海南吊罗山原始林区抗香蕉枯萎病土壤放线菌的分离及田间防治效果试验

为了从热带原始雨林土壤中筛选得到抗香蕉枯萎病的高效生防放线菌。采用平板对峙培养,盆栽防效和田间防效试验等方法,从海南吊罗山原始林区土壤样品分离的385株放线菌中筛选出了16株对香蕉枯萎病菌具有拮抗活性的放线菌,其中DL-28和DL-24菌株具强抑菌活性。盆栽防治试验结果表明：接种100天后,菌株DL-28和DL-24对香蕉枯萎病的平均防治效果分别达83.65%和76.51%。田间防治试验结果表明;香蕉定植7个月后,菌株DL-28和DL-24对香蕉枯萎病的平均防效达46.5%和60%。     

贝莱斯芽孢杆菌HN-1突变体文库的构建及Arp基因的鉴定

贝莱斯芽孢杆菌HN-1是一株对香蕉枯萎病4号生理小种尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum f.sp.cubense race 4)具有良好抑制活性的生防芽孢杆菌。本研究旨在构建生防菌HN-1的突变体库,在突变体库的基础上深入研究生防芽孢杆菌的抑菌机理,针对香蕉枯萎病的生物防治夯实理论基础。将携带转座子TnYLB-1的温敏型质粒载体pMarA质粒利用化学法转化进入贝莱斯芽孢杆菌HN-1中,通过50℃高温诱导后构建了由1 800个HN-1突变体组成的贝莱斯芽孢杆菌HN-1突变体文库,质粒消除率达99.7%。通过平板抑菌法筛选得到一株对尖孢镰刀菌Foc4的抑制活性降低的突变体,利用反向PCR技术确定插入破坏的基因与贝莱斯芽孢杆菌模式菌株FZB42 arsenic resistance protein (RBAM-550730)基因同源性为99%,在系统进化树中与贝莱斯芽孢杆菌模式菌株FZB42中的该基因属于同一分支。通过筛选鉴定HN-1突变体文库中抑菌活性丧失突变体发现HN-1中Arp基因与生防芽孢杆菌HN-1抑制尖孢镰刀菌的活性有密切的关系。     

2株抗香蕉枯萎病菌链霉菌固态发酵工艺的优化及混合菌载体的选择

将具有抗香蕉枯萎病菌活性链霉菌通过固体发酵的优化,提高其菌丝生长以及孢子产量,并选择合适的吸附载体,为后期的香蕉枯萎病大田生物防治研究提供技术基础。采用单因子和4因子3水平正交试验法优化白刺链霉菌BWL15-4菌株及不吸水链霉菌BWL58菌株的固态法发酵培养基配方,通过单因子试验探讨了初始pH、接种量以及培养温度对2株菌生长情况的影响,并以孢子存活量多少确定了混合菌株的最适载体。BWL58优化后的固态发酵条件为：pH 7.0左右,接种量2%,发酵温度28℃。培养基配方为：无机盐水占大米重量的150%,黄豆粉占大米重量的5%,麸皮占大米重量的20%,沙土占大米重量的30%。BWL15-4优化后的固体发酵条件为：初始pH 6.3左右,接种量3%,发酵温度29.5℃。培养基配方为无机盐水占大米重量的130%,黄豆粉占大米重量的10%,麸皮占大米重量的20%,沙土占大米重量的20%。按照此优化条件进行固态发酵,白刺链霉菌BWL58菌株及不吸水链霉菌BWL15-4菌株孢子含量可分别达到1013 cfu/g和1012 cfu/g数量级以上。从面粉、高岭土、非耕作层土中通过筛选得到了混合菌的最佳填料为非耕作层。当非耕作层土与混合菌以2：1的比例混合时,在常温下保存3个月后,孢子数只降低一个数量级。     

珠海香蕉枯萎病菌遗传多样性的AFLP分析

为了解广东省珠海地区香蕉枯萎病菌(Fusarium oxysporum f. sp. Cubense)的种群分化和遗传变异规律,采用AFLP技术对来自珠海、湛江、台山的20株尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)进行DNA指纹分析,以1株分离自粉蕉的木贼镰刀菌(F. equiseti)为外参。20株尖孢镰刀菌中17株来自珠海,包括3株非致菌、2株香蕉枯萎病1号生理小种、12株香蕉枯萎病4号生理小种,2株来自湛江的为香蕉枯萎病4号生理小种,1株来自台山的为香蕉枯萎病1号生理小种。8对AFLP引物对供试菌株扩增出253条带,其中多态性带97条,占总带数的38.34%,供试菌株的遗传距离变化在0.21~0.99间,平均为0.85。利用NTSYSpc软件中的UPGMA算法构建了21株镰刀菌的AFLP亲缘树状图,聚类结果表明：供试菌株被聚为3个大的类群,分别为1号生理小种、4号生理小种以及非致病性尖孢镰刀菌。亲缘关系分析结果表明：1号生理小种内菌株间的遗传分化大于4号生理小种,其聚类结果与菌株的地理来源有一定的相关性。总体而言,珠海地区香蕉枯萎病菌的遗传多样性较为丰富。     

两株抗香蕉枯萎病菌链霉菌固态发酵条件的优化及混合菌载体的选择

将具有抗香蕉枯萎病菌活性链霉菌通过固体发酵的优化,提高其菌丝生长以及孢子产量,并选择合适的吸附载体,为后期的香蕉枯萎病大田生物防治研究提供技术基础。采用单因子和4因子3水平正交试验法优化白刺链霉菌BWL15-4菌株及不吸水链霉菌BWL58菌株的固态法发酵培养基配方,通过单因子试验探讨了初始pH、接种量以及培养温度对2株菌生长情况的影响,并以孢子存活量多少确定了混合菌株的最适载体。BWL58优化后的固态发酵条件为：pH 7.0左右,接种量2%,发酵温度28℃,培养基配方为：无机盐水占大米重量的150%,黄豆粉占大米重量的5%,麸皮占大米重量的20%,沙土占大米重量的30%。BWL15-4优化后的固体发酵条件为：初始pH 6.3左右,接种量3%,发酵温度29.5℃。培养基配方为无机盐水占大米重量的130%,黄豆粉占大米重量的10%,麸皮占大米重量的20%,沙土占大米重量的20%。非耕作层土与混合菌以2:1的比例混合时,在常温下保存3个月后,孢子数只降低一个数量级。按照此优化条件进行固态发酵,白刺链霉菌BWL58菌株及不吸水链霉菌BWL15-4菌株孢子含量可分别达到1013 cfu/g和1012 cfu/g数量级以上。通过筛选得到了混合菌的最佳填料为非耕作层土。     

豆粕发酵液对香蕉幼苗枯萎病防效的影响

为了研究豆粕发酵液对香蕉枯萎病的防治效果,笔者使用从发酵菌液中分离得到的对香蕉枯萎病病原菌--尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种（Fusarium oxysporum f.sp.cubense race 4,Foc4）有拮抗效果与促生效果（即非抑制效果但对香蕉植株有促生作用）的菌液及混合菌液,分别对香蕉幼苗进行伤根淋菌、未伤根淋菌处理。结果表明：不同试验处理对香蕉枯萎病均有不同程度地防效。其中,使用混合发酵液对未伤根的香蕉幼苗进行淋菌处理,可显著提高超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）的活性,增加游离脯氨酸的含量,降低MDA值,对香蕉枯萎病防效达到94.3%。     

香蕉内生拮抗细菌KKWB-10的分离鉴定及其内生性证明

从香蕉体内分离拮抗香蕉枯萎病菌的内生细菌,旨在应用于香蕉枯萎病的生物防治。从健康香蕉植株的球茎分离到多株细菌,对其进行了拮抗香蕉枯萎病菌4号小种的实验,选择其中1株拮抗性较强的菌株KKWB-10进行了形态特征、生理生化测定、16S rDNA序列分析,并通过浸根法将标记了绿色荧光蛋白GFP的该菌（K-pUCK7-1′GT菌）回接无菌的香蕉组培苗,培养10天后,制备香蕉苗的根和茎的手工切片于激光共聚焦显微镜下观察。抑菌实验结果表明,该菌株对香蕉枯萎病菌4号生理小种有较强的抑制作用。通过形态学观察、生理生化指标测定、16S rDNA序列同源性分析,将该菌株初步鉴定为阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)。激光共聚焦显微镜观察发现经K-pUCK7-1′GT菌液处理的香蕉组培苗的根和茎的切片中均发现绿色荧光,而未处理的对照组的香蕉苗却没有发现绿色的荧光,表明该菌株能定殖于香蕉的根和茎内。该菌株可直接作为生防菌剂,也可用作外源抗病基因在香蕉植株体内表达的载体,在香蕉枯萎病菌的生物防治中具有一定的潜在价值。     

复合生防菌剂防控香蕉枯萎病发生的效果探讨

香蕉枯萎病是由尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f. sp. cubense,Foc)引起的毁灭性土传病害,在国内香蕉主产区持续暴发,使香蕉产业健康发展受到严重威胁和挑战,而利用生防菌进行防治是主要的防治对策和研究热点之一。平板对峙试验表明,自主筛选复配的复合生防菌剂(Trichoderma viride. XP1,Bacillus amyloliquefaciens. XP2)对Foc具有显著的抑菌效果。为进一步验证其作用效果,拟通过盆栽试验探讨复配复合生防菌剂防控香蕉枯萎病发生的效果,为其生物防治机制提供理论支撑。试验采用4个处理,分别为对照(CK)处理,接种灭活Foc4-GFP (100 mL)+灭活复合生防菌剂(500 mL);T1处理,接种Foc4-GFP (100 mL)+灭活复合生防菌剂(500 mL);T2处理,接种Foc4-GFP (100 mL)+复合生防菌剂(100 mL)+灭活复合生防菌剂(400 mL);T3处理,接种Foc4-GFP (100 mL)+复合生防菌剂(500 mL)。测定香蕉植株体内抗氧化酶、细胞壁降解酶的活性和致病毒素含量变化,调查香蕉植株的叶片数、株高、假茎直径、根系长度及发病指数。结果表明,接种复合生防菌剂的处理显著降低香蕉抗氧化性酶和细胞壁降解酶的酶活性(P<0.05)。可显著减少香蕉枯萎病致病毒素在香蕉体内的含量,接种复合生防菌剂的T2和T3处理香蕉假茎中镰刀菌酸(FA)、白僵菌素(BEA)和恩镰孢菌素(EB)的含量分别较T1处理降低93.31%、93.64%、94.71%和94.56%、95.76%、97.87%。接种复合生防菌剂在有效防控香蕉枯萎病发生的同时,可显著促进植株的生长,T2和T3处理香蕉枯萎病防治效果分别达81.7%和95.0%。接种复合生防菌剂能有效防控香蕉枯萎病,使香蕉体内CAT、POD、PAL、CMC、PME活性处于较低水平,极显著降低香蕉枯萎病致病毒素含量,防控效果达81.7%以上。     

胡麻枯萎病生防放线菌的抗菌活性研究

为了筛选对胡麻枯萎病有较好抗性的放线菌,试验对胡麻根围土壤进行了筛选,最终得到1株对胡麻枯萎病病原菌尖孢镰刀菌有较强拮抗作用的放线菌GS2-1.分别测定了它对不同地区分离得到的151株尖孢镰刀菌的抗性,发酵液对孢子和菌丝的抑制作用,研究了其最佳发酵条件,并对发酵液中的抑菌活性物质进行了初步提取和生物活性测定,最后对其在...     

尖孢镰刀菌古巴专化型SIX7基因分析

SIX蛋白编码基因最早由尖孢镰刀菌番茄专化型入侵的番茄木质部蛋白质组中发现,且成功用于区分尖孢镰刀菌番茄专化型的3个生理小种。一些SIX编码基因亦在引起香蕉枯萎病的Fusarium.oxysporum f. sp. cubense（简称Foc）中有报道,为区分Foc不同生理小种或亚型,比较分析了Foc中的SIX7基因序列及其特异性。以现有的SIX7基因序列设计合成引物,通过PCR扩增并测序,比较分析国内不同地理区域及来源于澳大利亚与南非的Foc1、Foc2、Foc3、Foc4共56株菌株中的SIX7基因,并以8个以上其他专化型或其他种或属病原菌共39株菌株分析了SIX7基因序列的特异性。研究发现所设计合成的SIX7基因引物序列仅能从供试的亚热带4号生理小种(ST4)中扩增出663 bp的目的条带。亚热带4号生理小种(ST4)中仅有的SIX7基因序列结合Foc4特异性引物Foc-1/Foc-2可快速区分Foc4亚型,提供了快速区分香蕉枯萎病病样内的Foc4亚型的分子鉴定手段,可指导蕉农及时采取有效防控香蕉枯萎病的措施。     

木薯地下部器官提取物可防治香蕉枯萎病

正香蕉枯萎病是一种由尖孢镰刀菌引起的土传病害,对香蕉产业造成严重的冲击。海南大学农学院、中国热带农科院热带作物品种资源研究所、海南万钟实业有限公司有关研究人员合作,针对香蕉枯萎病难以防控的难题,采用生长速率法,探讨了木薯地上地下部器官的乙醇和水浸提液在不同培养时间对香蕉尖孢镰刀菌的抑菌作用,以便为香蕉枯萎病的防治提供理论依据。     

马铃薯连作地健康株与病株根区土壤微生态特性比较

为探索甘肃省连作马铃薯健康生长的微生态机制,采用常规养分分析法测定了健康株与病株根区土壤中速效氮磷钾含量,稀释平皿涂抹法测定土壤放线菌数量,琼脂块法筛选拮抗放线菌;16S rRNA序列分析法鉴定优势放线菌,发酵液抑菌试验检测优势放线菌灭癌素链霉菌(S. gancidicus)对马铃薯病原真菌的抑菌作用。结果表明,在连作4年的田中：马铃薯病株根区土壤的速效P、K含量分别较健株低29.9%、12.5%,铵态氮含量较健株高24.1%。在高氏1号培养基上,病株根区土壤中放线菌总数、小单孢菌及未鉴定放线菌数量较健株分别减少51.1%、83.0%及53.9%;腐植酸琼脂培养基上,病株根区土壤中放线菌总数、链霉菌数量较健株分别减少46.0%、46.7%。在病、健株根区土壤中,对4株靶标真菌的拮抗潜势SAAP值均病株小于健株。健株根区土壤中的优势放线菌为灭癌素链霉菌(S. gancidicus),该菌对4株马铃薯常见土传病原真菌立枯丝核菌(R. solani)、茄病镰刀菌(F. solani)、硫色镰刀菌(F. sulphureum)及大丽轮枝菌(V. dahliae)均有抑制作用;病株根区土壤中的优势放线菌为加利利链霉菌(S. galilaeus),该菌为马铃薯疮痂病致病菌。由此可知,保持连作马铃薯健康生长的根区土壤微生态特征是,高量磷钾及低量氮的速效养分组合,较多放线菌且拮抗放线菌的拮抗潜势较大,优势放线菌为有益菌。     

香蕉黄叶病的发生及其防控措施

<正>香蕉黄叶病,又称香蕉巴拿马病、香蕉镰刀菌枯萎病、香蕉枯萎病等,是一种毁灭性病害,一旦发生很难彻底根除。该病在我国云南、广西、广东、海南、福建、台湾等省(区)均有分布,严重影响了香蕉产业的持续健康发展。因此,正确识别其发病症状并采取有效防控措施非常必要。一、发病症状1.外观症状香蕉黄叶病从香蕉苗期到成熟期都能发病,     

柑橘绿霉病菌拮抗放线菌MY-5的筛选与鉴定

从广东省各地区水果园和蔬菜地采集土壤23份,采用稀释平板法分离获得放线菌212株。以柑橘绿霉病菌为目标菌,采用抑菌带测定法,筛选获得9株具有拮抗活性的菌株,其中菌株MY-5拮抗活性最强,抑菌带宽达18.67mm,同时对其它13种果蔬采后病害也有较强的拮抗作用。通过对菌株MY-5形态观察、培养特征、生理生化反应和16SrDNA鉴定,该菌株为链霉菌属吸水类群（Streptomyces hygroscopicus）。     

抗香蕉枯萎病甲基营养型芽孢杆菌的鉴定及定殖

为系统评价分离自天然饼肥发酵液4-L-16菌株的抗真菌活性及定殖规律。以尖饱镰刀菌Race 4(Fusarium oxysporum f.sp.cubense Race 4)等9种病原菌为靶标菌株,采用平板对峙、含药介质法检测菌株抗真菌活性,并通过革兰氏染色、形态观察、生理生化特征和16S rDNA序列分析对其进行鉴定。结果表明:4-L-16菌株对9种植物病原菌具有广谱抗性,菌丝生长抑制率可达28.05%~76.07%,孢子萌发抑制率达24.44%~70.00%,其中对香蕉枯萎病菌的菌丝生长和孢子萌发抑制率分别为76.07%和70%,经鉴定该菌株为甲基营养型芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus。经抗生素标记,获得抗600μg/mL利福平的标记菌株,盆栽接种试验表明标记菌在香蕉根际土壤和植株体内具有良好定殖能力,接种第10天土壤中菌量达到最大值为6.67×10~6CFU/g,随时间延长,定殖数量逐渐降低,25天后数量趋于稳定,为2.05×10~6CFU/g。香蕉植株内定殖以根系最多,为4.38×10~3CFU/g。甲基营养型芽孢杆菌4-L-16菌株广谱抗真菌活性、良好的定殖能力,已成为香蕉枯萎病生物防治新的菌种资源。     

短短芽孢杆菌JK-2(Brevibacillus brevis)胞外物质抗香蕉枯萎病菌的稳定性

研究温度、光照、紫外辐射、蛋白酶K、pH对生防菌短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)JK-2胞外物质抗香蕉枯萎病菌稳定性的影响,为香蕉枯萎病生防菌剂的研制提供理论依据。在30℃,170r/min的条件下,恒温振荡培养36h采样制备生防菌短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)JK-2胞外物质,以香蕉枯萎病菌为指示菌,对胞外物质的抑菌特性进行研究。结果表明:该胞外物质具有一定的热稳定性,60~80℃温育1h保持88.5%以上活性,在100℃放置1h后无抑菌活性;在酸性pH3.0~5.0和碱性pH9.0~11.0条件下,抑菌活性保持在77.2%以上,对光照、蛋白酶K、紫外照射均不敏感。其抑菌作用的最适温度为30℃,最适pH为7.0。     

香蕉内生拮抗细菌KKWB-5的几丁质酶在大肠杆菌中的表达纯化与复性研究

将香蕉内生拮抗细菌KKWB-5的几丁质酶在大肠杆菌中的表达,旨在检测该酶对香蕉枯萎病病原菌4号小种的抗性。PCR扩增该基因连入大肠杆菌表达载体pET22b,导入大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导重组菌株,SDS-PAGE分析目的蛋白的表达,对目的蛋白进行纯化,并将纯化后的目的蛋白复性,对复性产物进行水解几丁质活性和拮抗香蕉枯萎病活性的分析。SDS-PAGE分析表明目的蛋白在大肠杆菌中以包涵体的形式大量表达,经变性Ni2+柱纯化得到了高纯度的重组蛋白,表达量达293 mg/L;稀释和透析两种复性方法中,透析复性法的目的蛋白得率较高,为84.6 %。复性后的目的蛋白具有水解几丁质的活性,同时对香蕉枯萎病病原菌也具有一定的抗性,但抗性较弱。该几丁质酶在大肠杆菌中得到高效表达,且复性后的几丁质酶对香蕉枯萎病病原菌4号小种有一定的抑制作用,该酶对KKWB-5菌株拮抗香蕉枯萎病菌的能力有一定的贡献。     

土壤放线菌K2的筛选、鉴定及其抑菌活性初探

筛选具有抑制植物病原菌活性的放线菌是农用抗生素开发的基础。通过平板对峙法筛选出8株拮抗放线菌菌株,采用生长速率法测定获得一株对植物病原菌有较好抑菌作用的菌株K2,并采用抑制菌丝生长速率法对其抑菌谱进行研究,以及进行菌种鉴定。生长速率法试验表明,放线菌菌株K2发酵液对10种供试植物病原菌菌丝生长均有不同程度的抑制作用,其中以对尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)抑制效果最好,抑菌率可达57.38%。根据形态学特征、生理生化特征和基于16S rDNA序列比对,鉴定菌株K2属于链霉菌属(Streptomyces)的一个菌株。放线菌K2的代谢产物具有较广的抑菌谱,对植物病原菌的防治有很大的研究开发潜力。     

一株拮抗辣椒炭疽病菌的放线菌筛选及鉴定

辣椒炭疽病是辣椒生产的主要危害之一,为了更好地防治辣椒炭疽病,采用土壤稀释法从云南等地土壤中分离得到100多株菌放线菌。采用平板对峙实验以及抑菌谱检测,筛选对辣椒炭疽病菌具有较好的拮抗作用的放线菌。结果表明：分离得到的100多株放线菌中,有10株放线菌的发酵液对辣椒炭疽病菌有较强的拮抗作用,其中以18号菌株抑菌效果最好,发酵液稀释10倍抑菌率达到68.2%。通过培养形态特征、生理生化特征,以及16S rDNA序列分析,初步鉴定该放线菌为华丽黄链霉菌(Streptomyces flaveus),其16S rDNA在GenBank的注册号为JX293177。     

香蕉枯萎病发病机制及其防治技术研究

从香蕉枯萎病的病原菌及其发病机制和香蕉抗病机制等多方面阐述了国内外的研究进展,研究表明枯萎病菌的4号小种对中国香蕉生产影响最大,果胶酶和毒素是引起香蕉致病的主要毒力因子,此外,还有一些小分子的成分和作用有待进一步明确。阐述了香蕉枯萎病的防治现状。