棉花根系总蛋白质提取及双向电泳方法的改良

对棉花根系蛋白的双向电泳提取技术进行改良,以获得更好的分离效果,为棉花根系蛋白质组学研究奠定基础。以鲁棉研28为材料,分别采用TCA/丙酮法、改良TCA/丙酮/SDS法、饱和酚-甲醇醋酸铵法这3种根系蛋白质提取方法,提取棉花幼苗根系总蛋白,并进行双向电泳进行蛋白质分离。在蛋白质含量、蛋白纯度和电泳图谱等方面对3种方法进行比较。利用饱和酚-甲醇醋酸铵提取法提取的棉花根系蛋白,其蛋白样品纯度高,SDS-PAGE电泳图谱清晰,蛋白点数量最多为601个点;TCA/丙酮法提取得到的蛋白总量最高约为7.53 mg/g,但样品纯度低,SDSPAGE电泳图谱模糊,蛋白点数量最少为417个点。采用考马斯亮蓝染色,上样量为1 500μg获得的凝胶图谱效果较好。总之,适合棉花根系蛋白质提取的方法为饱和酚-甲醇醋酸铵法,在考马斯亮蓝染色蛋白质上样量为1 500μg时能获得优良的分离效果。     

适用于蛋白质组分析的粉红单端孢菌蛋白提取方法的建立

为了优化一种适用于粉红单端孢菌双向电泳的蛋白质提取方法,以期为蛋白质组学水平研究粉红单端孢菌的致病机制奠定基础。以分离纯化后的粉红单端孢菌为试验材料,分别采用超声-TCA-丙酮、超声-磷酸-TCA-丙酮、超声-SDS、超声-TCA/丙酮-酚/SDS联合抽提和TCA/丙酮-酚/SDS联合抽提等5种方法提取菌体蛋白质,通过对比分析蛋白质含量以及纯度筛选出2种较好的提取方法。在筛选聚丙烯酰胺电泳凝胶浓度的基础上,再通过双向电泳对比分析,得出最佳的蛋白质提取方法。结果表明,12%的聚丙烯酰胺凝胶浓度获得的单向电泳图谱背景清晰且无严重的拖尾现象,超声-TCA/丙酮-酚/SDS联合抽提法获得蛋白样品的质量浓度和含量分别为6.650 mg/mL和2.993 mg/g,该法提取蛋白通过SDS-PAGE分析条带清晰,双向电泳分析可获得1 238个独立清晰的蛋白点。由此可知,超声-TCA/丙酮-酚/SDS联合抽提法获得的粉红单端孢菌体蛋白适合于双向电泳分析及蛋白质组学研究。     

甜菜双向电泳体系条件的优化

为了获得甜菜叶片双向电泳中蛋白质最佳提取方法,建立甜菜叶片蛋白质双向电泳最佳的双向电泳体系。以甜菜叶片为材料,通过比较分析,研究甜菜叶片总蛋白提取方法、IPG胶条pH值及其对应上样量等因素对甜菜叶片蛋白质双向电泳结果的影响。结果表明:酚提取法、TCA/丙酮提取法和可溶性蛋白提取法3种蛋白提取方法中TCA/丙酮法提取效果较好,pH值4~7与pH值5~8的双向蛋白电泳比较发现:pH值4~7胶条蛋白点清晰且在图谱上的蛋白点分布均匀,无蛋白点集中现象,更适合甜菜叶片的蛋白质组分析。采用7 cm线性固相IPG胶条进行双向电泳,150μg上样量蛋白点明显增多,双向电泳效果更好,pH值4~7的17 cm胶条300μg上样量胶点更多更清晰,试验结果为甜菜蛋白质组学的研究提供了最佳的试验方法。     

圆果种黄麻功能叶总蛋白提取方法及双向电泳体系的优化

蛋白质提取方法和电泳条件是蛋白质组学研究中双向电泳的关键。本文初步建立起一套适合圆果种黄麻功能叶总蛋白双向电泳(2-DE)分析的高效提取方法及电泳条件,在双向电泳技术中,比较了TCA丙酮、Tris-base/丙酮、Tris-HCl的蛋白提取方法,并优化了上样量和样品制备方法。结果表明, TCA丙酮法提取蛋白质产量高,达79.0 mg g^–1,比Tris-base/丙酮法和Tris-HCl的产量分别高出44.2%和114.1%。该法得到的2-DE图谱背景清晰,蛋白点数最多,约602个,较其他两种方法更适合用于黄麻功能叶总蛋白双向电泳分析;350 mg为最佳上样量。这为黄麻蛋白质组学后续研究奠定了基础。     

苹果叶片蛋白质双向电泳样品制备方法的比较

为探索适用于苹果叶片蛋白质组学研究的样品制备方法,比较了三氯乙酸/丙酮沉淀法（TCA）、酚-甲醇/醋酸铵沉淀法和Tris-HCl提取法等3种总蛋白质的提取方法。制备的样品经双向电泳分离采用银染显色。结果3种方法分别得到450、374和1032个蛋白质点。认为Tris-HCl提取法为最适方法,所得图谱背景清晰,蛋白质信息量最大。     

玉米蛋白质组研究中双向电泳技术条件的优化

为了优化玉米叶片双向凝胶电泳技术条件,通过比较3种总蛋白提取方法对玉米双向电泳结果的影响,并对蛋白质上样量、IEF等电聚焦条件及SDS-聚丙烯酰胺凝胶浓度等参数进行探索、优化;结果发现,与酚提取法和磷酸缓冲液法相比,采用改进的TCA/丙酮法提取总蛋白操作简单、方便,所得的2-DE图谱中蛋白质点数量多、背景清晰,是一种适用于提取玉米苗期叶片总蛋白的有效方法;同时筛选出:第一向IEF等电聚焦样品上样量为800μg,聚焦条件为20 000 V/h,在浓度为12.5%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳,能够在17 cm的IPG胶条上获得背景低、分辨率较高、重复性好的双向电泳图谱,该优化体系适用于玉米叶片蛋白质组双向电泳分离,对玉米蛋白质组学研究具有重要参考价值。     

毛尖紫萼藓(Grimmia pilifera)总蛋白质双向电泳体系的建立

为开展毛尖紫萼藓(Grimmia pilifera)的蛋白质组学研究,本研究对毛尖紫萼藓(Grimmia pilifera)总蛋白质提取方法和双向电泳参数进行了筛选和优化,以期建立适合毛尖紫萼藓蛋白质双向电泳的实验体系。分别采用Tris-酚抽提法和TCA-丙酮法对毛尖紫萼藓总蛋白质进行提取,比较分析了两种蛋白质提取方法的效果,并研究了IPG胶条的pH范围及蛋白质电泳上样量等因素对毛尖紫萼藓蛋白质双向电泳结果的影响。结果发现,在SDS-PAGE电泳结果中,与TCA-丙酮法相比,Tris-酚抽提法提取的蛋白质条带清晰,数目较多,完整性较好;在双向电泳结果中发现,与pH值为3~10的IPG胶条相比,使用pH值为4~7的IPG胶条的双向电泳图谱蛋白质点清晰且分布均匀,更适合毛尖紫萼藓的蛋白质组学分析;使用24 cm的pH值为4~7胶条,上样1200μg蛋白质时,电泳结果中可分辨的蛋白质点最多,且形状规则,水平和垂直拖尾情况较轻,图像清晰。本研究基于Tris-酚抽提法建立的毛尖紫萼藓蛋白质双向电泳体系获得的蛋白质样品质量好,电泳分辨率高,为毛尖紫萼藓进一步的蛋白质组学研究提供理论参考。     

蓖麻种子蛋白质双向电泳优化体系的建立

为建立蓖麻种子蛋白质双向电泳优化体系,本研究以‘2129’品系蓖麻种子为试验材料,采用2-DE技术的方法,对其进行研究。结果表明:酚提取法比TCA/丙酮沉淀法更适宜提取蓖麻种子的总蛋白质;24 cm pH 3-10NL的干胶条比pH 4~7的干胶条更适宜应用在蓖麻种子的2-DE电泳中;对蛋白质样品进行除杂比不除杂得到的蛋白质图谱更加清晰,且横条纹和纵条纹都有所减少;蛋白质上样量为800μg时获得的蛋白质图谱最佳。本研究将为蓖麻种子蛋白质组学的研究提供基础数据和技术支持。     

玉米籽粒蛋白质双向电泳技术体系的优化

为了获得玉米籽粒双向电泳中蛋白质提取的最佳方法,建立最佳的玉米籽粒蛋白双向电泳技术体系,对酚抽提法、三氯乙酸/丙酮沉淀法(TCA/丙酮沉淀法)和可溶性蛋白提取法3种不同提取方法得到的蛋白质进行了分析,并在相同条件下进行双向电泳比对分析,结果表明:可溶性蛋白提取法获得的蛋白纯度高、浓度适中、双向电泳蛋白质点最丰富,最适合双向电泳研究;利用可溶性蛋白提取法获得的蛋白,对第一向等电聚焦参数等条件,以及不同p H值范围的IPG预制凝胶条进行了比较分析,结果表明:采用p H值3~10的IPG预制凝胶条时,采取电压梯度上升的方式,总聚焦70 000 Vhs、上样量800μg效果最佳,采用p H值4~7的IPG预制凝胶条时,总聚焦80 000 Vhs、上样量900μg效果最佳,并且采用p H值4~7的IPG预制凝胶条相比p H值3~10的凝胶条能分离到更多的点,最后结合蛋白质点MALDI-TOF-TOF质谱鉴定分析,建立了一套适用于玉米籽粒的蛋白质双向电泳技术方法,即采用可溶性蛋白提取法提取蛋白,采用24 cm、p H值4~7的IPG干胶条,上样900μg电泳效果最佳,等点聚焦程序:500 V、1 h,1 000V、1 h,2 000 V、1 h,4 000 V、2 h,8000 V、4 h,8 000 V、80 000 Vhs,500 V保持。试验研究为后续玉米籽粒发育差异蛋白研究奠定了技术基础。     

水稻种子蛋白双向电泳方法的建立和质谱初步分析

为了建立适用于水稻(Oryza sativa L.)种子蛋白质组分析的双向电泳方法,本研究比较了三氯乙酸/丙酮法和改良的酚提取法对水稻种子蛋白的提取效果,不同蛋白提取液上样量、不同p H梯度(p H 3~10和p H 4~7)IPG胶条对水稻种子蛋白的分离效果。结果表明:在目前的双向电泳体系下,采用改良的酚提取法,24 cm p H 4~7线性IPG胶条,上样量1 200~1 500μg的条件可以获得分辨率高、重复性好、胶内蛋白点适用于后续质谱分析的双向电泳图谱。最后本实验通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF-MS)对10个随机挑选的胶内蛋白质点进行了初步蛋白质鉴定分析,进一步确定了改良的酚提取法可以适用于水稻种子蛋白质双向电泳分析。     

绿盲蝽取食诱导赤霞珠冬芽全蛋白双向电泳体系的建立与优化

建立绿盲蝽取食胁迫下赤霞珠冬芽防御反应的蛋白质组学双向电泳技术体系,旨在为后续筛选和分析差异蛋白相关研究提供参考。选取赤霞珠葡萄冬芽,分别设置绿盲蝽取食胁迫和空白对照试验,于24 h后采集样品用液氮带回,-80℃冻存;利用TCA-丙酮法、TCA-丙酮法+酚抽提法提取粗蛋白干粉;利用CBB G-250染色法进行蛋白质浓度测定;确定上样量及凝胶染色技术。扫描得到凝胶图像,进行对比分析。结果显示,利用不同蛋白质提取方法均可获得双向电泳所需粗蛋白,采用TCA-丙酮法获取的粗蛋白量明显多于TCA-丙酮法+酚抽提法;2种方法所提取的全蛋白浓度差异较大,TCA-丙酮法操作更为简便,蛋白丢失少。不同上样量对双向电泳图谱效果的影响差异显著,400μg蛋白上样量比800μg所得的凝胶图片上的蛋白点清晰,易于分离。考马斯亮蓝染色结果表明,R-350更适用于葡萄冬芽全蛋白双向凝胶电泳技术。利用TCA-丙酮法抽提蛋白,400μg蛋白上样,pH值4～7 NL 17 cm的IPG胶条,G-350热染色双向电泳技术体系得到的赤霞珠冬芽全蛋白凝胶图谱,符合绿盲蝽取食诱导赤霞珠防御反应产生防御蛋白的检测要求。     

甜瓜叶片蛋白的提取和双向电泳体系的优化

为建立适合甜瓜(Cucumis melo L.)叶片蛋白质组分析的双向电泳体系(2-D),以甜瓜植物叶片为试验材料,比较了2种不同植物叶片蛋白的提取方法,并对双向电泳的2个重要的环节技术即聚焦参数和上样量进行了优化。结果表明：与Tirs-酚提取法相比,使用改良后的Mg/NP-40/PEG3350/TCA丙酮提取法提取叶片蛋白,经过SDS-PAGEF分析之后,所得的蛋白含量较高,Rubisco酶去除的较好,条带清晰。采用 pH 3~10,18 cm的IPG胶条进行双向电泳时,适当增加低电压聚焦时间,得到了较为清晰的2-D图谱。蛋白上样量为800 μg时,得到的蛋白点数最多,低峰度蛋白较为清晰。研究建立了适用于甜瓜叶片蛋白分析的双向电泳体系,得到了蛋白点数目多且分辨率高的双向电泳图谱。为下一步在蛋白组学水平上分析与甜瓜抗病、产量、性状等相关蛋白提供了技术支持。     

棉花叶片蛋白质组双向电泳技术的优化

 以棉花叶片为材料,针对试材中含有大量色素、酚、醌等干扰物质的问题,从蛋白提取方法、裂解液成分、上样量等方面对棉花叶片蛋白质组双向电泳技术进行优化。结果表明：采用改良的TCA/丙酮法提取棉花叶片总蛋白,含有7 mol·L^-1尿素、2 mol·L^-1硫脲、4% CHAPS、80 mmol·L^-1 DTT、1 mmol·L^-1 PMSF、0.3%载体两性电解质的裂解缓冲液,上样量为600 μg,采用pH 4～7、24 cm的IPG胶条进行双向电泳时,2-DE图谱的蛋白点分布均匀、清晰且重复性好。本体系为开展棉花蛋白质组学研究奠定了技术基础。     

适用于花叶唐竹叶片总蛋白的双向电泳体系的建立

本研究以花叶唐竹二年生苗木的健康叶片为材料,采用3种不同的蛋白质提取方法(酚法, TCA-丙酮法, TCA-丙酮/酚法)、不同的上样量、不同p H值IPG胶条及不同等电聚焦方案等因素进行筛选和优化,以期获得最佳的花叶唐竹叶片总蛋白的提取方法,并建立适用、高效的花叶唐竹蛋白质双向凝胶电泳技术体系。结果表明,选择TCA-丙酮/酚法的蛋白得率高、纯度高,选择17 cm pH 5～8的线性IPG胶条,450μg的上样量以及60 000 Vhs的等电聚焦强度进行双向电泳,共检测到726个蛋白点,整体分布均匀,分离效果较好。本研究初步建立了花叶唐竹蛋白质双向电泳体系,有助于后续研究叶片呈色机理提供技术帮助。     

籽粒苋根系蛋白的提取与双向电泳体系的建立

本研究以籽粒苋根为试验材料,比较3种不同蛋白提取方法对蛋白质双向电泳的影响,并对其中的蛋白上样量和等电点聚焦时间进行了优化。结果表明:与酚抽提法和TCA-丙酮法相比,Tris-Hcl法提取籽粒苋根系蛋白效果较好;上样量800μg和聚焦时间70 000 Vh的条件下会得到理想的双向电泳图谱。采用优化后的条件,可以得到蛋白点数量多、背景清晰的双向电泳图谱,将为下一步镉胁迫下籽粒苋根系蛋白质组学研究及利用分子育种技术培育耐镉的籽粒苋新品种提供技术资料。     

水稻根系蛋白质提取方法的改良

提取出高纯度的根系蛋白质是获得分离效果好、清晰度高的水稻根系蛋白质双向电泳图像的关键。本研究以水稻六叶期幼苗根系为材料,运用改良的TCA/丙酮/SDS法和TCA/丙酮法、TCA/丙酮/Tris-HCl对水稻根系蛋白质进行抽提,进行蛋白质双向凝胶电泳。结果表明:改良的TCA/丙酮/SDS法适用于水稻根系蛋白质组研究,并且350μg上样量获得的双向凝胶电泳图像更为清晰、重现性好,具有较好蛋白质分离效果。     

适合双向电泳的植物全蛋白提取方法比较

样品处理是双向电泳实验最基础也是最关键的环节之一,样品制备成功与否直接关系到双向电泳图谱的质量和蛋白质组信息的完整性。应用于双向电泳中提取植物全蛋白的常用方法有：TCA-丙酮沉淀法、Tris-HC1法、酚法、Trizol沉淀法、Tris-丙酮-酚法、尿素/硫脲提取法。不同的方法适合不同特征的植物样品,比较了用于双向电泳的六种植物全蛋白提取方法的优缺点,并对每种方法适用的植物组织作了简要概述。     

薄皮甜瓜果实总蛋白质双向电泳优化体系的建立

为建立适宜的薄皮甜瓜果实总蛋白质双向电泳的试验体系,以‘京蜜11号’薄皮甜瓜为试材,从果实总蛋白质的提取方法、等电聚焦条件、IPG胶条梯度等方面进行了探索优化。结果表明,酚-甲醇/醋酸铵沉淀法能够高效的提取薄皮甜瓜果实总蛋白质,选用24 cm pH 4~7的IPG胶条,800 μg上样量,120000 Vhs聚焦,SDS-PAGE电泳后采用胶体考马斯亮蓝染色。该优化的体系可以获得背景清晰、分辨率高、重复性好的双向电泳图谱。     

西瓜根系蛋白质双向电泳体系的建立及优化

为建立高效、稳定的西瓜根系蛋白质双向电泳技术体系,对西瓜根系蛋白质样品等电聚焦(IEF)条件、样品上样量、IPG胶条p H值范围、染色方法等参数进行优化。结果表明,采用TCA/丙酮法提取西瓜根系总蛋白,裂解液组成为7 mol/L Urea、2 mol/L Thouirea、4%CHAPS(m/V)、1%Cocktail(V/V)、65 mmol/L DTT、2%p H值4~7 IPG Buffer,上样量为800μg,p H值4~7 IPG(13 cm)胶条、IEF条件为48 000 Vh,分离胶浓度为12.5%,CBB-R250染色时,可获得分辨率高、重复性好的双向电泳图谱,该技术条件为适合西瓜根系蛋白分离的较优双向电泳体系。     

陆地棉花药蛋白质组分析中双向电泳技术体系的建立与优化

建立了适用于陆地棉花药蛋白质组研究的双向电泳技术.以陆地棉花药为材料,采用液氮研磨的方法破碎组织,然后用三氯乙酸(TCA)/丙酮沉淀法和苯酚抽提结合甲醇/醋酸铵沉淀法提取蛋白质.采取载体两性电解质pH梯度等电聚焦/SDS-PAGE和固相pH梯度等电聚焦/SDS-PAGE双向凝胶电泳,对陆地棉花药总蛋白质进行了分离.通过...