酵母单杂交文库构建及其上游调控基因的筛选

为了研究干旱胁迫下调节木薯叶片脱落相关的重要节点基因及其分子调控网络,以‘华南5号’木薯为实验材料,通过采用酵母单杂交筛选系统,将MeAP2-2启动子中激素与胁迫相关的元件串联后整合入酵母染色体,构建诱饵菌株;采用SMART技术进行离区cDNA文库的构建,将离区cDNA与pGADT7-Rec表达载体共同转化诱饵菌株,通过同源重组在酵母细胞内筛选MeAP2-2的上游转录调节因子;利用酵母菌落PCR法获得阳性克隆中的cDNA插入片段,测序后在JGI网站进行Blast分析。结果表明,构建的cDNA文库库容为1.5×106,插入片段大小为250~3000 bp。cDNA 插入片段经测序和Blast同源性分析和定量PCR分析,筛选出1个Metallothionein protein,1个Core histone protein,1个Heavy-metal-associated protein与MeAP2-2相关的调节因子。实验结果证明酵母单杂交文库构建成功,初步筛选获得了调节MeAP2-2的上游调节因子。为研究木薯干旱胁迫下离区发育的信号转导通路奠定了基础。     

海岛棉纤维发育相关基因GbPDF2酵母单杂交文库构建及其上游基因解析

为研究棉纤维起始发育的分子调控网络,以海岛棉(Gossypium barbadence L.)品种"海渝"开花当天(0 DPA)胚珠为实验材料,利用酵母单杂交技术来筛选棉纤维起始发育相关基因GbPDF2的上游调控转录因子。首先,克隆GbPDF2的启动子(Accession:KJ475468);构建了该启动子的诱饵融合载体(GbPDF2-PRO)-pAbAi,转入酵母细胞中重组为Y1HGold[Bait-pAbAi]菌株。之后,应用Matchmaker Gold Yeast One-Hybrid Library Screening System系统构建酵母单杂交cDNA文库,转化重组酵母菌株,通过同源重组筛选GbPDF2的上游转录调节因子。构建的cDNA文库库容为2.23×106,重组率为95.8%,插入片段大小为300 bp~2000 bp,其中大于1000bp的阳性克隆为109个。cDNA插入片段经测序和Blast同源性分析,筛选出2个生长素响应因子,1个WRKY7转录因子,1个WD-repeatprotein 40等与纤维发育相关的转录调节因子,为研究棉纤维起始发育的信号转导通路奠定了基础。     

菜用豌豆酵母单杂交cDNA文库及糖转运蛋白PsSWEET15诱饵载体构建

SWEETs (Sugars will eventually be exported transporter)是近年来新发现的一类重要的糖转运蛋白,调控植物体内的糖转运和分配过程。在菜用豌豆中,有关PsSWEETs基因功能及作用机制的报道甚少。本研究克隆获得了PsSWEET15启动子,长度为1 182 bp。通过启动子作用元件分析,发现其含有种子特异表达元件GCN4 motif、光、无氧、乙烯、赤霉素等环境胁迫应答元件以及ERF、DOF、MYB、WRKY、NAC、NF-Y、TCP等多个转录因子结合位点。进一步构建了PsSWEET15启动子酵母单杂诱饵载体pPsSWEET15::HIS3以及菜用豌豆cDNA文库,库容为3.056×10⁸CFU,插入片段平均长度约1 000 bp。研究结果为后续筛选PsSWEET15基因上游转录调控因子并探究PsSWEET15基因调控机制提供了基础。     

木薯MeSAUR1互作蛋白的筛选及鉴定

木薯MeAGPS1a基因编码的小亚基是淀粉合成关键酶AGPase的催化中心,前期研究发现MeSAUR1转录因子可结合MeAGPS1a基因启动子并调控该基因表达。采用酵母双杂交技术筛选MeSAUR1转录因子的互作蛋白,可进一步解析MeAGPS1a基因表达的分子调控网络。本研究构建了MeSAUR1的酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-MeSAUR1,采用酵母双杂交技术从木薯cDNA文库中筛选MeSAUR1的候选互作蛋白,结果共筛选出31个阳性克隆。通过酵母双杂交点对点实验验证了候选互作蛋白MePP2C与MeSAUR1的互作关系,本研究结果有助于揭示Me SAUR1蛋白调控木薯淀粉合成的互作网络。     

木薯MYB转录因子基因MeMYB60表达特征分析及其互作蛋白筛选

Myeloblastosis (MYB)类转录因子在植物对非生物胁迫的响应过程中起重要调控作用。本研究在分析栽培木薯MYB家族成员表达模式的基础上,筛选并克隆到了一个R2R3-MYB转录因子基因MeMYB60。基因表达特性分析表明,该基因在叶片特异表达,受干旱、低温负调控,同时对ABA处理也有响应。启动子活性分析发现,MeMYB60可以在保卫细胞表达,预示着该转录因子基因的表达可能与木薯气孔开闭调节有关。MeMYB60编码蛋白主要定位于细胞核中,具有转录激活活性,其转录激活结构域在蛋白C端第194～343氨基酸残基范围内。以MeMYB60蛋白N端第1～194氨基酸残基片段为诱饵,从干旱胁迫后木薯叶片的cDNA文库中筛选到18种可能与MeMYB60互作的蛋白,酵母双杂确定了MeCatlase1和MeCatalase2分别与MeMYB60存在互作关系。本研究为深入研究转录因子MeMYB60在木薯响应非生物胁迫过程中的功能并解析其调控网络奠定了基础。     

酵母表面展示系统的改进及其在筛选烟草PMT基因启动子结合蛋白中的应用

筛选DNA结合蛋白常用的酵母单杂交系统在应用中有时会因内源干扰而影响筛选结果。与之相比,酵母表面展示系统(yeast surface display system)将外源蛋白展示在细胞表面,可通过接近体外实验的方法筛选DNA结合蛋白,能在一定程度上避免酵母内源干扰,但是,该系统在DNA结合蛋白筛选研究中的应用还很有限。本研究对酵母表面展示系统常用载体pYD1进行改造,使其与Clontech公司的Smart cDNA文库构建系统相匹配,提高了cDNA酵母表面展示文库的构建效率,并通过比较试验建立了一个以酵母表面展示系统筛选DNA结合蛋白的试验体系。在以酵母单杂交筛选烟草腐胺甲基转移酶基因PMT (putrescine N-methyltransferase)启动子结合蛋白的研究中,其茉莉素信号应答元件GAG片段是一段筛选效率极低的DNA片段。本研究利用改进的酵母表面展示系统对GAG片段的DNA结合蛋白进行了筛选,并获得若干烟草蛋白基因,其中包括2个可能结合GAG片段的ERF (ethylene responsive factor)转录因子。进一步研究发现,这2个ERF转录因子可与GAG片段在体外结合,但不能在酵母单杂交系统中激活由GAG片段操纵的报告基因表达。本研究也证明酵母表面展示系统可有效克服酵母内源干扰,弥补酵母单杂交系统在筛选易受酵母内源干扰DNA结合蛋白方面的不足。     

菠萝体细胞胚酵母单杂交cDNA文库及AcSERK1启动子相关诱饵载体的构建

为筛选与菠萝AcSERK1启动子中胚性细胞特异性表达调控区段(-983～-881 nt)的结合蛋白,本研究利用Matchmaker~(TM) Gold Yeast One-Hybrid System构建菠萝体细胞胚酵母单杂交cDNA文库以及胚性细胞特异性表达调控区段(SE103)的诱饵载体。建立的菠萝体细胞胚酵母单杂交cDNA文库库容量为1.25×10~7CFU,其插入片段平均长度约1.5 kb,重组率为100%。通过检测,AbA最低浓度为600 ng/mL时,构建的诱饵载体pAbAi-SE103在Y1HGold酵母菌株中的自激活活性被有效抑制,表明该菠萝体细胞胚酵母单杂交cDNA文库以及诱饵酵母菌株Y1HGold (pAbAi-SE103),可用于AcSRKE1启动子中胚性细胞特异性表达调控区段互作蛋白的筛选实验,为胚性细胞特异性转录因子的分离鉴定提供数据参考。     

青稞酵母双杂文库的构建及HVUL0H33228.2互作蛋白的筛选

白粉病是青稞生产中危害最为严重的病害之一,会造成产量严重下降。本实验室前期筛选到一个白粉菌诱导后上调表达的NF-YB转录因子HVUL0H33228.2。为了进一步明确该基因的作用机制,本研究构建了青稞受白粉菌诱导的酵母双杂交cDNA文库,以HVUL0H33228.2为诱饵进行酵母双杂交筛选。结果表明：所获得的cDNA文库滴度为5.6×10⁸CFU/mL,插入片段长500～2 000 bp,重组率为94%,符合酵母双杂文库质量要求。利用酵母双杂交系统在该文库中筛选到6个与HVUL0H33228.2相互作用的蛋白,分别为铁氧还蛋白-NADP+氧化还原酶、核酮糖二磷酸羧化酶、叶绿素a/b结合蛋白2和6、光合系统Ⅱ反应中心蛋白CP43和醛缩酶型TIM桶家族蛋白。本研究为进一步揭示HVUL0H33228.2应答白粉菌侵染的分子机制提供了参考依据。     

枣ZjERF53转录因子的转录激活分析及互作蛋白筛选

乙烯应答因子广泛参与调控植物生长发育和非生物胁迫响应过程。本研究克隆了1个在枣(Ziziphus jujuba Mill.)果实成熟后期高表达的ZjERF53转录因子,对其进行了亚细胞定位、转录激活活性和互作蛋白筛选研究,以揭示其生物学功能。研究结果表明：ZjERF53基因编码区序列全长为1 155 bp,能在细胞核和细胞膜中表达;ZjERF53具有自激活活性,其转录激活功能区域位于蛋白序列C端;以无自激活活性pGBKT7-ZjERF53-N为诱饵,通过酵母双杂交技术筛选枣果实cDNA文库,共获得4个互作蛋白。本研究揭示了ZjERF53可能参与枣树抗病和抗旱等非生物胁迫响应,为解析ERF参与调控枣树生物学过程的分子机制提供了工作基础。     

日本结缕草ZjERF2转录激活验证及互作蛋白的初步筛选

为了研究ZjERF2转录因子在日本结缕草(Zoysia japonica)生长发育和环境胁迫中的调控通路,筛选与ZjERF2转录调控过程中互作的蛋白。本研究采用酵母双杂的方法,通过构建"诱饵"载体p GBKT7-ZjERF2,并转化酵母感受态细胞,表明"诱饵"载体在酵母细胞中无毒且不能自激活。将p GBKT7-ZjERF2和日本结缕草全长cDNA文库共转化酵母感受态细胞,经SD/-Leu-Trp-His-Ade/X-α-Gal培养基筛选获得29个菌落,通过PCR扩增获得23个条带,进一步筛选到18个与ZjERF2互作的候选蛋白。对候选蛋白进行生物信息学分析,初步筛选到5个参与植物的生长发育、抗病原菌及环境胁迫调节的互作蛋白。本研究为探索Zj ERF2在植物生长发育和环境胁迫应答的调控机制提供帮助。     

利用酵母单杂交筛选拟南芥AtSTK基因表达调控蛋白的研究

拟南芥丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因AtSTK的过量表达可以明显提高拟南芥的耐盐性。为进一步研究AtSTK基因表达的调控机制,以拟南芥基因组DNA为模板设计引物,扩增获得AtSTK基因的启动子序列,并构建到报告载体pAbAi,将重组报告载体质粒pAbAi-HYT利用BstbⅠ进行单酶切线性化,转化酵母菌株Y1H Gold,线性化的pAbAi-HYT整合到基因组中。然后,将纯化的拟南芥双链cDNA、pGADT7-Rec载体共转化含有报告载体pAbAi-HYT的酵母菌,将菌液涂布到含有100 ng/m L Ab A的SD/-Leu培养基上进行阳性克隆的酵母单杂交筛选。通过回复鉴定、序列测定,最终筛选获得了可能参与AtSTK基因表达调控的4个拟南芥基因。测序结果表明,酵母单杂交筛选获得的拟南芥基因AT3G32090含有WRKY转录因子保守结构域,为WRKY类转录因子的一员。因此,AtSTK基因的表达很可能接受MAPK信号传导途径中AT3G32090基因编码的WRKY类转录因子的调控,从而影响拟南芥植株的耐盐性。     

芥菜锌指蛋白转录因子基因Bj26的克隆与鉴定

锌指蛋白是一类重要的转录因子家族,参与植物基因转录调节、发育及胁迫反应等生理过程。我们前期研究发现芥菜诱导型启动子BjC-P的W-box-like-4为其真菌诱导的核心元件,本研究通过酵母单杂交技术从芥菜cDNA文库中筛选到与W-box-like-4序列特异互作的转录因子基因Bj26。生物信息学分析表明,Bj26含735 bp的开放阅读框,编码一个新的C2H2型锌指蛋白,包括2个典型的C2H2型锌指结构及2个植物特有的QALGGH氨基酸保守序列,等电点pI为9.2,分子量为26.6 kD。亚细胞定位显示该蛋白位于细胞核。本氏烟瞬时表达分析表明Bj26蛋白通过与BjC-P的真菌诱导核心元件序列特异互作,激活启动子BjC-P。实时荧光定量PCR结果显示Bj26在真菌诱导下表达量明显增高。Bj26的CDS序列与拟南芥和水稻中的C2H2型锌指蛋白序列比对及进化树分析表明,Bj26与拟南芥的C2H2型蛋白同源性高于水稻。以上结果揭示Bj26蛋白可能介导BjC-P真菌诱导响应并参与植物抗真菌病原菌的调控过程。     

小麦Ta-SKP2A克隆及其酵母双杂交诱饵载体的构建

SKP2A是调控细胞周期转录因子降解的F-box蛋白。为研究该蛋白在小麦-叶锈菌互作过程的作用,首先克隆获得中国春小麦Ta-SKP2A全长序列,然后将其与pGBKT7载体连接,转入酵母Y187感受态细胞中,构建酵母诱饵表达载体,并检测其表达产物对酵母细胞有无毒性和自激活效应。结果表明,Ta-SKP2A编码区序列长度为1 146 bp,其ORF区编码一条由382个氨基酸组成的多肽。在ORF区两侧连接酶切位点(EcoRⅠ和Bam HⅠ),并将其与载体pGBKT7连接,成功构建了包含目的基因的诱饵载体pGBKT7-Ta-SKP2A,且含重组诱饵质粒的酵母菌株在SD/-Trp营养缺陷平板上生长良好,其过夜培养物OD6000.8,表明重组诱饵质粒表达产物对酵母细胞无毒性。含重组诱饵质粒的酵母菌株在二缺、三缺及四缺营养缺陷平板上不能生长,表明诱饵质粒的表达产物不能自激活报告基因。成功构建了一个包含Ta-SKP2A的重组诱饵质粒,为深入筛选与其互作的靶蛋白,研究其在小麦-叶锈菌互作体系中的作用机制奠定了基础。     

花生中DREB类转录因子PNDREB1的克隆及鉴定

脱水响应元件结合因子(DREB)是一类对多个抗逆相关基因表达起调控作用的植物特有的转录因子,在植物抗逆能力综合改良方面具有重要作用。本研究通过筛选花生未成熟种子的cDNA文库,分离到一个DREB类基因——PNDREB1(FM955398)。该基因序列长度为687 bp,推测编码蛋白含有229个氨基酸残基,相对分子量为24.7 kD,理论等电点为5.97,与其他物种中该类转录因子序列同源性较高。利用酵母单杂交系统,对花生PNDREB1与DRE元件的特异识别和结合能力及其C-末端转录激活活性进行检测,显示,转入含有该基因及阳性对照基因的载体均可使酵母菌株正常生长,且具有显色反应,而转入空载体的酵母菌株不能生长,证明基因PNDREB1中的AP2结构域具有和DRE元件特异性结合的能力;同时,只有转入含有该基因C-末端片段及阳性对照基因的载体可使酵母菌株正常生长,并具有显色反应,而转入空载体的酵母菌株不能生长,说明其C-末端片段具有转录激活活性,该基因为DREB类转录因子。基因表达模式分析显示,PNDREB1为组成型表达,且被低温强烈、迅速诱导表达,并对干旱胁迫也有一定程度的响应,但对高盐和ABA处理没有响应。     

大豆转录因子基因GmNF-YCa可提高转基因拟南芥渗透胁迫的耐性

植物的核因子Y(NF-Y)是由3个亚基A、B和C组成,在响应非生物胁迫过程中起着重要的作用。本研究以大豆铁丰8号为材料,建立大豆c DNA文库,以p GBKT7-Gm Di19-5为诱饵,通过酵母双杂交技术筛选大豆c DNA文库,获得了大豆NF-Y转录因子家族亚基C的一个成员,命名为GmNF-YCa。该基因全长为864 bp,编码287个氨基酸,属于NF-YC亚家族。GmNF-YCa分子量为31.6 k D,等电点为5.07亲水性蛋白,具有一个跨膜结构域,无信号肽。序列分析表明,NF-YC亚家族具有很高的保守性。GmNF-YCa基因启动子含有ARE、Box4、GATA-motif、Box I、ACE、ABRE和CAT-Box等胁迫和光响应元件。组织特异性分析表明,GmNF-YCa基因在种子萌发期表达量最高。实时定量结果表明,GmNF-YCa受蔗糖和甘露醇的诱导上调表达。使用农杆菌介导法,将大豆GmNF-YCa基因导入拟南芥,并进行了功能分析。发芽率试验分析表明,GmNF-YCa的转基因提高了转基因拟南芥萌发期对渗透胁迫的耐性;改良了在蔗糖和甘露醇处理下转基因拟南芥的根系生长和侧根发育。     

草莓FaMYB10蛋白互作验证及启动子克隆

本研究旨在探究光信号如何调控草莓花青素苷合成的分子机制,利用同源克隆法从3个不同颜色的草莓品种(‘红颜’,‘桃熏’,‘白雪公主’)中分离得到FaMYB10基因及其启动子序列,采用酵母双杂交系统验证FaMYB10的转录激活能力及其与FaCOP1的蛋白互作关系,利用红颜草莓FaMYB10基因的启动子序列构建酵母单杂交诱饵载体pHIS2-ProFaMYB10,并验证其在酵母Y187中的自激活现象。结果表明,经测序显示3个不同颜色的草莓品种FaMYB10基因的CDS区域序列完全一致为702 bp,但是在启动子区域存在不同差异。酵母双杂交实验表明Fa MYB10在Y2HGold中存在转录激活能力,FaMYB10同FaCOP1存在蛋白质与蛋白质互作关系。在Y187宿主内,发现当3-AT浓度达到60 mmol/L无法抑制FaMYB10基因启动子带来的自激活现象。本研究结果为理解草莓通过光信号传导调控下游FaMYB10,进而影响花青素苷合成的分子机制提供一定理论参考。     

猪STAB2基因启动子的克隆及转录活性分析

旨在克隆和分析猪STAB2基因启动子及其转录活性。利用基因克隆、双荧光素酶报告基因系统以及生物信息学分析等方法,克隆得到了STAB2基因转录起始位点上游1 997 bp的候选启动子序列并对其序列特征进行了分析,同时,构建了不同长度的5'端缺失的重组载体并利用双荧光素酶报告基因系统分析了其荧光素酶活性,进而确定了STAB2基因的核心启动子区域及关键调控区域,并对关键调控区域内的转录因子及其结合位点进行了分析。结果表明:STAB2基因的候选启动子区域内包含4个核心启动子和1个Cp G岛;-309--39 bp为STAB2基因的关键调控区域,-1 045--309 bp可能存在一个正向调控元件,而-1 506--1 045 bp可能存在一个负向调控元件; STAB2基因的关键调控区域内包含72个转录因子结合位点,部分转录因子在这一区域具有多个结合位点,如Arnt∶∶Ahr、ZNF354C、Klf4和KLF5,并且,转录因子结合位点之间也存在重合区。为进一步研究猪STAB2基因的表达调控机制以及其在调控猪抗病和肌肉品质中的功能提供了理论依据。