生防放线菌活性代谢产物研究进展

放线菌是一类能产生丰富活性次生代谢产物的微生物资源,其代谢产物具有高效杀灭昆虫、真菌、细菌、线虫、螨类,以及除草和抗病毒功能,在农业领域有着广阔的应用前景。在植物有害生物综合治理中,利用放线菌代谢产物研制高效、低毒、无残留、无污染的生物农药一直是研究的热点,近年来也已分离到许多结构新颖且活性良好的次级代谢产物,这些活性代谢产物为新药的研发提供了丰富的先导化合物。但放线菌及其代谢产物的应用仍面临诸多问题。论文综述了生防放线菌代谢产物的最新研究进展,并展望了放线菌源生物制剂在农业生产上的应用前景。     

一株放线菌次生代谢产物抗菌活性的初步研究

从秦岭山区土样中筛选得到一株放线菌,编号为NO.24,对其产生的次生代谢产物的抑菌活性进行了测定。生测结果表明,离体条件下发酵液浓度2 000 mg／L时对烟草赤星病菌、马铃薯干腐病菌、玉米大斑病菌、番茄灰霉病菌、番茄早疫病菌、番茄晚疫病菌、小麦赤霉病菌、小麦根腐病菌菌丝生长或孢子萌发均有较强的抑制作用。对玉米大斑病菌和番茄灰霉病菌菌丝生长抑制中浓度为240.1 mg／L和350.5 nag／L;对玉米大斑病菌和马铃薯干腐病菌孢子萌发的抑制中浓度分别为155.0 mg／L和124.1 mg／L。盆栽试验在浓度为6 000 mg／L时对小麦白粉病的保护和治疗作用分别为76.13％和70.78%,对黄瓜霜霉病的保护和治疗作用分别为63.93％和59.66％。对NO.24菌株代谢产物进行了粗分离,其抑菌活性成分主要为水溶性物质。     

拮抗放线菌JD211的抑菌活性及其鉴定

本实验室从江西庐山珙桐树中分离筛选出的一株拮抗放线菌,编号为JD211。为明确放线菌JD211菌株在植物病害生物防治中的应用潜力,采用菌丝生长速率法测定其抑菌作用,通过多相分类法研究其分类地位。结果表明：JD211的粗提物可显著抑制水稻纹枯病菌、稻瘟病菌、烟草黑胫病菌、根霉、胶孢炭疽病菌、犁头霉、西瓜枯萎病菌等真菌的生长,其中对稻瘟病菌、烟草黑胫病菌等植物病原真菌的相对抑制率高达90％以上。根据形态特征、培养特征、生理生化特征及16SrDNA序列分析结果,将菌株JD211初步鉴定为奈良链霉菌（Streptomyees naraensis）。     

筛选放线菌活性产物防治烟草黑胫病的初步研究

微生物农药作为生物农药的一个分支,大部分具有低毒、低残留、对非靶标生物及环境安全、靶标生物不易产生抗药性的优点,符合人类的需求及当今和未来农药开发的要求.烟草黑胫病目前在全国大部分烟草种植区均有发生.长期以来,对于该病的控制主要依靠化学农药来进行防治,而长期施用化学农药所带来的问题愈来愈令人担忧.为发掘和利用云南省丰富的放线菌资源,作者开展了225份放线菌发酵液提取物对烟草黑胫病的防治效果筛选研究.     

2株海洋真菌的鉴定及其代谢产物的抑菌活性

以11种植物病原真菌为供试菌种,对2株海洋真菌及其代谢产物的水溶性提取物进行抑菌试验。结果表明,菌株1002F2水溶性提取物对高粱炭疽菌Colletotrichum graminicola和番茄早疫菌Alternaria solani的抑制活性较高,EC50值分别为1.34g/L和0.94g/L;菌株1009F1水溶性提取物对瓜果腐霉菌Pythium aphanidermatum和番茄早疫菌的抑制活性较高,EC50值分别为0.63g/L和0.65g/L。形态学鉴定及ITS rDNA序列的同源分析结果表明,菌株1002F2为曲霉属Aspergillussp.真菌,菌株1009F1可能为Whalleya microplaca。     

土壤拮抗放线菌S-5210-6活性产物抑菌谱及其作用机制

为了明确拮抗性放线菌S-5210-6在植物病害生物防治中的实用价值,并为其后续的生防制剂的研发提供科学依据,在离体条件下采用生长速率法和抑菌圈法和在活体条件下采用盆栽法对其活性产物的抑菌谱进行测定。结果表明,在离体条件下S-5210-6活性产物对病原细菌具有选择性抑制作用,对供试的病原真菌均有较强的抑制作用;在温室条件下,对专性寄生病原菌黄瓜霜霉病菌,不仅能阻止其菌丝的入侵,而且对已侵入的菌丝有很好的治疗作用。采用生长速率法和孢子萌发法对S-5210-6菌株活性产物作用机制进行了研究,结果表明,S-5210-6菌株活性产物不仅能强烈抑制病原菌菌丝的生长和分生孢子的萌发,而且经S-5210-6活性产物处理的病原菌菌丝和初萌发的分生孢子,接种寄主植物后,其致病性明显减弱,病斑的扩展减慢,且致病性的减弱程度与活性产物的浓度呈正相关关系。     

植物内生放线菌活性物质防治猕猴桃溃疡病

以供试内生放线菌发酵液的皿内抑菌活性为指标,得到对猕猴桃细菌性溃疡病菌有抑制活性的菌株76株,其中35株的发酵液对猕猴桃溃疡菌的抑菌圈直径≥20mm,5株对猕猴桃溃疡病菌均具有显著的抑制活性.其中gCLA4菌株发酵液抑菌谱最广,不仅对4种靶标细菌具有抑制活性,还对10种植物病原真菌有较强的抑制活性.通过发酵液制备及大孔吸附树脂D101处理得到gCLA4菌粗提活性物质.田间防治结果表明,gCLA4菌株粗提活性物质100倍稀释液对猕猴桃溃疡病28d的相对防效达64.9%,明显优于化学药剂施那宁.     

土壤稀有放线菌的选择性分离及其抗菌活性研究

在优化土壤稀有放线菌选择性分离方法的基础上,对从安徽、浙江、山东、陕西等地采集的31份土样中的稀有放线菌进行了选择性分离。结果表明:以改进的HV培养基为分离培养基,将土壤样品稀释100倍,添加2×10-5 g/mL重铬酸钾＋2×10-5 g/mL萘啶酮酸＋1×10-5 g/mL卡那霉素作为抑制剂分离效果最好。以常见植物病原真菌和细菌为指示菌,从分离的417株放线菌中筛选出H32、H75、H223、H227、H238等5株可代谢抗菌活性物质的菌株。离体条件下,5株放线菌菌株发酵液对小麦根腐病菌Bipolaris sorokiniana、玉米大斑病菌Exserohilum turcicum、烟草赤星病菌Alternaria alternate的菌丝生长和孢子萌发均有强烈的抑制作用,其中H223和H238菌株发酵液对病原真菌菌丝生长的抑制中浓度(EC50)值均小于10 mL/L;H32菌株发酵液对小麦根腐病菌、玉米大斑病菌、烟草赤星病菌孢子萌发的EC50值分别为25.5、28.9和29.9 mL/L。5株放线菌发酵液对枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌抑制作用显著,其中H223菌株发酵液抑制作用最强,抑菌圈达30 mm以上。盆栽实验结果表明,5株放线菌发酵液对小麦白粉病的保护效果为73.45％~82.35％,治疗效果为67.74％~70.80％。     

土壤拮抗放线菌的分离及其抗菌活性筛选

以常见植物病原真菌和细菌为指示菌,从分离的422株放线菌中筛选出28株可代谢抗细菌活性物质的菌株,其中N331、N393菌株发酵液对供试12种真菌有显著的抑制作用。离体条件下,N331、N393菌株发酵液对供试真菌菌丝生长的抑制中浓度(EC50)均小于15 mL/L;对玉米弯孢病菌、棉花枯萎病菌、小麦根腐病菌、黄瓜霜霉病菌孢子萌发的EC₅₀亦小于15 mL/L。盆栽试验结果表明,N331、N393菌株发酵原液对黄瓜霜霉病的保护效果分别为97.4%和85.6%,治疗效果分别为83.3%和59.3%。     

海洋放线菌M1D14代谢产物对几种重要植物寄生线虫的抑制作用

采用梯度稀释法室内测定了海洋放线菌M1D14发酵液代谢产物对南方根结线虫(Meloidogyne incognita)2龄幼虫及其卵、松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)、大豆孢囊线虫(Heterodera glycines)2龄幼虫的毒力,同时还测定了经过高温高压灭菌和0.22μm微孔滤膜过滤的M1D14发酵液对南方根结线虫的毒力。结果表明,海洋放线菌M1D14发酵液代谢产物对南方根结线虫卵的孵化无明显的抑制作用,对南方根结线虫幼虫毒力最强,对松材线虫幼虫毒力次之,对大豆孢囊线虫幼虫的毒力最弱。经过高温高压灭菌和微孔滤膜过滤的M1D14发酵液对南方根结线虫仍有毒力。M1D14杀线虫谱广、效果好、使用成本低,在生产上具有很好的应用前景。     

放线菌A01发酵液中活性成分稳定性及其化学类型

本文研究了对多种植物病原真菌均表现出良好抑菌活性的菌株A01发酵液中活性成分对热、酸碱、蛋白酶及紫外线的稳定性,并采用pH纸层析、捷克氏八溶剂系统纸层析、纸电泳和紫外波长扫描等方法对其进行了化学类型的早期鉴别。结果表明,菌株A01发酵液中活性物质在中性及偏碱性环境中比较稳定;100℃处理30min相对活性还保持在81.19%;对蛋白酶不敏感,但对紫外线较敏感;紫外扫描在291、305和319nm处有典型共轭四烯生色基团的吸收峰,结合纸层析和纸电泳结果,表明该活性物质归为四烯类中性抗生素。     

太白山土壤放线菌分离方法及生态分布规律

研究了改良高氏培养基、甘油-天门冬酰胺培养基、R2A培养基、改良高氏二号培养基、海藻糖-脯氨酸培养基对太白山不同植被土壤放线菌的分离效果,并分析放线菌的生态分布规律。结果表明:太白山南北坡土壤养分大体呈现为中海拔林地含量相对较高,有机质和全氮含量最高分别为77.81 g·kg~(-1)和5.35 g·kg~(-1),低海拔林地与高海拔林地含量相对较低,有机质和全氮含量最低分别为11.77 g·kg~(-1)和0.85 g·kg~(-1),即自低海拔至高海拔不同林地类型土壤养分整体呈现先升高后降低的趋势;甘油-天门冬酰胺培养基分离的放线菌数量与种类均高于其它培养基,其数量最高可达258×10~4cfu·g~(-1)土,种类最多为35种;改良高氏培养基分离南坡的效果优于北坡;R2A培养基分离中高海拔林地土壤优势更明显。中海拔林地类型,如北坡的红皮桦、牛皮桦,南坡的牛皮桦,分离的放线菌数量均显著高于其它林地类型;土壤速效磷和全氮含量对放线菌的分离效果影响较大。     

高山草甸土壤放线菌分离方法研究

采用平板涂抹分离法研究了不同分离培养基及样品预处理对高山草甸土放线菌分离的效果。结果表明：土样在120℃干热处理1 h后其悬浮液加0.05%SDS（十二烷基磺酸钠）和6%酵母膏,40℃振荡30 min,能促进放线菌孢子萌发,增加放线菌的分离数量,并抑制杂菌生长,是高山草甸土放线菌分离时理想的预处理方法。改良HV琼脂和高氏1号加重铬酸钾（50 mg/L）培养基是较好的分离培养基。     

具杀虫活性放线菌的筛选与产物的初步研究

利用几丁质酶抑制化合物筛选模型,对本实验室保藏的500株放线菌进行了筛选,获得阳性样品229份;其中57%的样品对卤虫有不同程度的致死效果。选择致死效果较强的样品进行了薄层层析分析,最终筛选到了6株菌株,其发酵液抽提样品中含有几丁质酶抑制剂。     

土壤放线菌的选择性分离及其代谢产物抗菌活性评价*

从土壤中选择性分离放线菌,并进行抗菌活性评价,以期筛选到具有潜在应用开发价值的菌株。以改良的HV培养基为分离培养基,添加萘啶酮酸、制霉菌素作为抑制剂,对从安徽、重庆、河北、湖北、江苏、吉林、山东、四川、天津、云南及德国莱比锡等地采集的45份土壤样品中的放线菌进行了选择性分离。以植物病原菌黑曲霉、棉花枯萎病菌、稻瘟病菌、辣椒疫霉、茄青枯病菌为指示菌,通过平板琼脂块初筛,并结合摇瓶复筛和盆栽防效进行评价。共选择性分离到570株放线菌;初筛显示,212个菌株代谢产物显示了抗真菌或抗细菌活性,占总菌株数量的37.2%,33个菌株代谢产物兼具抗真菌活性和抗细菌活性,占菌株数量的5.8%;摇瓶复筛显示,其中2株放线菌TJ231、TJ430发酵液对黑曲霉、棉花枯萎病菌、稻瘟病菌、辣椒疫霉、茄青枯病菌显示了强烈的抑制效果;1株放线菌TJ561发酵液对黑曲霉、棉花枯萎菌、稻瘟菌、辣椒疫霉显示了强烈的抑制效果;盆栽试验表明,放线菌TJ231、TJ430、TJ561发酵液对辣椒疫霉病的保护效果分别为56.2 %、87.2%、61.4%。     

海洋放线菌BM-2菌株抗真菌活性物质的分离纯化与结构鉴定

从海洋放线菌菌株BM-1发酵液中分离抗植物病原真菌的活性物质。以对禾谷镰刀菌Fusarium graminearum的生物活性为跟踪,采用硅胶柱层析、Sephadex LH-20柱层析、薄层层析和HPLC等技术,海洋放线菌菌株BM-1发酵液中含有4种对禾谷镰刀菌具有抑菌作用的活性物质,对其进行分离纯化,得到了4种具有强抗菌作用的组分Aa、Ab、Ba、Ca。采用ESI-MS、1H NMR、13C NMR等波谱分析技术,对分离量较大、活性较强的活性组分Ca进行结构鉴定,鉴定Ca为邻苯二甲酸二丁酯(DBP)。     

放线菌Lj20抗真菌物质的分离及其在病害防治中的作用

菌株Lj20是从健康辣椒植株分离得到的一株有杭真菌活性的植物内生放线菌,为了进一步明确其生物防治潜力,利用大孔吸附树脂、离心薄层层析以及柱层析等技术对Lj20代谢产物中的抗真菌活性物质进行了分离和提纯,并采用生长速率法测定了其代谢产物对黄瓜灰霉病菌的抑制作用,同时在温室中对Lj20发酵液粗提物的防病效果进行了试验.从Lj20代谢产物中分离得到一个抗真菌活性物质,该化合物时黄瓜灰霉病菌具有较强抑制作用,EC50值为174.94 mg/L;500mg/LLj20发酵液粗提物对黄瓜灰霉病的防治效果达62.5%;经鉴定其化合物结构为3,5-二叔丁基-4-羟基-卞基甲醚.结果表明,放线菌Lj20有进一步开发和利用的价值.     

半干旱条件下21株耐盐放线菌的数值分类研究

对采自陕西、宁夏两地半干旱土壤的21株耐18%NaCl的放线菌进行了形态、生理生化特性、生长条件、抗生素敏感性等89项指标试验测定,并用DPS数据处理软件作聚类树状图,分析其数值分类情况。结果表明:所有试验菌株在0.66的水平上聚在一起。在0.42的水平上,它们可形成10个表观群,并分别归为链霉菌的八个类群和两个待定种。第Ⅰ群为金色类群,第Ⅱ群为烬灰类群,第Ⅲ群为粉红孢类群,第Ⅴ群为球孢类群,第Ⅵ群为灰褐类群,第Ⅷ群为白孢类群,第Ⅸ群为黄色类群,第Ⅹ群为绿色类群,第Ⅳ群和第Ⅶ群为待定种。另外,金色类群在陕西、宁夏两省盐渍土耐盐放线菌中最多,占总数的38.1%,为优势类群。     

浅灰链霉菌CGMCC1370及其代谢产物除草活性研究

从上海附近海岛中分离得到放线菌70014,其发酵液在多次生物活性筛选中表现出较好的除草活性。对该菌株的培养特征、生理生化指标、细胞壁以及16S rDNA基因序列分析后,确定其为链霉菌属浅灰链霉菌Streptomyces griseolus中的一员。采用溶剂萃取、硅胶层析分离及制备型高效液相色谱等手段得到一个主要活性化合物SPRI-70014。通过对该化合物的理化性质及波谱学分析,确定其结构为2-[2-(3,5-二甲基-2-氧-环已基)-6-氧-四氢吡喃-4-基]-乙酰胺。尽管其结构与文献报道的具有骨质再吸收抑制活性的抗生素A75934的一致,但首次发现其具有除草活性。种子萌发试验结果表明,在1 mg/L质量浓度下,该化合物可彻底抑制多种供试作物种子的萌发。盆栽试验发现,在有效成分75 g/hm2剂量下,其对供试阔叶杂草的抑制率高达96.0% ~100.0%。其对千金子Leptochloa chinenesis (L.) Ness、牛筋草Eleusine indica (L.) Gaertn.、反枝苋Amaranthus retroflexus L.和鳢肠Eclipta prostrate L.的鲜重ED90值分别为143.29、146.94、80.88及小于9.37 g/hm2。作物安全性试验结果表明,即使在2 000 g/hm2下其对花生和小麦依然安全。     

黄瓜内生放线菌的分离、筛选及其活性菌株鉴定

 从植物内生放线菌中筛选拮抗活性菌株和寻找新的农用活性代谢产物,可为植物病害防治提供新的资源。本研究结果发现黄瓜幼苗的根、茎、叶中均有内生放线菌的存在,根组织中的数量、种类明显多于叶片和茎,占总分离株的72.7%,以链霉菌的淡紫灰类群、灰褐类群为主。活性筛选试验结果表明,黄瓜内生放线菌中对12种靶标真菌和6种细菌具有拮抗作用的菌株分别占46.8%和39.0%,主要为分离自根组织的链霉菌淡紫灰类群。分离自黄瓜叶片的gCLA4菌株抑菌谱较广,其发酵滤液对供试12种靶标真菌均具有较好的抑菌效果,但对靶标细菌有选择性抑制作用。形态学、细胞化学和16S rDNA序列分析鉴定该菌株为淡紫灰链霉菌(Streptomyces lavendularectus)。