猪瘟病毒国内分离株(HL-LY)E2基因的克隆及序列分析

用猪肾细胞（pK-15)繁殖猪瘟病毒（CSFV）分离株HL－LY，根据基因库已发表的CSFV E2基因序列，设计并合成一对引物，以CSFV总RNA为模板，通过RT－PCR技术扩增出约1.1kb的片段，即E2基因。将RT－PCR产物克隆到pMD18-T载体上，构建了重组质粒T－E2，经酶切、PCR鉴定和序列测定，表明均已成功获得了CSFV E2基因的重组体T－E2。将该测序结果与国内几个毒株SHIMEN，C，C－V－LZ,GS-LT,GS-LX德育了列同源性比较，核苷酸同源性分别为96.59%,96.005,88.495,78.24%,77.82%；氨基酸同源性分别为99.46%,98.39%,93.54%,90.70%,90.44%。表明该毒株与国内标准毒株SHIMEN株和C株具有较高的同源性。     

鹅副粘病毒F基因的克隆测序及核苷酸序列分析

以鹅副粘病毒 (GPV) SF0 2株的基因组 RNA为模板 ,通过 RT- PCR的方法扩增出 F基因片段 ,然后将其克隆至 T载体中。经 PCR鉴定后 ,对阳性克隆进行测序。测序后拼接得出 F基因的全序列。与 Gen Bank下载的 9株参考毒株比较 F基因编码区全核苷酸序列 ,发现所测 GPV- SF0 2毒株与参考毒株 L Z- NDV核苷酸序列同源性为 96 %,与F48E9同源性为 92 .5 %,与 L a Sota为 88%。     

鸡传染性支气管炎病毒中国地方分离株S1基因的克隆及其鉴定

用自行设计的 1对引物 you1 和 you2 -对 5个传染性支气管炎病毒 (IBV)地方分离株 (HN2 ,HN4,JX1,SC2和SC4)的基因组 RNA进行 RT- PCR,均成功地扩增出预期大小 (约 16 30 bp)的目的片段 ,经 PCR、酶切鉴定为 S1基因。将 5个毒株的 S1基因克隆到 p GEM- T载体中 ,重组质粒经 Eco R 和 Hind 单酶切以及用引物 you1 和 you2 -进行质粒 PCR扩增鉴定 ,证明 IBV- S1基因已成功地克隆到了 p GEM- T载体中。同时 ,为了测序的方便 ,还将 IBV- S1基因作了目的片段 (约 10 6 0 bp)的亚克隆并进行了鉴定     

新城疫病毒B_(95)株HN蛋白基因的克隆及序列分析

根据 NDV　 HN蛋白已知基因序列设计一对引物 ,以提取的澳大利亚布里斯班 NDV分离株 B95基因组 RNA为模板 ,利用 RT- PCR技术扩增得到一条约 1.9kb的条带。将扩增产物克隆到 PGEM- T- easy载体中 ,并对重组质粒进行酶切分析、PCR鉴定 ,结果证明我们得到了 HN基因的阳性重组子 ,随后采用 Sanger's双脱氧末端终止法对阳性重组子进行核苷酸序列测定 ,获得该基因全长序列 ,并进行同源性分析。 B95株与其他毒株核苷酸同源性为 95 .1%～ 87% ,氨基酸同源性为96 .1%～ 92 .1%。     

猪瘟病毒山东惠民分离株E2基因的克隆及表达

从山东惠民某猪场病料中经RT-PCR扩增了猪瘟病毒（CSFV）E2基因,并将其克隆到pMD18-T载体。经序列测定,E2基因核苷酸序列长度为1 065bp,与GenBank中CSFV石门毒株（SHIMEN）、猪瘟兔化弱毒疫苗株（HCLV）、猪瘟ZJ7分离株E2基因核苷酸序列同源性分别为85.1%,84.2%,98.8%;氨基酸序列同源性分别为91.5%,91.5%,98.6%。将E2基因插入到大肠杆菌原核表达载体pGEX-KG,获得重组质粒pKG-E2,再转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,经IPTG诱导,受体菌能表达大小约为65 000的蛋白。Western blot显示表达的蛋白具有反应原性。     

鸡柔嫩艾美耳球虫HN株3-1E基因的原核表达与鉴定

根据已报道的柔嫩艾美耳球虫3-1E基因序列设计引物,以孢子化卵囊总RNA为模板,用RT-PCR方法扩增得到1条特异片段,将扩增产物克隆至p MD-18T载体,转化感受态菌JM109,经酶切鉴定获得阳性重组质粒并对其进行测序。测序结果与已发表的国内外相关虫株的3-1E基因序列比较,核苷酸的同源性均在99.2%~99.8%,氨基酸的同源性均在98.2%~100%。然后将重组质粒和表达载体p GEX-4T-1分别用Xho I和EcoR I酶切后构建重组表达载体p GEX-3-1E,并将其转化入大肠杆菌BL21中,提取质粒经酶切和PCR鉴定正确后,用IPTG诱导表达。表达产物经SDS-PAGE和Western blot检测显示,3-1E基因在大肠杆菌中成功表达,融合蛋白的分子量为44.7 ku,诱导表达5 h的蛋白表达量可达到30%以上。     

猪伪狂病病毒粤A株gE基因的克隆与序列分析

参考GenBank中伪狂犬病病毒(PRV)gE基因的序列设计了1对引物,对PRV粤A株gE基因进行了PCR扩增,PCR产物克隆到PMD18-T载体.对重组质粒进行限制性内切酶分析和基因测序,证实了克隆片段的可靠性,并与2株不同来源的毒株进行了同源性分析和比较.     

新城疫病毒山东流行株F基因的序列测定和分析

用 SPF鸡胚从发生新城疫鸡群分离到一株病毒 ,进行了生物学特性的研究 ,结果表明 ,最小致死量鸡胚平均死亡时间 (MDT)为 5 0 ,1日龄鸡脑内接种致病指数 (ICPI)为 1.82 ,6周龄鸡静脉接种致病指数 (IVPI)为 2 .6 2 ,属强毒力毒株。以异硫氰酸胍法提取病毒基因组 RNA,RT- PCR扩增其融合蛋白 F基因重要功能区片段 ,经回收后 ,克隆到 p GEM- T载体上进行酶切鉴定与核苷酸序列测定 ,并与多株已报道的 NDV国内外参考株相应片段进行序列比较 ,F基因的同源性在 84% - 91%之间 ,氨基酸同源性为 82 % - 93% ,经基因进化树分析 ,证实流行株为基因 型毒株     

瘦蛋白基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

采用 RT- PCR方法从猪脂肪组织扩增出瘦蛋白基因 ,将其插入 p MD1 8- T克隆载体 ,经序列分析证明 ,所获得的目的基因为 4 4 1 bp,与预期大小一致。提取质粒后用 Eco R 和 Xho 双酶切 ,克隆入 p ET- 2 8a表达载体 ,将阳性重组质粒转化表达受体菌 E.coli BL 2 1 ( DE3) ,经 IPTG诱导 ,SDS- PAGE检测 ,证明在 E.coli BL 2 1中正确表达了重组猪瘦蛋白     

鸡传染性支气管炎病毒中国地方分离株S1基因5′端的变异

对自海南省、广西省发生鸡传染性支气管炎 (IB)鸡群分离的 4株 IBV分离株 (Ha N- 1/95、Ha N- 2 /95、GX- 1/98、GX- 2 /98)的主要免疫原纤突蛋白 S1基因经 RT- PCR扩增其 5′端约 1.2 kb的目的片段 ,将其插入载体 p MD 18- T中 ,在大肠杆菌中实现目的基因的克隆。对克隆的目的基因经限制性酶切分析及 PCR鉴定后 ,以双脱氧链终止法测定其核苷酸序列 ,并与 Gen Bank中的参考毒株 (H12 0、SD- 1/97和 Holte)相应序列作比较 ,分析其同源性。结果表明 ,Ha N- 1/95、Ha N- 2 /95、GX- 1/98及 SD- 1/97与疫苗株 H12 0的核苷酸序列同源性分别为 99.5 %、99.2 %、97.9%和99.5 % ,其推导氨基酸序列同源性分别为 99.1%、98.9%、96 .9%和 99.2 %。 GX- 2 /98与 Holte株的核苷酸序列同源率为 99.0 % ,其推导的氨基酸序列同源性为 98.6 % ,而与其他中国分离株的核苷酸序列的同源性仅为 70 %左右 ,氨基酸序列的同源性仅为 6 8%左右。     

猪瘟病毒云南毒株的分离鉴定及E2基因的原核表达

从云南10个地州15个大型猪场采集到的21份样品中分离得到5株猪瘟病毒。经测序鉴定昆明、玉溪、曲靖地区分离株的核苷酸序列99.99%同源,大理和宝山地区的核苷酸序列99.99%同源,5株分离毒均属于基因二群。5株分离毒在PK-15细胞上的平均毒价约为2×106TCD50/mL,应用荧光抗体染色可以检测到CSFV。通过RT-PCR扩增猪瘟病毒约1 200 bp的E2蛋白全部抗原编码区序列,并将其分别克隆到pMD18-T载体中。序列分析结果表明,5株分离株的E2基因片段为1173bp,与猪瘟病毒Shimen株的核苷酸同源性为82.5%和84.3%,与C-株的核苷酸同源性分别为83.3%和85.4%。将E2基因插入原核表达载体pET-41a(+),转化进BL21(DE3)内进行表达,经IPTG诱导,E2蛋白能在菌体内高效表达,表达量达26.5%,蛋白分子质量约为41kD。本研究为猪瘟诊断抗原及基因工程疫苗的研制打下基础。     

猪瘟病毒E2基因的克隆及分子特性分析

为研究四川地区猪瘟病毒（classical swine fever virus,CSFV）及E2基因的遗传变异情况,试验对CSFV阳性病料抽提RNA,通过RT-PCR扩增CSFV E2基因并将其克隆到pMD18-T载体,经菌落PCR、双酶切、序列测定后利用生物信息学软件分析了E2基因的分子特性。结果显示,扩增的E2基因大小为1 125 bp,编码375个氨基酸,与GenBank中CSFV GXWZ02、CSFV/2.1、HEBZ、YC11WB、SXYL2006、0406/CH/01/TWN亲缘关系较近,核苷酸同源性分别为98.3%、96.5%、94.7%、92.4%、92.1%和90.9%,而与疫苗株HCLV E2的同源性较低,为87.6%。密码子偏向性分析显示,E2基因的ENc值为53.161,密码子使用频率与大肠杆菌、酵母菌和人差异较大的分别有33、25和25个;此外,E2基因共有34个稀有密码子,且有多个稀有密码子多次串联成簇的情况出现。结果表明,E2基因在密码子使用中整体上不存在较明显的偏向性,且密码子使用模式更接近真核生物,本试验克隆的E2基因与疫苗株相比,部分核苷酸出现了变异,但主要抗原域氨基酸未发生改变,该结果为进一步开展CSFV E2功能研究及后期基因工程苗的研制提供了基础数据。     

猪瘟病毒E2基因的扩增及序列分析

本研究利用RT—PCR技术，对流行于国内部分地区的9株猪瘟病毒（CSFV）E2基因进行扩增，与C-株等4株参考毒株做了同源性比较，绘制了遗传进化关系发生树，结果表明，所测序列共由442个氮基酸残基组成。可将13株CSFV分为两个组群，其E2基因间的核苷酸序列同源性为81．9％～99．7％，所推导氨基酸序列同源性为88．2％～99．5％，其中9株CSFVE2基因的长度均为1324bp，编码的氨基酸序列均包括完整信号肽序列和跨膜区序列，9株流行毒株与C-株之间核苷酸序列同源性为81．9％～95．3％。所推导氨基酸序列同源性为88．2％～95．5％。说明近期流行毒株的变异呈现一定的多样性，并且多数毒株已向远离疫菌株方向变异。     

猪瘟病毒云南毒株E2基因片段序列测定及分析

用RT－nPCR方法，选择猪瘟病毒2000年云南部分地方流行毒株E2基因主要保护性抗原决定簇编码区片段进行扩增和cDNA序列分析，并与中国标准强毒石门株进行比较。结果显示，云南地方毒株之间核苷酸及氨基酸序列同源性均大于90％；但与中国标准强毒石门株差异较大，其核苷酸及氨基酸同源性均小于80％。     

猪瘟病毒野毒株与疫苗株酶切检测方法的建立、优化及应用

为有效鉴别猪瘟病毒强毒株(Shimen)与弱毒疫苗株(HCLV),根据GenBank上已发表的猪瘟病毒囊膜糖蛋白E2基因高度保守区设计一对特异性引物,在其跨越区内部有Shimen株独有的限制性内切酶Bgl Ⅱ酶切位点,采取酶切RT-PCR产物的方法鉴别Shimen株和疫苗株,同时对该方法的特异性和敏感性进行检测。结果表明,应用该方法从Shimen株和疫苗株中均能扩增出一条大小为750 bp的特异性片段,疫苗株的RT-PCR产物不能被Bgl Ⅱ酶切,Shimen株的RT-PCR产物则被酶切为大小分别为520和230 bp的两条带。此方法可扩增猪瘟病毒的E2基因保守片段,对病毒RNA的最小检出量为3.96×10^-4 μg/mL。采用此方法检查了30例临床疑似猪瘟病料,结果3例感染猪瘟病毒强毒,21例为猪瘟弱毒疫苗株,其他为猪瘟阴性。     

多次传代和致细胞病变猪瘟病毒石门株E2基因序列分析

根据已发表的猪瘟病毒基因组序列，设计合成了2对引物，以脾毒和细胞毒总RNA为模板，利用反转录聚合酶链式反应（RT—PCR）、套式聚合酶链式反应（nPCR）及测序技术，对多次动物传代和致细胞病变的猪瘟病毒的主要外膜糖蛋白E2基因的核苷酸序列进行了测定，用DNA star软件比较分析了E2基因的核苷酸和氨基酸序列的同源性。结果发现，脾毒和标准石门株的核苷酸序列同源性为99．4％，氨基酸序列同源性为99．0％，细胞毒标准石门株的核苷酸序列同源性为98．3％，氨基酸同源性96．7％。由此说明猪瘟病毒经猪多次传代和致细胞病变后均保持遗传的稳定性。     

广西猪瘟病毒E0和E2基因的克隆及序列分析

通过分析目前广西猪瘟病毒(CSFV)的E0和E2基因特征,为了解广西地区CSFV的分子流行病学、遗传变异及综合防控提供科学依据。试验采用RT-PCR方法,对阳性猪瘟样品进行CSFV的E0及E2基因的扩增,经克隆、测序后,利用DNAStar软件对序列进行比对分析,同时绘制系统遗传进化树。结果表明,从阳性猪瘟样品中成功扩增CSFV的E0及E2基因。序列比对分析发现,GX2毒株与参考毒株的E0基因核苷酸同源性在83.1%~94.1%,其推导氨基酸同源性在85.9%~99.6%;与参考毒株的E2基因核苷酸同源性为81.7%~93.7%,其推导氨基酸同源性为89.0%~97.0%;E0与E2基因均属于基因Ⅱ群。氨基酸变异位点分析表明,E0蛋白的RNase活性区域氨基酸基序位点没有发生变异;E2蛋白中15个位点上的半胱氨酸均未发生变异,但单抗识别位点S734R发生变异。遗传进化分析显示测定的GX2毒株与近年来广西CSFV流行毒株的变异趋势相似,与中国传统疫苗株HCLV、经典强毒株Shimen的同源性较低,亲缘关系较远,与广西近年来的流行毒株GXWZ02株的同源性较高,亲缘关系较近。     

鸡传染性喉气管炎病毒王岗株gC和gD基因的克隆及序列分析

根据已发表的传染性喉气管炎病毒（ＩＬＴＶ）ＳＡ－２株的核酸序列,设计了１对引物,以ＩＬＴＶ－中国王岗株ＤＮＡ为模板,ＰＣＲ法扩增出１条１．３９ｋｂ的基因片段,将扩增产物插入到真核表达质粒ｐＣＲ＾ＴＭ３－Ｕｎｉ,得到重组质粒ｐＴＡ－ｇＤ,另将克隆到ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ质料中的ｇＣ基因酶毁后,插入到ｐＣＲ＾ＴＭ３－Ｕｎｉ载体,得到重组质粒ｐＴＡ－ｇＣ,经电泳分析、酶分、ＰＣＲ鉴定后,进行序列测