基于全基因组序列的黄瓜绿斑驳花叶病毒重组和系统发育分析

 通过RT-PCR扩增了黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)济南分离物(CGMMV-JN)的基因组片段。序列测定结果表明CGMMV-JN基因组全长6 424核苷酸(nt),5′-和3′-UTR分别为60和176 nt,含有4个ORF,分别编码129 kDa和186 kDa复制酶相关蛋白、29 kDa移动蛋白及17.4 kDa外壳蛋白。CGMMV-JN与另外29个CGMMV分离物全基因组核苷酸序列一致率为90.0%~99.7%。重组分析发现韩国KOM(AF417243)、以色列EC(KF155231)、印度(DQ767631)和我国河北的CHB(KJ658958)4个分离物在RdRp编码区存在重组。系统发育分析结果表明,这些分离物可分成3个组。选择压力分析结果表明cp基因处于正选择,其它基因处于负选择。本文研究的结果为黄瓜绿斑驳花叶病毒的监测及防控提供了理论依据。     

MNSV p42与寄主因子3-HIBADH互作

甜瓜坏死斑点病毒(melon necrotic spot virus,MNSV)是侵染甜瓜的重要病毒之一,为害严重.为了明确MNSV的致病机制,本研究以pGBK-p42为诱饵载体,利用Mating的方法从感染MNSV的甜瓜cDNA文库中筛选出6个与p42互作的寄主因子,进一步利用酵母双杂交系统、双分子荧光互补技术(Bi...     

水稻瘤矮病毒广东分离物基因组第10组分的序列分析及原核表达

 应用RT-PCR技术克隆了水稻瘤矮病毒(Rice gall dwarf virus,RGDV)广东分离物基因组的第10片段,并测定了全序列。结果表明,RGDV广东分离物S10(登录号EF532325)全长1198bp,含有一个ORF,编码一条由320氨基酸组成、推测分子量约36kDa的多肽。与泰国分离物相应组分相比,基因结构基本一致,核苷酸和氨基酸序列同源性分别为96.2%和98.8%;S10编码多肽与水稻矮缩病毒(Rice dwarf virus,RDV)s9编码蛋白及伤瘤病毒(Wound tumor virus,WTV)S11编码蛋白也分别具有29%和33%的相似性。本研究还将S10cDNA克隆至原核表达载体pET28b(+)上,通过IPTG诱导在大肠杆菌BL21(DE3)中得到了高效表达,并利用His,Bind树脂纯化得到电泳纯级制品。本工作为进一步研究S10编码蛋白的结构与功能奠定了一定的基础。     

两种甜瓜病毒寿光分离物的分子检测与鉴定

甜瓜坏死斑点病毒(Melon necrotic spot virus,MNSV)及瓜类褪绿黄化病毒(Cucurbit chlorotic yellows virus,CCYV)近年来在瓜类种植区均大面积发生,危害较为严重,已成为制约甜瓜生产的重要因素。本研究广泛收集疑似感染MNSV及CCYV的甜瓜病叶,从中提取植物总RNA进行RT-PCR扩增,将产物分别连接到pEASYT1Simple克隆载体上,对含有目的片段的重组子进行测序及比对分析。结果显示得到了与预期结果一致的DNA序列,其扩增产物大小分别为673bp(MNSV)和877bp(CCYV)。同源性分析结果表明,MNSV和CCYV寿光分离物的核苷酸序列与中国其他地区或一些国家已报道的分离物同源性达99%~100%。     

黄瓜绿斑驳花叶病毒北京和山东分离物的生物学测定及其基因组比较

为揭示黄瓜绿斑驳花叶病毒的分子流行学特征,通过RT-PCR和cDNA克隆技术获得并分析了从北京甜瓜和山东西瓜上分离的2个黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV)分离物CGMMV-Beijing和CGMMV-Shandong的全序列.结果表明CGMMV-Beijing和CGMMV-Shandong的基因组分别由6423和6427个核苷酸组成,包括5'及3'端非编码区和4个开放性的阅读框,分别编码129kDa和186kDa复制相关蛋白、29kDa的移动蛋白及17.4kDa的外壳蛋白.寄主范围测定显示在供试的6科11种植物中CGMMV-Beijing和CGMMV-Shandong均可侵染葫芦科的葫芦、南瓜和西瓜以及茄科的本氏烟和藜科的苋色藜,不侵染供试的其它植物.CGMMV-Beijing和CGMMV-Shandong基因组的核苷酸同源性为99.5%,186kDa蛋白的核酸和氨基酸同源性分别为99.7%和99.8%,移动蛋白的核酸和氨基酸同源性分别为99.3%和98.1%,外壳蛋白的核苷酸同源性为100%.多序列比对分析结果显示,CGMMV的各分离物之间的分子差异并不明显,核苷酸同源性均在98%以上.将CGMMV-Beijing和CGMMV-Shandong与侵染葫芦科植物的烟草花叶病毒属其它成员比较,结果显示其亲缘关系较远,基因组的核苷酸同源性介于56.7%～59.6%,外壳蛋白的氨基酸同源性在44.7%～54.0%之间.综合分析显示,CGMMV分离物之间的差异并不明显,可能具有共同的侵染来源.     

甜瓜坏死斑点病毒广西分离物近全基因组序列克隆及分析

正甜瓜坏死斑点病由甜瓜坏死斑点病毒(Melon necrotic spot virus,MNSV)引起,最早报道于日本(Kishi,1966),中国于2008年首次在江苏省海门市的甜瓜上发现,随后在山东省寿光、泰安等市陆续被报道,严重影响瓜类的品质与质量。吴会杰和古勤生(2017)分析了MNSV-HM和MNSV-Shangdong甜瓜分离物基因组,进化分析结果显示二者亲缘关系较近,可能具有相同来源。近年来,广西壮族自治区甜瓜生产发展较快,病毒病发生有逐年加重之势,因此本研究     

烟草坏死病毒A大豆分离物的分子鉴定

 对曹琦和濮祖芹早期分离到的烟草坏死病毒大豆分离物的生物学、血清学和外壳蛋白的序列进行了进一步研究。该分离物能侵染8科29种植物, 除系统侵染大豆和本生烟外, 其余寄主均为局部侵染。电镜下病毒粒子呈球状, 直径约28nm。基因组为单组分RNA, 大小约为3.7 kb, 具有2条亚基因组, 分别约为1.6 kb和1.3 kb。外壳蛋白亚基的分子量约为30 kDa。血清学试验表明, 该分离物与TNV柳树分离物的抗血清呈特异反应, 与同属坏死病毒属(Necrovirus)的烟草坏死病毒D(TNV-D)和甜菜黑色焦枯病毒(BBSV)无血清学关系。利用简并引物通过RT-PCR克隆了该分离物的外壳蛋白基因。序列分析表明, 该分离物与烟草坏死病毒A(TNV-A)、TNV-D和TNV-D^H的外壳蛋白分别具有88.77%、45.13%和45.49%的氨基酸序列一致性。因此, 该大豆分离物属于TNV-A的一个新株系, 命名为TNV-A^C。     

广西三种甜瓜病毒分离物的分子检测与鉴定

瓜类褪绿黄化病毒Cucurbits chlorotic yellows virus(CCYV)、甜瓜黄化斑点病毒Melon yellow spot virus(MYSV)及甜瓜坏死斑点病毒Melon necrotic spot virus(MNSV)是近年来报道侵染瓜类作物的新病毒,在个别种植区大面积发生,对生产构成严重威胁。为了解3种病毒在广西的发生情况,先后到各西甜瓜种植区进行了调查,并采集疑似CCYV、MYSV及MNSV的甜瓜病叶样品,提取病叶总RNA,通过特异性引物分别进行一步法RTPCR扩增,电泳结果显示RT-PCR产物与预期大小一致的序列条带;将扩增产物分别连接到pMD19-T克隆载体上,挑选阳性克隆子进行序列测定及比对分析。结果表明:CCYV、MYSV和MNSV广西分离物的CP基因序列与其他已报道核苷酸序列一致性分别达95.1%~100%、96.5%~99%和83.7%~92.5%。     

甜菜坏死黄脉病毒(BNYVV)75kDa通读蛋白基因及其54kDa片段的克隆与表达

 以甜菜坏死黄脉病毒(BNYVV)内蒙分离物的总RNA为模板,通过反转录和PCR扩增获得75kDa通读蛋白基因54kDa片段的目的片段。     

甜菜坏死黄脉病毒(BNYVV)75kDa通读蛋白基因及其54kDa片段的克隆与表达

 以甜菜坏死黄脉病毒(BNYVV)内蒙分离物的总RNA为模板,通过反转录和PCR扩增获得75kDa通读蛋白基因54kDa片段的目的片段。     

来源于桃和苹果的苹果褪绿叶斑病毒的部分分子生物学特性和cp基因的原核表达

 从桃和苹果上分离得到苹果褪绿叶斑病毒ACLSV-HBP和ACLSV-C2个分离物,采用RT-PCR法进行扩增,所获扩增片段经序列测定,其全长分别为1768nt(ACLSV-HBP)和1751nt(ACLSV-C)。这2个分离物扩增片段全长的同源性为83%,mp基因片段核苷酸和推导编码氨基酸序列同源性分别为82.6%和87.1%;cp基因均由582nt组成,其核苷酸和推导编码氨基酸序列同源性分别为87.8%和95.9%。将2个分离物的cp基因与已报道ACLSV分离物进行序列同源性比较,结果显示ACLSV-HBP与SX/2的cp基因核苷酸序列及推导编码氨基酸序列同源性最高,分别为94.0%和96.4%。将ACLSV-HBP分离物的cp基因克隆到原核表达载体pGEX-KG,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,SDS-PAGE分析表明,融合蛋白大小约为46kDa。Western-blot分析表明,该基因在大肠杆菌内得到高效表达,融合蛋白具有抗原性。     

辣椒轻斑驳病毒湖南分离物的全基因序列测定及结构分析

采自湖南地区的辣椒轻斑驳病毒Pepper mild mottle virus(PMMoV)样品经单斑分离后,根据已经报道的PMMoV序列基因保守区设计6对简并引物,采用片段重叠法和RACE方法扩增、克隆获得一个全长为6 356bp的湖南分离物(PMMoV-HN1,登录号:KP345899)全基因组序列,编码4个蛋白,分别为126kD蛋白(70~3 423nt)、183kD蛋白(70~4 908nt)、28kD蛋白(4 909~5 682nt)和17.5kD蛋白(5 685~6 158nt),5′-非编码区(5′-UTR)和3′-非编码区(3′-UTR)分别含有69和198个碱基,其中5′-UTR存在一个序列为m7G5′pppG的甲基化核苷酸帽子结构。一致性分析发现PMMoV-HN1与PMMoV其他分离物的核酸一致性为94%~99%,编码的氨基酸一致性为94%~99%。全基因组序列系统进化分析表明PMMoV-HN1分离物与中国首次报道的PMMoV-CN分离物亲缘关系最近。本研究是国内报道的第二例PMMoV全基因组序列。     

一个马铃薯Y病毒山东分离物的分离与鉴定

 从具有典型花叶症状的马铃薯叶片中分离到马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)(本文称PVY-SD-TA分离物),扩繁后,提纯病毒,电镜下可观察到700~900 nm×11 nm的病毒粒体,病组织超薄切片观察可见风轮状的内含体结构,寄主反应特性研究表明其能侵染2科13种植物。SDS-PAGE电泳检测病毒编码的外壳蛋白亚基的分子量为33 kDa。以PVY-SD-TA基因组RNA为模板,应用RT-PCR方法和特异引物合成了外壳蛋白基因。对cDNA全序列分析表明,PVY-SD-TA CP基因核苷酸序列与N株系的同源性为96%,与GenBank中登录序列号为AJ390306的O株系分离物的同源性最高,为99%;与国内不同学者报道的PVY中国流行株的同源性分别为96%,97%和98%。通过以上生物学特性和分子水平的研究将PVY-SD-TA鉴定为普通株系(PVY^O株系)。     

烟草蚀纹病毒山东分离物全基因组序列的克隆和保守性分析

为利用RNA介导的病毒抗性策略,培育抗性稳定或抗多烟草蚀纹病毒（Tobacco etch virus,TEV）株系的转基因植株,采用RT-PCR及5＇-RACE方法克隆了烟草蚀纹病毒山东分离物TEV-SD1的全基因组序列。TEV-SD1全基因组核苷酸序列长度为9494 bp,包含1个9165 bp的开放阅读框架（open reading frame,ORF）,编码3054个氨基酸。将TEV-SD1基因组序列与GenBank中已公布的4个TEV全基因组序列和11个外壳蛋白（coat protein,CP）基因序列比对分析发现,各分离物CP基因间的核苷酸和氨基酸序列平均相似性分别为96.65%和98.31%,高于其它功能基因间的相似性;各分离物CP基因3＇端核苷酸序列相似性平均为96.55%,高于5＇端序列。聚类分析发现TEV在自然界中的分子变异与其寄主关系密切。     

芜菁花叶病毒长春分离物p3基因的克隆、序列分析及P3蛋白抗血清的制备

 用RT-PCR方法从长春感染芜菁花叶病毒( Turnip mosaic virus,TuMV)的十字花科蔬菜中扩增获得该病毒的p3基因,并对其序列进行了比较分析。结果表明,本研究所获得的10个TuMV分离物p3基因含1 065个核苷酸,其序列一致率为98.8%~99.6%,与GenBank中其他15个TuMV分离物核苷酸一致率为80.9%~99.4%。根据p3基因核苷酸序列构建的系统进化树显示:25个TuMV分离物可分为4个组,本研究得到的10个TuMV分离物均属于basal-BR组。将TuMV JCR06分离物p3基因N端663 bp片段克隆至原核表达载体pET-28a(+),并在大肠杆菌BL21(DE3) pLysS中表达出分子量约为28 kDa的融合蛋白。以纯化的融合蛋白为抗原免疫家兔,制备了P3蛋白的特异性抗血清。以TuMV侵染的萝卜为抗原,间接ELISA测定抗血清的效价为1∶2 048。Western blotting分析表明,制备的抗血清能与诱导表达的融合蛋白发生特异性反应。     

油桃茎痘相关病毒中国分离物基因组的分子特征分析

为明确我国油桃茎痘相关病毒(nectarine stem-pitting-associated virus,NSPaV)基因组的分子特征,利用RT-PCR和RACE技术对NSPaV中国分离物NSPaV-T04基因组进行克隆,采用最大似然法对得到的NSPaV基因组序列和GenBank中的5条NSPaV基因组序列构建系统发育树,应用RDP软件对NSPaV基因组序列进行重组分析。结果表明:中国分离物NSPaV-T04基因组序列全长为4 991 nt,包括4个开放阅读框(open reading frame,ORF),其中ORF1与ORF2共同编码1个RdRp P1-P2融合蛋白,ORF3编码1个CP,ORF5与ORF3共同编码CP通读蛋白。系统发育树和序列比较分析结果显示,中国分离物NSPaV-T04(MN095353)与美国分离物NSPaV/12P42(KT273410)的亲缘关系最近,核苷酸序列同源性最高,为96.4%;NSPaV-T04的RdRp P1变异较大,与GenBank中5条NSPaV基因组核苷酸序列的同源性为90.5%~96.1%,CP较为保守,核苷酸序列的同源性为96.6%~98.7%。重组分析结果显示,中国分离物NSPaV-T04为鉴定的一个重组体(韩国分离物SK)的亲本序列,表明中国分离物NSPaV-T04可能是一个实际的重组体。     

水稻黑条矮缩病毒p8蛋白的原核表达、抗血清制备及其特性

水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)p8蛋白由其基因组片段S8编码,根据RBSDV浙江分离物S8序列(AJ297431)设计特异性引物扩增编码p8蛋白N端部分的片段,并亚克隆至原核表达载体pET-32a ,然后以大肠杆菌BL21plysS为宿主菌进行高水平地表达,利用纯化的p8蛋白免疫小鼠,制备了p8蛋白的特异性抗血清。Western blot分析表明,p8蛋白在水稻病株中含量较为丰富,易于检测,而且p8蛋白参与病毒粒子的组成,表明p8是一个病毒结构蛋白。ELISA检测显示p8蛋白的抗血清可与不同来源的水稻、小麦、玉米病汁液发生强烈的血清学反应,表明该抗血清适用于RBSDV田间病株的快速诊断。     

小西葫芦黄花叶病毒北京分离物的鉴定及其基因组3′端特性分析

在北京东郊自然感病的南瓜Cucurbita moschata上获得一病毒分离物(BJ-1),经生物学、血清学和分子生物学鉴定,确定为小西葫芦黄花叶病毒(Zucchini yellowmosaic virus,ZYMV)。为分析其基因组3′端特性,以发病叶片中提取的总RNA为模板,对基因组3′端进行RT-PCR扩增,产物克隆到pMD18-T载体上进行序列分析,共测定了该病毒分离物包括全部CP基因在内的1269bp。该分离物CP基因由837个核苷酸组成,编码279个氨基酸。对包括该分离物在内的30个序列的760bp(含NIb基因3′端56bp和CP基因中的704bp)片段、NIb蛋白与CP蛋白的切割位点、蚜传必需基序的变异、寄主来源及地域来源进行了分析。结果表明,ZYMV不同分离物的基因分型与上述五个因素无明显关系。     

黄瓜绿斑驳花叶病毒安徽分离物全基因组序列测定及分析

通过胶体金免疫层析试纸条和RT-PCR等手段对采自安徽和县的西瓜病株进行检测,确定其病原为黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)。为明确CGMMV安徽分离物CGMMV-Anhui的分类地位,进一步克隆了该病毒的全基因组序列,分析了其基因组结构特征。结果表明,CGMMV-Anhui基因组全长为6 423bp(GenBank登录号KT236095),与已报道的CGMMV的编码区的基因结构一致,仅5′和3′端非编码区核苷酸数目略有差异。将CGMMV-Anhui与已报道的分离物的全基因组序列和外壳蛋白基因序列进行系统发育分析,显示CGMMV不同分离物可分为亚洲和欧洲两个组,安徽分离物CGMMV-Anhui与亚洲分离物亲缘关系较近,可能具有共同的侵染源。     

瓜类褪绿黄化病毒山东分离物全基因组序列扩增及分析

为明确分离自山东省寿光市甜瓜上的瓜类褪绿黄化病毒(cucurbit chlorotic yellows virus,CCYV)分离物的全基因组序列信息和遗传变异情况,利用毛形病毒属Crinivirus简并引物进行RTPCR检测,利用RACE技术结合RT-PCR方法克隆CCYV山东分离物2条RNA链的全基因组序列,通过与GenBank中其它地区CCYV分离物的全长序列进行比对分析其同源性,并基于CP基因序列构建系统进化树分析其遗传变异情况。结果表明,山东分离物经RT-PCR检测和测序后确定为CCYV。CCYV山东分离物与其它CCYV分离物的RNA1链和RNA2链的全基因组序列一致性的平均值分别为99.82%和99.88%,且2条链的5′末端均比较保守,没有碱基突变的情况发生;RNA1链3′末端存在2个碱基变异,RNA2链3′末端存在1个碱基变异。CCYV不同地区分离物主要分为3个簇群,其中山东分离物和中国其它地区分离物、日本分离物、苏丹分离物、黎巴嫩分离物和塞浦路斯分离物聚类在一起。研究表明CCYV基因组序列比较保守,该病毒的分化可能与地理来源存在一定的相关性。