东乡野生稻NBS类抗病基因同源片段的克隆及序列分析

根据已知的NBS-LRR 类抗病基因结构中氨基酸的保守区域,设计简并引物,通过RT-PCR扩增及克隆,从东乡野生稻(Dongxiang Oryza rufipogon Griff.)中共获得7个新的NBS-LRR 类抗病基因同源片段.所有7 个抗病基因同源序列均含有NBS-LRR 类抗病基因的保守序列,如P-loop、...     

海南普通野生稻NBS类抗病基因同源序列的分离与分析

利用已知植物抗病基因NBS(Nucleotide binding site)序列中的保守区域设计简并引物,以海南普通野生稻基因组DNA为模板进行PCR扩增,通过T/A克隆、测序和序列分析, 共得到4条具有连续ORF的抗病基因类似物(Resistance gene analogues, RGAs)序列,它们之间核苷酸序列间的相似性系数在53.14%-99.81%之间,而相应推测的氨基酸序列间的相似性系数在39.08%-99.42%之间。氨基酸序列进行结构分析表明,它们包括“P-loop”、“Kinase-2a”、“Kinase-3a”和“GLPL”4个抗病基因所共有的保守模体,并且4条海南普通野生稻NBS-LRR类似物均属于nonTIR-NBS类抗病基因片段。     

小麦STK类抗病基因同源序列的克隆与分析

根据丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶类催化结构域Ⅰ和Ⅷ氨基酸保守序列设计简并引物,以TcLr19、TcLr35和感病对照Thatcher的cDNA为模板进行抗病基因同源序列的PCR扩增,得到了6条通读的抗病基因同源序列(RGAs)Lr19-RGA1、Lr19-RGA2、Lr19-RGA3、Lr35-RGA1、Lr35-RGA2和TC-RGA.在NCBI中用BLASTp比对发现,Lr19-RGA1、Lr19-RGA2、Lr19-RGA3、Lr35-RGA1和Lr35-RGA2编码的氨基酸序列具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(Serine-threonine kinase,STK)的催化结构域Ⅱ-Ⅷ.对序列分析还发现,它们与已克隆的STK类抗病基因有不同程度的相似性,为进一步克隆小麦抗叶锈病相关基因提供了依据.     

香蕉NBS-LRR类抗病基因同源序列的克隆与分析

根据已知植物抗病基因的保守区域设计引物,从香蕉基因组DNA扩增出一条与植物抗病基因同源的序列,命名为BRGA1,该同源片段含有典型的NBS-LRR类抗病基因所拥有的保守性结构p-loop、Kinase-2a、Kinase-3a和疏水结构域HD,它与部分已知NBS-LRR类抗病基因的氨基酸序列同源性为23.8%-42.7%。Northern杂交表明BRGA1在香蕉中受水杨酸调控,属诱导型表达。     

大豆抗病基因同源序列的克隆与分析

本研究根据已知抗病基因的NBS保守序列区设计4对简并引物和1对特异引物，以大豆农家种兴县灰布支黑豆为材料，应用PCR方法获得了11条来自基因组DNA的RGA序列和2条来自cDNA的RGA序列，序列长度在500—633bp之间，其中8条来自基因组DNA和2条来自cDNA的RGA序列已在GeneBank登录(登录号为：AF305388—305392，AY008380—008382，AY048863-AY048864)。13条序列都不同程度的含有NBS保守区的P-环(GGVGKTT)、kinase-2(VLDD)、kinase-3(GSRII)及跨膜区GLPL等特征序列结构，由此推导出的氨基酸序列同已知抗病基因L6、RPMl、SRPS2、N编码的氨基酸序列表现出从25％——42％的同源性。本研究克隆的RGA序列根据其相似性可分为4组，与已发表的大豆抗病类似基因(RLG)具有较高的相似性。     

烟草NBS-LRR类抗病基因同源序列的克隆及分析

通过同源克隆法获得烟草抗病基因同源序列(RGAs),为烟草抗病基因的筛选和相关研究提供帮助。基于抗病基因的NBS-LRR保守结构域,筛选并合成了3对简并引物,扩增烟草中的NBS-LRR类抗病基因。获得了4条与抗病基因具有高度同源性的NBS-LRR类烟草抗病基因同源序列(TRGA,登录号:MK634316,MK634317, MK634318, MK634319),目的片段大小均在500 bp左右;BLAST X分析表明,获得的4个烟草RGAs与已知RGAs具有高度相似性,氨基酸相似性为97%～100%;聚类分析将其分成2大类,包括TIRNBS-LRR和non-TIR-NBS-LRR两类抗病基因,其编码氨基酸序列含有NBS保守区的典型特征基序。通过简并引物进行同源扩增是分离烟草RGAs的有效方法,可为进一步抗病基因筛选及抗病分子育种奠定基础。     

冬瓜抗病基因同源序列的克隆及分析

以已知植物抗病基因的保守区域为基础设计简并引物,从冬瓜抗病材料B227基因组中分离NBS-LRR类抗病基因同源序列,共获得32条特异序列,其中17条具有完整开放阅读框。这17条序列的核苷酸同源性变化范围为56.4%~99.8%,氨基酸的同源性变化范围为46.2%~100.0%。序列相似性分析结果表明,这些冬瓜抗病基因同源序列均包含P-loop,Kinase-2和GLPL等保守结构域。与已知抗病基因构建系统进化树,将这17个序列分为2个亚组,均属于TIR-NBS-LRR类抗病基因。本研究将为抗病基因全长序列克隆、功能分析及定位等研究提供帮助。     

海岛棉NBS-LRR类抗病基因同源序列的克隆与定位

植物R基因产物存在非常类似的结构域，如NBS、L,RR、STK、LZ、TM、TIR等。依据保守序列设计引物寻找抗病基因类似物(Resistance Gene Analog，RGA)，从而定位或克隆抗病基因在理论上是可行的，这种方法称为R基因同源克隆法。RGA往往与已知抗病基因具有很高的相似性，均含有LRR、NBS或蛋白激酶中的保守基序，有的与已知抗病基因连锁，或是抗性基因家族中的成员，抑或与已知抗病基因无关，它们最有可能参与植物抗病反应过程中的信号识别、信息传导等途径，并且与植物抗病基因具有密切的关系，但RGA并非等同于植物R基因。将RGA作为分子标记整合到植物分子连锁图谱中，或将其作为探针筛选基因组文库，获得候选抗病基因则不失为一条克隆基因的捷径。利用已知R基因的保守序列设计引物进行PCR扩增，已经在植物中分离到了许多与已知R基因同源的DNA序列，并且有很多RGA作为标记定位在抗病位点附近，有点被证明与抗病性状共分离。小麦抗叶锈基因Lrl0的分离是利用该方法进行抗病基因克隆的首次报道。本研究依据N，L6，RPS2等NBS类抗病基因的NBS保守区设计简并性引物扩增棉花基因组DNA，在517bp左右获得特异性扩增条带。回收PCR产物，连接转化共得到800个克隆。经酶切筛选、嵌套引物鉴定获得252个候选RGA克隆。测序后获得11条RGA序列，这些序列的大小在500—527bp之间，其中3条序列中含有1或2个终止子。所有11个RGA序列都含有NBS保守区的Kinase海岛棉1a(GGVGKTT)、kinase-2(VLDD)、kinase-3a(GSRII)及跨膜区(GLPLA)等保守结构域，与已知抗病基因的保守结构具有较高的吻合程度。本研究所获得的RGA与大豆、棉花、腰豆等作物中已经克隆的NBS类RGA的核苷酸序列有很高的相似性。其中8条可通读的RGA序列推导出的氨基酸序列同已知抗病基因L6、RPMl、SRPS2、N表现出从25％——58％的相似性。本研究以海陆杂交F2群体作为定位群体，应用RFLP方法将获得的7条RGA序列定位在棉花基因组中。Gbrga2和Gbrga8定位于第11同源群的三个位点：连锁群1302的端点及连锁群A03距端点59．2cM处。在连锁群1302中与pAR286E4C标记定位在同一位点，与Unig22d03bE6D标记相距5．6cM在连锁群A03中与pARlllE3C标记共同定位在端点，同时定位在Unig26804E5D(22D)标记下游1．7cM处和Gate4DB08bE3D(14D)标记上游8．6cM处。Gbrga508和Gbrga535定位于第4同源群的两个位点，D染色体组的第20号染色体上距端点175．3eM处，与Unig27A04E5C标记和M16—118E1C标记分别相距2．7cM和3．8cM；Gbrga508和Gbrga535同时还定位于A染色体组第5号染色体上距端点142．9cM处，与G1025aE5C标记和Gate2CFllE3C标记相距2．6cM和1．2cM。Gbrga522，Gbrga568和Gbrga39定位于第4连锁群D染色体组的第20号染色体上距端点5．5cM处。与Unig24H03E6C标记和P13—6E3D标记分别相距1．0cM和2．0cM。海岛棉RGA的获得、在基因组的定位，对于棉花NBS类R基因的起源和进化，利用分子标记辅助育种以及棉花抗病基因的克隆，提供了重要的背景。     

小麦抗病基因同源序列(RGAs)的克隆与分析

RGA(抗性基因同源序列)法是克隆植物抗性基因的一种经济有效的方法,成为近年来的研究热点。本实验综合分析了拟南芥,西红柿,水稻,烟草等植物已克隆的抗性基因,并以这些抗性基因的NBS(核酸结合位点),LRR(富含亮氨酸重复),STK(丝氨酸/苏氨酸激酶)保守结构域设计并合成了几十对RGA引物,对小麦抗条锈病材料进行PCR扩增,获得以Xal-NBS为引物的R88RGA片段,经克隆和序列比对分析,发现该片段与逆境条件下植物抗病信号传导相关,与蛋白激酶同源性达到96%。此项研究对抗病机理的研究和基因的发掘有重要的指导意义。     

棉花NBS类抗病基因类似物的生物信息学分析

在长期的进化过程中,植物与病原物相互作用,协同进化,形成了复杂的植物抗病机制,现在普遍认为,在分子水平上植物的抗病性是由抗病基因(Resistancegene,Rgene)介导的防御反应。目前已经从11种植物中克隆出40多个抗病基因,序列分析表明它们的产物在氨基酸水平上有相同特征的保守结构域。这为基于同源序列的抗病候选基因的克隆(Homology-basedcandi dategenemethod)提供了理论上的可能性。根据已克隆基因的保守区设计引物,利用PCR技术扩增植物基因组DNA或cDNA,得到的扩增产物经测序和序列对比即可作为抗病基因类似物(Resistancegeneanalo…     

甘蔗NBS-LRR类抗病基因同源序列的分离与鉴定

根据已知植物(拟南芥、烟草和亚麻)抗病基因(RGAs)保守序列设计简并引物, 从甘蔗高抗黑穗病品种NCo376的基因组DNA和cDNA中扩增出11条抗病基因同源序列, 其中5条来自基因组DNA(EF059973, EF059974, EF059975, EF059976和EF059977), 6条来自cDNA(EF155648、EF155649、EF155650、EF155651、EF155652和EF155653)。序列分析表明, 这些RGAs均含有典型的NBS-LRR类抗病基因所拥有的保守结构域P-loop, Kinase-2a, Kinase-3a 和疏水结构域。聚类分析表明, 11条RGA同RPS2和XA1聚为一类, 而N和L6则单独聚为一类。所有11条抗病基因同源序列中, kinase-2(LLVLDDVW/D)最后一个氨基酸皆为色氨酸。定量PCR分析表明, 编号为EF059974的PIC基因的表达不仅受黑穗病菌胁迫的影响, 而且受水杨酸的诱导和过氧化氢的抑制, 也具有抗病基因组织特异性和组成型表达特性。     

植物抗病基因同源序列研究进展

以列表的形式,从引物设计、分离并登录GenBank的RGA数量、在连锁群中的分布、相关联的基因或位点等几方面综述了1995—2005所开展的各项抗病基因同源序列（RGA）研究,并对RGA的结构特征、分布与进化的特点、目前的应用现状、今后的研究前景及应注意的问题进行了评述。     

蒙古冰草基因组类反转录转座子基因同源序列的克隆与序列分析

以蒙古冰草DNA为模板,采用PCR扩增的方法从蒙古冰草(Agropyron mongolicumKeng)中分离得到了一个类反转录转座子基因序列,命名为MwRRT(GenBank:GQ855806.1)。序列分析结果表明:该序列长为1 005 bp,包含780 bp的开放阅读框,编码260个氨基酸。经GenBank中BLAST程序分析表明,该片段98~255处氨基酸与水稻(Oryza sativa)预测逆转录转座子蛋白Ty3-gypsy亚类、预测种属特异抗原—聚合酶(Gag-Pol)前体和预测聚合酶氨基酸同源性为47%;与高粱(Sorghum bicolor)的预测GAG-POL前体氨基酸同源性为52%。     

亚麻荠NBS类抗病基因家族的鉴定与分析

NBS类抗病基因是植物中最大的一类抗病基因。亚麻荠是一种新型能源及特用油料作物,抗病、虫、杂草及逆境能力极强。然而,有关其抗性分子机理鲜有报道。本研究采用NB-ARC标准结构域的HMM模型,对亚麻荠本地蛋白质数据库进行检索分析,在全基因组水平上鉴定NBS类抗病基因。结果表明亚麻荠基因组共有472个NBS类抗病基因,分布于17条染色体上,56%的基因成簇分布。所有串联重复基因也都以基因簇的形式出现,这表明串联重复有利于基因簇的形成。系统发生树分析显示TIR-NBS-LRR(TNL)和CC-NBS-LRR(CNL)两类亚家族的抗病基因可能在进化过程中遵循不同的进化路径,导致其在应对病原菌侵染时发挥不同的功能。本研究发现将为鉴定新的植物抗病基因和解析亚麻荠高抗病机制提供科学参考。     

水稻抗病基因同源序列多态性与品种鉴定

利用已知植物抗病基因不同保守序列设计的S1/AS3和XLRR for/XLRR rev两对引物对22个水稻品种DNA进行PCR扩增和聚丙烯酰胺凝胶电泳.分析结果表明水稻抗病基因同源序列类型丰富,2对引物共扩增出143条带,品种间有差异的谱带92条,根据谱带差异可将供试品种完全鉴别出来.证明抗病基因同源序列分析可以用于水稻品种鉴定.     

小麦NBS类抗病基因类似序列的多样性和进化关系研究

利用已克隆植物抗病基因NBS( Nucleotide binding site)序列中的保守结构P-loop和GLPL合成简并引物,以小麦近等基因系TcLr24基因组DNA为模板进行PCR扩增.得到13条具有连续ORF的抗病基因类似物(Resistance gene analogues,RGAs)序列,它们之间相应推测...     

棉花多抗品种中植棉KV-1抗病基因同源序列的克隆与分析

 许多抗病基因都具有核苷酸结合位点（NBS）和富亮氨酸重复区（LRR）。根据已知的NBS-LRR类抗病基因的保守序列,分别设计一对简并引物和一对特异引物,用以扩增棉花基因组中的抗病基因同源序列。获得一条大小约500 bp的扩增片段,克隆测序后得到10条NBS-LRR类RGAs。推导的氨基酸均具有抗病基因的P-loop（kinase-1a）、kinase-2、kinase-3a及GLPL区。同源性比较发现,其中1条属于TIR-NBS LRR类,其余9条属于non-TIR-NBS-LRR类。1条TIR-NBS-LRR类RGAs与已克隆的N、L6、M等抗病基因的同源性为51%~60%,9条non-TIR-NBS-LRR类RGAs与已克隆的RPS5、RPR1、Xa1等抗病基因的同源性为51%~60%。这些抗病基因同源序列（RGAs）可作为分子标记筛选棉花的抗病候选基因。