利用手工克隆技术培育体细胞克隆莱芜猪

为探讨手工克隆技术在克隆中国地方猪种的可行性,本研究组利用手工克隆技术平台,以中国地方猪品种莱芜猪的耳皮肤细胞作为核移植的供体细胞,以体外成熟的猪卵母细胞为受体细胞,进行体细胞克隆猪培养,成功培育了25头克隆莱芜猪。表明手工克隆技术可应用于莱芜猪体细胞克隆,为莱芜猪的保种及育种提供了新的途径。     

提高猪胚胎发育能力和克隆效率的研究进展

体细胞克隆对猪有广阔的发展前景,但由于克隆技术操作程序复杂、成功率低(1%～2%),又限制了该技术的广泛应用。近年来,随着人们在猪的体细胞克隆相关机理、关键技术环节上研究的不断深入,克隆猪生产流程得以简化、成本降低。此外,猪体细胞克隆技术的迅速发展,为转基因猪研制提供了一种更加便捷、有效、经济的技术平台。本文综述了近年来对提高猪克隆胚胎发育能力及克隆效率所取得的进展,旨在为进一步提高猪体细胞克隆生产效率提供参考。     

通过胚胎成纤维细胞核微注射进行猪克隆

猪克隆对优化猪肉生产和人类外源器官移植具有重大作用。我们为了从已分化的细胞进行猪克隆 ,将猪胚胎成纤维细胞核微注射入去核的卵母细胞 ,然后用电激活的方法诱导其发育。共将 1 1 0个克隆胚胎移植到 4头替代母猪体内 ,产生了一头外表正常的雌性仔猪。其毛色表明了其克隆来源 ,并以ＤＮＡ微卫星分析予以了确证通过胚胎成纤维细胞核微注射进行猪克隆@张贤群     

科技

牧医所发现猪克隆胚胎发育关键候选基因近日,中国农业科学院北京畜牧兽医研究所动物基因工程与种质创新团队研究发现与猪体细胞克隆胚胎初次分裂时间相关的关键候选基因,为提高猪克隆胚胎的发育效率、解析体细胞克隆机制提供了理论基础。相关研究成果在线发表在《基因(Genes)》上。     

体细胞克隆猪胚胎的研究进展

自"多利"羊问世以来,体细胞克隆研究已取得了很大进展,相继获得了牛、山羊、鼠等克隆动物.相对而言,猪的体细胞克隆研究进展较慢,其主要原因是猪的生殖细胞、胚胎体外显微操作难度较大;妊娠维持有别于其他家畜,需具备一定量的胚胎数.所以直至2000年才有所突破,获得了体细胞克隆后代.然而,猪体细胞核移植的效率很低,用占移植卵母细胞的比例来衡量,只有1%～2%.本文主要就猪体细胞克隆的关键技术加以简要论述,供参考.     

我国一杂交商品猪IgM恒定区CH3-CH4亚区的克隆与表达

目前，国内对猪免疫球蛋白方面的研究较少，赵凯等于1999年对猪IgGH链进行了克隆和表达一。BOSCH等克隆了猪的IgM链，但至今未有关于猪IgM功能区蛋白表达方面的研究报道。本文将对我国一商品杂交品种皮杜猪的IgMCH3-CH4区进行了PCR扩增、克隆、序列测定和分析，并通过表达载体进行表达。其目的是为以后进一步研究IgM抗体亚区的功能打下基础。     

韩国科学家用骨髓干细胞克隆猪获成功

韩国一个研究小组近日宣布利用骨髓干细胞成功克隆出猪，较之动物克隆研究中大多采用的体细胞克隆，新成果采用的方法可使猪的克隆成功率大幅提升。     

猪圆环病毒2型高敏感性细胞的克隆

利用有限稀释法从现有PK15细胞系中克隆出一株对猪圆环病毒2型具有高敏感性的细胞克隆株PKK,初步研究了该克隆株对猪圆环病毒2型增殖的特性及稳定性。间接免疫荧光实验结果表明将该克隆株连续传代50代后对猪圆环病毒2型感染性不变,病毒滴度最高可达10^7.0TCID50/mL.这一研究结果将有利于进一步研究猪圆环病毒2型体外复制、体外诊断及开发高效价的PCV2全病毒灭活疫苗。     

猪IFN-γ基因的克隆与序列分析

猪IFN-γ具有强烈的抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用，作为生物药荆和疫苗佐剂具有广阔的应用前景。通过对猪PBMC刺激诱导，提取总RNA，然后采用RT—PCR技术成功克隆了猪IFN-γ基因。序列分析表明，克隆到的基因序列与NCBI GenBank上登载的猪IFN-γ基因序列完全一致。该基因的成功克隆为IFN-γ的进一步研究和开发奠定了基础。     

猪圆环病毒2型PK15细胞系高敏感性细胞的克隆

利用有限稀释法从现有PK15细胞系中克隆出一株对猪圆环病毒2型具有高敏感性的细胞克隆株PKK,初步研究了该克隆株对猪圆环病毒2型增殖的特性及稳定性。间接免疫荧光实验结果表明将该克隆株连续传代50代后对猪圆环病毒2型感染性不变,病毒滴度最高可达107.0TCID50/mL。这一研究结果将有利于进一步研究猪圆环病毒2型体外复制、体外诊断及开发高效价的PCV2全病毒灭活疫苗。     

猪基因分离方法的研究进展

基因的分离是猪基因组学研究的基础,它为将其应用于育种实践提供可能,本文综述了分离猪基因的主要方法,包括功能克隆、定位克隆、定位候选克隆、DDRT-PCR(DifferentDisplayRT-PCR)、基因芯片、比较基因组方法和电脑克隆等方法。     

电融合/激活对于巴马小型猪体细胞克隆胚胎生产的影响

本试验旨在建立适用于猪体细胞克隆的融合/激活体系(试验1),优化融合/激活条件以提高重构卵融合率和激活率,为生产足够数量的克隆胚胎用于胚胎移植最终诞生体细胞克隆猪奠定条件。首先比较脉冲时间确定适合体细胞克隆的最佳融合/激活参数,然后利用此参数验证巴马小型猪耳部成纤维细胞克隆胚胎的发育潜能。结果显示:场强100 V/mm,3次电脉冲,脉冲时间为30μs时适于猪体细胞克隆。在试验2中,利用巴马小型猪耳部成纤维细胞为供体细胞构建体细胞克隆胚胎,得到了较高的卵裂率(83.1%)和囊胚发育率(12.4%)。     

内窥镜法猪克隆胚胎移植研究

传统的手术法开展猪克隆胚胎移植会使受体母猪的创伤比较大,术后恢复慢和容易伤口感染等会影响克隆胚胎着床,从而影响移植成功率;同时,受体利用率低。为摸索新的猪克隆胚胎移植方法,和提高受体在胚胎移植中的利用次数,降低受体手术应激,应用内窥镜开展了20头猪克隆胚胎移植试验,结果分娩1头(4头活仔),移植成功率仅为5%。研究表明,内窥镜法开展猪克隆胚胎移植是可行的,但还需要继续摸索总结,才能提升移植成功率,熟练和标准化操作是内窥镜移植能否成功的关键。     

体细胞克隆猪胚胎的研究进展

猪的体细胞克隆研究进展相对较慢,其主要原因是猪的生殖细胞、胚胎体外显微操作难度较大;妊娠维持有别于其他家畜,需具备一定量的胚胎数.所以直至2000年才有所突破,获得体细胞克隆后代[1,2].近几年来在这些方面都进行了大量深入的研究,几个研究小组都得到了体细胞克隆猪.然而猪体细胞核移植的效率非常低.用占移植卵母细胞的比例来衡量,只有1%～2%.本文就猪体细胞克隆的关键技术加以论述.     

猪膜联蛋白A2多克隆抗体的制备、亲和纯化与鉴定

本研究旨在制备并亲和纯化兔抗猪膜联蛋白A2多克隆抗体。通过PCR从质粒pA2-EGFP中将编码猪膜联蛋白A2与增强型绿色荧光蛋白融合基因(Annex A2-EGFP)亚克隆到pET-30a(+),构建了原核表达质粒p30a/AE,转化大肠杆菌Rosetta(DE3),经IPTG诱导以包涵体形式表达了猪ANNXA2-EGFP融合蛋白,用Ni-Resin HP树脂对表达的目的蛋白进行亲和纯化。用纯化的ANNXA2-EGFP融合蛋白免疫兔,制备兔抗猪膜联蛋白A2多克隆抗体。将以前纯化的猪可溶性GST-ANNXA2融合蛋白偶联NHS活化琼脂糖凝胶FF,亲和纯化多克隆抗体。用GST-ANNXA2亲和纯化的多抗效价达到1∶12800,Western blot和免疫组化结果证实具有高特异性。制备的高效价和高特异性兔抗猪膜联蛋白A2多克隆抗体,为进一步研究膜联蛋白A2在病毒感染中的作用奠定了基础。     

猪热休克蛋白40(Hsp40)的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备

克隆猪热休克蛋白40 (heat shock protein 40,Hsp40)基因并构建其原核表达载体,以纯化的猪Hsp40蛋白为抗原免疫兔制备抗猪Hsp40多克隆抗体。参照GenBank收录的猪Hsp40全基因序列,设计1对特异性扩增其CDS区全序列的引物,利用RT-PCR方法扩增猪Hsp40基因;扩增产物经双酶切后定向克隆至原核表达载体pCzn1-His,测序无误后转化Arctic Express (DE3) RP感受态高效表达宿主菌,优化其表达条件(时间、IPTG浓度、温度)后,将可溶性的猪Hsp40重组蛋白用His-Band Ni^+层析柱进行纯化,用纯化的His-Hsp40重组蛋白免疫兔以制备多克隆抗体。采用抗原亲和纯化法对制备的多抗进行纯化,并采用间接ELISA法检测抗体效价。利用Western blot检测重组蛋白的免疫原性和反应原性,以及抗体的特异性。结果显示,克隆得到的猪Hsp40基因片段长度为1 485 bp,表达出的可溶性His-Hsp40重组蛋白相对分子质量约为57 800,制备出的猪Hsp40蛋白多克隆抗体效价为1∶512 000,且该多抗能够特异性识别His-Hsp40重组蛋白和猪肺泡巨噬细胞中的Hsp40蛋白。结果表明,成功克隆了猪Hsp40基因,表达并纯化了猪Hsp40蛋白,制备的兔抗猪Hsp40蛋白多克隆抗体能够有效地应用于猪Hsp40蛋白抗原的检测。     

克隆猪的胚胎移植技术及其应用

胚胎移植是生产克隆猪的重要环节。猪的胚胎移植技术目前在我国还处于起步阶段,中国农业大学生产的克隆胚胎在河北明慧集团有限公司二元母猪场进行了胚胎移植试验．并最终成功地接生了克隆仔猪。此次成功,也为猪胚胎移植技术的普及和今后转基因猪的生产做出了巨大贡献。     

研究发现猪克隆胚胎发育关键候选基因

正中国农业科学院北京畜牧兽医研究所动物基因工程与种质创新团队研究发现与猪体细胞克隆胚胎初次分裂时间相关的关键候选基因,为提高猪克隆胚胎的发育效率、解析体细胞克隆机制提供了理论基础。相关研究成果在线发表在《基因(Genes)》上。     

猪Lp-PLA2多克隆抗体制备

制备猪脂蛋白相关磷脂酶A2(Lp-PLA2)多克隆抗体,有利于研究猪Lp-PLA2与炎症发生的相关性。本试验利用基因克隆技术构建猪Lp-PLA2原核表达载体,表达重组蛋白,并对表达条件进行优化;使用Ni-NTA树脂亲和层析纯化该蛋白质,免疫家兔,制备猪Lp-PLA2多克隆抗体;并用western blot对获得的抗体进行免疫检测。电泳结果显示猪Lp-PLA2原核表达载体构建成功;SDS-PAGE结果表明,猪Lp-PLA2在1 mol/L IPTG、37℃条件下,表达于菌体中;western blotting显示,该抗体与猪源Lp-PLA2有良好的交叉反应。因此,该多克隆抗体的制备为进一步利用猪作为动物模型研究炎症性疾病奠定了基础。     

猪整合素β3多克隆抗体制备与鉴定

为了制备猪整合素β3多克隆抗体,试验利用大肠杆菌原核表达系统,对密码子优化的猪整合素β3基因主要抗原区进行原核表达,表达的重组蛋白纯化后,免疫Balb/c雌性小鼠,采血后分离血清,进一步通过ELISA和Western-blot对制备的猪整合素β3多克隆抗体进行鉴定。结果表明:猪整合素β3基因主要抗原区获得了成功表达,表达蛋白分子质量为102 ku左右,以纯化重组蛋白作为免疫原制备的多克隆抗体效价为1∶12 800,且能识别天然猪整合素β3。