香椿TsCCR基因的克隆及表达分析

肉桂酰辅酶A还原酶(CCR)是木质素合成的关键酶,本研究根据香椿转录组数据从太和‘红油椿’中克隆得到1个肉桂酰辅酶A还原酶基因,命名为TsCCR,对其进行了生物信息学分析,并通过荧光定量PCR技术分析了TsCCR基因在香椿幼苗根、茎、叶及低温、高温、干旱、盐4种非生物胁迫条件下的表达特性。结果表明:香椿TsCCR基因含有975 bp的开放阅读框,共编码324个氨基酸,含有FR-SDR-e保守结构域,与柑橘的亲缘关系最近;TsCCR基因在茎中的表达量最高;4℃低温胁迫期间,TsCCR表达量短暂升高后逐渐降低;38℃高温胁迫期间,短暂降低后逐渐升高;200 mmol/L NaCl盐胁迫处理期间,TsCCR表达量在4 h时急剧降低,随后又急剧增加;200 g/L PEG6000干旱胁迫处理期间,TsCCR表达量呈现先下降后升高又下降的趋势。以上结果表明香椿TsCCR基因在香椿抵抗非生物胁迫方面可能发挥调控作用,本试验结果为通过基因工程改良香椿的栽培抗性提供了参考。     

苹果矮化砧木GA20氧化酶基因的克隆及其表达分析

为了研究GA20氧化酶基因在苹果矮化砧木中的分子特征和表达特征,利用RT-PCR方法从苹果矮化砧木2号和36号c DNA中克隆了GA20氧化酶基因(GA20ox1),并对该基因及其编码氨基酸序列以及在不同时期砧木及嫁接品种中的表达分别进行了分析。结果表明,GA20ox1基因c DNA编码序列长1 179 bp,推导编码393个氨基酸(包括终止密码子),预测蛋白相对分子质量44.3 k Da,理论等电点5.89,编码的蛋白质包含GA20ox1基因家族所具有的特征保守结构域,系统进化分析表明该蛋白序列与苹果SH40的同源性达到96.9%。实时荧光定量PCR分析显示:36号砧木在6月份GA20ox1基因表达强度显著低于八棱海棠对照,而7-8月份的均显著高于对照,其上嫁接的品种7月份表达强度显著低于对照。在7-8月份2号砧木及嫁接品种GA20ox1基因的表达强度均显著低于对照。     

石蒜LrCMO基因的克隆及表达分析

以石蒜(Lycoris radiata)为试材,采用同源克隆和RACE的试验方法,克隆得到LrCMO基因全长cDNA,并对其进行了基因表达分析。结果表明:LrCMO基因全长1 472 bp,其中开放阅读框(ORF)为1 281 bp,编码427个氨基酸残基,预测编码蛋白质的分子量为47.92 kD,理论等电点为5.72;LrCMO是一个稳定的疏水蛋白,不具有跨膜结构,含有叶绿体导肽;LrCMO基因编码的氨基酸与植物其他CMO蛋白具有较高的一致性,且与海枣PdCMO、香蕉MaCMO及油棕EgCMO亲缘关系最高,聚为一类。实时荧光定量PCR分析表明,LrCMO在根、鳞茎和叶片中有表达,且在鳞茎中的表达量最高;LrCMO受聚乙二醇(PEG)处理的诱导表达,其基因相对表达量在处理后12 h达到最高。随着处理时间的延长,LrCMO基因相对表达量逐渐下调至对照水平。     

羊踯躅psy基因的克隆及表达分析

[目的]为了研究羊踯躅psy基因的功能及其在花瓣着色中的分子机理,[方法]以羊踯躅花瓣的cDNA为模板,采用RT-PCR和RACE方法克隆得到1 638 bp的psy基因全长cDNA序列,命名为RmPSY (GenKank登录号为KX230461)。[结果]序列分析表明,RmPSY开放阅读框为1 296bp,编码432个氨基酸。羊踯躅PSY为亲水性的不稳定蛋白,无信号肽,属于非分泌蛋白;预测的蛋白质分子量48.91 kD,等电点为8.78。RmPSY与GenBank中收录的其它植物PSY蛋白氨基酸的相似性达到81%。构建系统进化树,结果显示羊踯躅PSY与葡萄PSY蛋白的亲缘关系最近。实时荧光定量PCR结果显示,该基因在羊踯躅花发育的不同阶段均有表达,在花蕾期表达量较低,在初开期表达量最高,盛开期表达量有所下降。[结论]试验结果为进一步揭示RmPSY基因参与调控羊踯躅花色形成的分子机制奠定基础。     

小麦TaSPP基因的克隆及表达分析

为明确磷酸蔗糖磷酸酶基因(SPP)的表达特征和生物学功能,进一步了解SPP参与蔗糖生物合成的调控机制。以小麦抗旱品种晋麦47的cDNA为模板克隆出3个位于第5同源群上的TaSPP同源基因,分别命名为TaSPP-5A、TaSPP-5B和TaSPP-5D。并利用生物信息学对小麦TaSPP的理化性质、基因结构、顺式作用元件、系统进化树和蛋白保守结构域等进行分析,通过qRT-PCR分析基因TaSPP的表达模式。结果表明,TaSPP-5A、TaSPP-5B、TaSPP-5D都包含8个外显子和7个内含子,TaSPP-5A和TaSPP-5D编码422个氨基酸,TaSPP-5B编码413个氨基酸。系统进化分析显示,小麦TaSPP基因与小麦的近缘物种在进化上处于同一分支,相似度较高。qRT-PCR表达分析结果显示,TaSPP基因在根、茎秆、旗叶、叶鞘、颖花、种子中均表达,其中在旗叶和茎秆中表达量较高;ABA、PEG-6000、NaCl和IAA胁迫均能诱导TaSPP基因的表达,表明小麦TaSPP基因可能在逆境胁迫过程中发挥重要作用。     

柠檬F-box基因的克隆及表达分析

本研究以香水柠檬幼嫩叶片为材料,在前期通过De Novo技术获得的F-box基因片段基础上设计引物,利用RT-PCR技术成功克隆出长度为585 bp的F-box基因,命名为LFB1,该基因编码194个氨基酸,该氨基酸序列在N端具有F-box结构域,生物信息学分析表明:该蛋白分子量为48.94 k D,等电点:5.2。进化分析发现其与克里曼丁桔(Citrus clementina)聚在一起。q RT-PCR分析表明:该基因在植株的根、茎、嫩叶、老叶、花蕾、花苞、幼果、成熟果中均有表达,LFB1基因在组织中的表达量是:茎老叶根花蕾成熟果嫩叶幼果;在花的不同器官的表达分析,发现该基因在雄蕊中的表达量最高,其它组织则相对较低,在雄蕊中基因的表达量是其它组织的10倍左右;在逆境胁迫下,该基因的表达量发生明显变化,表明该基因与植株的生长发育、花粉的发育以及环境胁迫可能有着一定的关系。     

苹果属无融合生殖SERKs基因家族的克隆和表达分析

本研究利用同源克隆法以苹果属平邑甜茶和杂种后代叶片为试验材料,克隆得到4个SERK基因家族片段,并分析了SERKs家族基因在平邑甜茶和杂种后代不同器官和组织中的表达情况。研究结果表明:分离获得的4个SERK基因家族片段的氨基酸序列与模式植物拟南芥、烟草等植物的同源性均在84%以上,同时与其他物种的氨基酸序列进行Blast比对都具有较高的同源性;RT-PCR定量分析结果表明SERK1、SERK2、SERK3、SERK4基因主要在生殖器官中表达。因此,推测SERKs基因在平邑甜茶和杂种后代生殖发育过程中起着重要的调控作用。本研究结果为进一步揭示无融合生殖的发生机理奠定了基础。     

ACS基因和HBsAg基因的克隆及瞬时表达分析

本研究通过SDS法从香蕉幼嫩叶片中提取基因组DNA,通过PCR的方法对ACS启动子2.5Kb的序列进行缺失改造,克隆到了长1 185bp的ACS启动子片段,与GenBank报道序列相比较同源性为93.2%.经PlantCARE软件分析发现序列中含有多种调控元件,经预测ACS启动子可能被光、热、GA、乙烯或伤所诱导.为验证其果实特异表达活性,通过插入到pBI 101.2中间表达载体上的GUS基因5＇端前,构建了含GUS基因的瞬时表达载体pBACS.用基因枪法将pBACS转化到香蕉果实中,结果表明：用pBACS包被的金粉轰击的果实经GUS组织化学染色后,都出现兰色斑点,对照没有出现兰色斑点.因此认为GUS基因在香蕉果实成功实现瞬时表达.同时,通过改进的酚-氯仿提取法从乙肝病毒感染者的血清中提取总DNA,然后根据报道的序列设计特异性引物,同时在上游引物中引入了Kozak序列,经PCR克隆到HBsAg基因序列,长度为681bp.NCBI BLAST分析的结果表明,获得的HBsAg基因序列及推导的氨基酸序列与GenBank中所报道的序列的同源率分别为97.2%和97.4%.将经过改造的HBsAg基因替代pBACS中的GUS基因,成功构建了含有ACS启动子和HBsAg基因的香蕉树果实表达载体,为下一步转化香蕉,获得在果实中表达HBsAg蛋白的转基因植株奠定了基础.     

杜仲EuGT2基因的克隆及表达分析

糖基转移酶(glycosyltransferase,GT,EC 2.4.x.y)是植物次生代谢过程中一类重要的结构修饰酶,可参与催化受体分子进行糖基化修饰.本研究以杜仲为材料,基于前期构建的杜仲转录组数据设计杜仲糖基转移酶编码基因EuGT2克隆引物,克隆得到全长为285 bp的EuGT2片段,序列分析表明,该基因可编码...     

花生Rab2基因的克隆及表达分析

Rab2是小GTP结合蛋白家族成员之一,控制着蛋白从内质网到高尔基体的运输,研究发现有些Rab2基因受多种逆境胁迫的诱导表达。为了获得花生Rab2基因,本试验根据拼接的cDNA序列设计1对特异性引物,通过RT-PCR克隆了1个花生Rab2基因。测序结果显示其cDNA含有长636 bp的完整开放阅读框,编码的蛋白含211个氨基酸,推测分子量为23.4 kDa。比对分析发现花生Rab2蛋白与多种生物的Rab2的氨基酸序列具有较高的同源性,荧光定量PCR研究表明AhRab2基因受低温、干旱、盐和植物激素ABA的诱导表达。这为利用基因工程手段调控花生的抗逆性奠定了基础。     

桑树MaMYB308基因的克隆及表达分析

为研究桑树MYB转录因子在桑树非生物胁迫及发育中的功能,本研究以桑树品种'桂优62号'为材料,克隆了桑树MYB转录因子MaMYB308的全长cDNA序列,运用生物信息学手段对其氨基酸序列进行分析,采用酵母单杂交验证其自激活性,采用实时荧光定量PCR方法检测基因在不同组织和非生物胁迫下的表达模式.研究结果显示,MaMYB...     

甜瓜PGIP基因的克隆及表达初步分析

以甜瓜叶片基因组DNA为模板,PGIP基因保守序列设计引物,PCR扩增到1条全长978 bp的目的片段。该基因包含有1个完整的开放阅读框,没有内含子,编码326个氨基酸,其编码的氨基酸序列中含有一段典型的亮氨酸重复序列。序列比对表明:该基因编码的氨基酸序列与GenBank中的PGIP基因氨基酸序列(AAP41199)同源性为100%;RT-PCR表达分析表明,该基因在甜瓜叶、茎、根、果实中表达,在花中不表达。为植物分子抗病育种提供了1条基因资源。     

苦荞麦FtNHX1基因的克隆及表达分析

为深入研究液泡膜Na~+/H~+逆向转运蛋白在植物耐盐中的作用,以耐盐苦荞麦品种川荞1号为材料,利用同源克隆方法得到NHX基因,命名为FtNHX1,并在Gen Bank中注册,登录号为KY438929;序列分析表明,该基因开放阅读框1 662 bp,共编码553个氨基酸,预测蛋白分子量61.24 kDa,等电点5.15。系统进化树分析表明,FtNHX1与拟南芥(AtNHX1)、水稻(OsNHX1)和小麦(TaNHX1)的亲缘关系较近,氨基酸同源率分别为60.22%,58.95%和57.30%;荧光定量PCR分析表明,随着Na Cl胁迫浓度的增加,FtNHX1基因在苦荞麦根部、茎基部和叶片的相对表达量极显著增加,150 mmol/L NaCl胁迫下增加幅度最大,分别比对照增加了254.10%,311.35%和256.18%;Na Cl胁迫下FtNHX1基因在苦荞麦根部、茎基部和叶片的平均表达量分别比对照增加了109.46%,145.67%和155.94%,茎基部和叶片的平均表达量较高,说明苦荞麦FtNHX1基因的表达明显受盐胁迫诱导和调节,FtNHX1基因与苦荞麦的耐盐性有密切联系。     

棉花SNC2基因的克隆及表达分析

以陆地棉(Gossypium hirsutum)TM-1为材料,利用同源克隆技术从棉花中分离出SNC2基因,以actin基因为内参,采用半定量RT-PCR分析该基因在棉花组织中的表达,并采用实时定量RT-PCR分析不同棉花品种经大丽轮枝菌侵染后,SNC2基因在不同时段、不同组织的表达水平。研究分析发现该基因CDS序列长度为1 308 bp,编码435个氨基酸,蛋白的等电点(p I)为6.98,理论分子量为46.93 k D,命名为SNC2,Gen Bank登录号为AOO35322.1,SNC2基因编码多肽链中包含信号肽和跨膜结构域,且亚细胞定位于质膜,编码受体类蛋白。组织表达分析显示SNC2基因在根、侧根、茎、叶和花中均有表达,茎中的表达量较高,而在苞片组织中基本不表达。该基因在接菌后的感病品种军棉1号的根和耐病品种中棉49号的茎中呈现不断上升的趋势,而在两个棉花品种的其他组织中呈现出"升-降-升"的趋势,且在不同抗性的棉花品种中的表达存在差异,暗示SNC2基因可能在不同抗性品种抵御生物胁迫过程中扮演重要角色,研究结果为进一步研究SNC2基因的功能及应用该基因提供帮助。     

越南油茶HMGCR基因的克隆及表达分析

为研究越南油茶(Camellia vietnamensis T. C. Huang ex Hu)中HMGCR (3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶)基因的分子作用机制,本研究采用同源克隆得到HMGCR基因全长并命名为CvHMGCR,对其进行生物信息学分析及表达模式研究。结果表明,CvHMGCR全长1 800 bp,包括一个1 770 bp完整的开放阅读框,编码589个氨基酸,与茶树(Camellia sinensis)、毛柄连蕊茶(Camellia fraterna)、喜树(Camptotheca acuminata)、风铃辣椒(Capsicum baccatum)和三七(Panax notoginseng)的HMGCR蛋白序列相似度均在75%以上,系统发育树显示Cv HMGCR与茶树(Camellia sinensis)、毛柄连蕊茶(Camellia fraterna)和喜树(Camptotheca acuminata)的HMGCR蛋白序列聚为一支。预测其蛋白分子质量为63.1kD,理论等电点为6.37,有两个跨膜螺旋区,属于不稳定疏水性蛋白。序列比对分析表明,CvHMGCR有4个...     

碱蓬PEAMT基因的克隆及表达分析

研究旨在克隆碱蓬的耐逆相关基因——磷酸乙醇胺甲基转移酶(phosphoethanolamine N-methyltransferase,PEAMT)的编码基因,分析PEAMT基因调控机制,为进一步研究PEAMT基因的功能和碱蓬的耐盐机制奠定分子基础。依据GenBank数据库发表的其他物种的PEAMT序列设计简并引物,通过降落PCR法获得碱蓬PEAMT基因全长cDNA,命名为SgPEAMT,生物信息学软件分析其序列特点,荧光定量PCR检测其表达特性。序列分析表明SgPEAMT基因开放阅读框为1485bp,编码494个氨基酸,推测其为亲水性蛋白。保守结构域分析表明,SgPEAMT含有2个独立的S-腺苷甲硫氨酸依赖性甲基转移酶的保守结构域,每个结构域含有4个基序。系统进化树分析确认SgPEAMT与同属的碱蓬属植物亲缘关系最近。实时荧光定量PCR分析显示,盐胁迫或ABA胁迫下碱蓬根、茎、叶中SgPEAMT基因的表达上调,特别是叶中表达量最高。研究结果表明,SgPEAMT基因受NaCl和ABA诱导表达,预示SgPEAMT基因可能在碱蓬对盐胁迫的反应中起重要作用,是一种参与碱蓬耐盐反应的有效耐逆基因,为植物基因工程提供有效的耐逆基因。     

木薯MeAnn1基因的克隆及表达分析

以华南8号木薯为材料,采用RT-PCR技术,克隆得到1个具有完整阅读框的木薯膜联蛋白基因,命名为MeAnn1(Gen Bank序列号为:KM975562),该基因CDS序列长度为951 bp,编码317个氨基酸。生物信息学分析发现,其理化性质、蛋白保守结构域及多个蛋白功能位点与已报道的植物膜联蛋白一致。进化树分析表明,木薯MeAnn1与Ptr Ann6、At Ann1、At Ann2、At Ann6和Ann Bj1具有较近的亲缘关系,具有59.9%~84%的序列相似性。细胞定位结果表明MeAnn1蛋白主要定位于细胞质和细胞核中。实时荧光定量PCR分析表明,木薯膜联蛋白基因MeAnn1的表达受多种非生物胁迫的诱导,其中低温胁迫下基因表达量上调幅度最大,为对照表达量的24倍;但对H2O2胁迫不敏感。本研究结果有助于进一步研究MeAnn1基因的功能及木薯抗逆的分子机理。     

葡萄VvMSA基因的克隆及表达特性分析

为了解VvMSA基因的功能,以抗性葡萄品种Vidal Blanc组培苗为试材,克隆得到VvMSA基因,对其序列进行了生物信息学分析,并利用实时定量PCR分析了其组织表达特性和多种非生物胁迫和信号应答表达特性。结果表明,VvMSA基因片段大小为450 bp,编码149个氨基酸序列。生物信息学分析结果显示,VvMSA蛋白分子量约为16.703 k Da,等电点为5.68,不稳定系数为41.71,推测为不稳定蛋白。VvMSA含有65个氨基酸组成的ABA/WDS保守结构域。在进化上属于单独一个分支,它和已报道过的番茄Le ASR1分别属于同一个祖先进化出的2个分支。实时荧光定量PCR分析显示,VvMSA在葡萄不同组织中均有表达,花中表达量最高。多种逆境胁迫因子如盐、干旱和低温等能诱导VvMSA不同程度的上调表达,盐胁迫3 h时诱导表达量最高。同时,VvMSA受逆境胁迫信号分子NO和H_2S不同程度诱导表达上调,而SA则抑制VvMSA表达。激素ABA、GA_3、IAA和ET均能不同程度诱导VvMSA表达上调,并且VvMSA盐处理下的表达模式与ABA诱导的类似。综合以上结果推断VvMSA可能通过调控ABA信号途径来调节葡萄对盐胁迫应答。     

甜瓜CmDWF1基因的克隆及表达分析

油菜素内酯是调节植物生理活动的重要植物激素,DWF1是油菜素内酯合成途径中重要的合成酶之一。为了研究油菜素内酯合成酶基因DWF1在甜瓜果实发育过程中的功能,从甜瓜中克隆得到CmDWF1基因,并对该基因及其编码蛋白进行了生物信息学分析。利用实时荧光定量PCR方法分析了该基因在甜瓜不同组织器官中的表达。结果表明:CmDWF1基因的开放阅读框片段长为1 701 bp,编码566个氨基酸,预测其编码蛋白的分子质量为66.115 11 ku,理论等电点为6.96,不稳定指数为48.18,总平均亲水性为-0.402,属于亲水性蛋白。CmDWF1蛋白含有FAD-binding-4结构域,推测其具有FAD氧化还原酶特性。该蛋白信号肽序列,在细胞质中的定位系数为9,推测其主要在细胞质中分布。二级结构预测显示,CmDWF1蛋白中α-螺旋的含量相对较高,为37.81%。系统进化分析表明,CmDWF1蛋白与黄瓜的亲缘关系较近;实时定量PCR结果表明,该基因在甜瓜的根、茎及叶中均有表达,但在根中表达量最高,并且在甜瓜果实授粉后25 d内表达量有明显的上升,35～45 d内表达量呈下降趋势。由以上结果可知,CmDWF1基因可能参与甜瓜油菜素内酯的合成,并进一步调节甜瓜的生长发育。