水稻抗白叶枯病T-DNA插入突变体侧翼序列的分离和分析

采用PCR-walking方法对水稻抗白叶枯病突变体G48的侧翼序列进行分析。通过特异性嵌套引物扩增和序列比对分析获得了该突变体T-DNA左、右边界侧翼序列,确定T-DNA插入水稻日本晴第三染色体clone OSJNBa0076E06(AC132215.1)位点上,左、右边界插入位点分别位于该克隆的第93 750、93 824碱基处。PCR-walking方法为T-DNA的侧翼序列分析提供了一种简单、高效的方法。     

苹果树腐烂病菌T-DNA插入突变体表型及致病突变体研究

【目的】筛选苹果树腐烂病菌T-DNA插入表型或致病突变体,为研究该病菌的表型及致病相关基因提供起始材料。【方法】从建立的T-DNA插入突变体库中,随机挑选230株突变体菌株进行表型观察及致病性测定,并对部分致病突变体进行TAIL-PCR侧翼扩增。【结果】大部分的突变体与野生型菌株03-8在表型及致病性方面无明显差异,仅30.87%的突变体表现出了明显的变化;其中16株突变体(占突变体总数的6.95%)致病性发生了明显的增强,而表型与03-8相比无明显的变化;20株突变体(占突变体总数的8.69%)致病性与03-8无显著性差异,但是表型发生了明显的变化;16.1%的突变体则同时表现出表型及致病性的显著差异,其中28株表现为致病性显著降低,7株致病性丧失。通过对15株致病突变体侧翼序列的扩增,获得了7条T-DNA侧翼序列,其中突变体X912的侧翼序列被注释为黄曲霉(Aspergillus flavus)阿魏酸酯酶B前体。【结论】获得了多个不同的苹果树腐烂病菌表型或致病突变体,为研究该病菌的生长发育及致病相关基因奠定了良好的基础。     

扩增T-DNA插入位点侧翼序列的方法及其应用进展

T-DNA作为转化载体在植物分子生物学研究中得到广泛的应用。T-DNA插入位点侧翼序列的扩增方法有许多,常用的主要有热不对称交错PCR法（TAIL—PCR）、反向PCR法（I—PCR）和质粒挽救法（plasmid rescue）。笔者综述了这些方法的原理、优缺点和应用,为以T-DNA建立突变库研究植物功能基因组学提供新的途径。     

T-DNA插入突变及其研究进展

T-DNA插入突变在反向遗传学和功能基因组学研究中发挥着重要作用。文中综述了T-DNA插入突变的原理以及在拟南芥和水稻等模式植物中的研究现状,同时指出了该技术的优缺点及发展方向。     

一种快速·有效分离T-DNA插入位点的侧翼序列的方法——DW-ACP-PCR技术

DW-ACP-PCR(DNAWalking-Annealing control primer-PCR)是一种分离已知DNA序列的侧翼未知序列的新技术。该技术通过3个嵌套的特异引物分别和ACPC复性控制引物组合,进行3步连续的PCR反应,所有反应可以在1 d内完成。ACP的特殊结构能有效地控制非特异扩增。用DW-ACP-PCR技术扩增7个稻瘟菌T-DNA插入突变体的T-DNA插入位点的侧翼序列,均获得了特异目标片段。     

稻瘟菌若干T-DNA插入突变体初步分析

为揭示稻瘟菌致病分子机制,创建了该菌T-DNA插入突变体库．部分突变体经表型分析,获得3个生长发育及致病性同时发生变异,5个生长发育正常但致病性变异及2个生长发育变异但致病性正常的突变体；以TAIL-PCR方法获得了这些突变体T-DNA插入位点及其边界序列,并用生物信息方法对被T-DNA标签的基因进行了分析,为进一步研究这些基因的功能提供了重要信息．     

棉花黄萎病菌的研究

棉花黄萎病菌的研究中国农业科学院植保所石磊岩棉花黄萎病是世界性的棉花上一种重要病害。最早发现于１９１４年美国弗吉尼亚州的陆地棉上，目前在中国、原苏联、秘鲁、巴西、阿根廷、墨西哥、乌干达、刚果、阿尔及利亚、坦桑尼亚、澳大利亚、土耳其、叙利亚、以色列、印...     

水稻T-DNA插入突变体库筛选及其突变特征研究

采用水培方法大规模苗期筛选水稻T-DNA插入突变体库,以苗期表观症状为参考指标,从2 173个T1代家系中共筛选分离出表型突变家系145个。突变体类型分为4类,即氮营养缺陷型突变型、白化苗型、黄化苗型、植株矮小型。     

用T-DNA插入突变的方法获得稻瘟病菌致病突变体

利用农杆菌介导转化的方法共得到1 114个稻瘟病菌转化子,经感病大麦和水稻离体叶片接种鉴定获得3个致病缺陷或下降突变体:A1-134、A1-452、和A2-1-8,其中A1-134和A1-452的致病性下降,而A2-1-8突变体的致病性丧失.对这些突变体的分生孢子形态、产孢、附着胞形成等表型分析的结果发现,A1-134突变体的产孢量显著下降,仅为野生菌株Guy11的7.7,分生孢子为圆球形,无隔膜或只有一个隔膜;A1-452产孢量明显增多,为Guy11的22倍;A2-1-8的分生孢子为长针形,产孢量略有下降;A1-134和A1-452在疏水表面的附着胞形成率与Guy11相近,而A2-1-8则不能形成附着胞.研究结果为进一步鉴定和分离这些突变体的T-DNA标记基因奠定了基础.     

稻瘟菌T-DNA插入突变体的培养基筛选试验

采用3种培养基进行稻瘟菌[Magnaporthe grisea（Hebert）Barr,无性世代为Pyricularia oryzae（Cooke）Saccard。]菌落生长及产孢条件的分析。结果表明,在相同条件下,3种培养基中以PDA琼脂培养基最适宜于稻瘟菌突变体的生长,在产孢培养条件观察中也发现,PDA琼脂培养基中的突变体产孢效果最好。     

拟南芥atcwinv1基因T-DNA插入纯合突变体PCR鉴定及表型观察

以拟南芥atcwinvl 基因T-DNA插入纯合突变体和野生型植株为材料,比较研究了2种基因型植株在营养期和生殖期的形态差异.结果表明:拟南芥atcwinvl 基因T-DNA插入纯合突变体(简称突变体)较野生型萌发率平均下降5.88个百分点;突变体在44 d抽薹,较野生型延后4d;分支数平均4支,较野生型下降20.84...     

转抗草甘膦基因烟草T-DNA侧翼序列的扩增与分析

[目的]研究抗草甘磷基因在烟草中的插入位点、T—DNA结构等整合情况。[方法]利用现有的3个转抗草甘膦基因的烟草材料,通过PCR Walking的方法扩增出携带抗草甘膦基因的T-DNA侧翼序列,并用DNAMAN、BLAST等生物信息学方法进行分析。[结果]对获得的PCR条带进行分析,结果表明这些侧翼序列均含载体骨架序列且结构各不相同。T-DNA和载体骨架序列都存在重组现象。[结论]研究在转基因植株中检测到了载体的骨架结构,说明转基因的同时有可能会造成非目的基因的转移,即转基因植物存在一定的风险,应对转基因植物转化载体和基因工程技术路线进一步改良。     

一株玉米弯孢叶斑病菌生长缓慢型突变株获得及T-DNA右翼序列分析

本试验采用农杆菌介导的遗传转化方法获得了1个菌落生长缓慢型的突变体,通过抗性基因(hph)的扩增及分子杂交验证了T-DNA以单拷贝的方式插入基因组中.对突变体的一些生物学性状与野生型CX-3比较,结果发现突变体的菌落生长速度是野生型CX-3的42%,其产孢量为野生弄CX-3的18%,但是对离体玉米叶片的致病力与野生型C...     

陕西大丽轮枝孢菌系营养体亲和性及致病性研究

应用Ｎｉｔ突变体技术，对陕西９种寄主作物上的３８个大丽轮枝孢丽系进行了营养体亲和性研究。结果表明，３８个菌系中２个未产生Ｎｉｔ突变体，２个未产生Ｎｉｔ１和Ｎｉｔｍ突变体，其余３４个菌系产生了Ｎｉｔｌ突变体，其中８个又产生了Ｎｉｔｍ突变体。对３４个菌系进行营养体亲和性测定结果分为４个亲和群（ＶＣＧ）。不同亲和群菌系致病力和寄主来源存在差异。     

棉花黄萎病菌ITS序列的获得及系统进化分析

为探明从河南安阳棉区分离的棉花黄萎病菌的系统进化关系,利用真菌内转录间隔区通用引物ITS1和ITS4对来自安阳地区的棉花黄萎病菌内转录间隔区(ITS)进行PCR扩增,得到542bp大小的片段,经过克隆、测序和在GenBank中进行BLASTN分析,证明了该片段来自大丽轮枝菌的ITS区,也进一步证明该棉花黄萎病菌是大丽轮枝菌。同时,对该序列在NCBI的GenBank进行了登记,登记号为EU835817。利用该ITS序列与GenBank中搜索到的黄萎病菌ITS序列一起构建了相应黄萎病菌的系统进化树,在进化树上所搜索到的13个大丽轮枝菌都聚类到一个进化枝上,而且中国报道的植物黄萎病菌,包括安阳地区黄萎病菌在内的3个大丽轮枝菌在进化树上处于相邻的位置,表明:这3个菌可能具有相同的起源。这些结果有助于理解棉花黄萎病安阳菌株的进化地位,该ITS序列还可以应用于棉花黄萎病安阳菌株的特异分子鉴定。     

新疆棉花黄萎病菌营养体亲和性的量化评估及其营养体亲和群体研究

从 16个采自新疆不同棉区的棉花黄萎病菌 (Verticilliumdahliae)菌株和 3个落叶型与非落叶型对照菌株上共获得 2 2 5个不能利用硝酸盐的营养体突变株 (nitmutants)。经不同氮源利用的鉴定 ,89 33%属于nitA ,9 33%属于nitB ,1 33%属于nitC ,其中nitC在以NaNO2 作为唯一氮源的MO2 培养基上被完全抑制致死。nitA配nitB的营养体亲和性测定结果 ,16个新疆菌株均与非落叶型对照菌株亲和———属于同一营养体亲和群 (VCG) ,未发现新疆有与落叶型对照菌株亲和的棉花黄萎病菌。以互补指数作为营养体亲和性量化评估指标 ,反映出不同突变类型间亲和性差异较大 ;同一VCG内不同菌株间互补指数也有差异 ,但无明显规律     

批量筛选水稻T-DNA插入突变体库获得生殖发育相关突变体

针对花器官形态和种子发育突变表型对大型水稻T-DNA插入突变体库进行筛选,获得了大量突变体信息及材料,在9 760个突变体家系中筛选得到177个花器官形态和数量异常的突变家系,突变频率为1.81%;对9 760个家系中的3 432个家系筛选得到179个种子发育缺陷的突变家系,突变频率为5.22%。对所获得的270个突变家系进行了T-DNA插入的阳性检测,阳性率为64.8%。利用公共数据库RMD(Rice MutantDatabase,RMD)给定的侧翼序列,鉴定了其中1个结实率较低的突变体家系,表明其突变表型和T-DNA插入共分离,为深入研究该基因的功能提供了重要的遗传材料。     

一个水稻T-DNA插入类病斑突变体的初步研究

从T-DNA插入突变体中筛选到一个类病斑突变体AZT91,主要表现为生长缓慢、植株矮小、叶片出现条状褐斑,最后死亡。对突变体及其后代分离群体进行潮霉素抗性检测,证明该突变体是由T-DNA插入突变引起的,突变性状与T-DNA共分离。PCR和TAIL-PCR分析进一步证明了上述的观点。利用TAIL-PCR扩增了左边界侧翼序列,通过分析,初步推测该突变体可能是由于T-DNA插入后激活了单加氧酶基因的过量表达,破坏正常代谢途径,导致突变体死亡。该材料可用于水稻代谢调控机理的研究。