1株重组型番鸭细小病毒的分子特征解析

为了对1株番鸭细小病毒(MDPV)分离株NY18株的分子特征予以准确揭示,通过设计重叠PCR 引物,扩增NY18株的完整基因组并进行了测序.结果显示,NY18株基因组由5 071个碱基组成,5'和3'端末端倒置重复序列(inverted terminal repeats,ITR)均由424个碱基组成,其外侧385个碱基...     

鹅细小病毒DY16株的分子鉴定及重组分析

为了了解鹅细小病毒(goose parvovirus,GPV)田间分离株是否存在变异可能,本研究对GPV分离株DY16进行了全基因组测序和重组分析。DY16株基因组由5 046个碱基组成,与国内外的5个强毒株同源性在98.1%以上。末端倒置重复(inverted terminal repeats,ITR)由414个碱基组成,与已报道的多个GPV强毒株同样在ITR的回文区茎部存在14个碱基对缺失。Simplot软件在DY16株VP1基因内部检测到2个重组信号,序列比对显示DY16株位于重组第1区域的10个和重组第2区域8个核苷酸位点分别与匈牙利的B株和国内弱毒疫苗株SYG61v相一致,而不同于先前的国内强毒株,但均未产生氨基酸改变。不同来源毒株在VP1基因内部重组对于GPV致病性的影响有待深入探究。     

鹅细小病毒鹅胚化疫苗株SYG61v对雏鹅毒力减弱的遗传基础分析

本研究对鹅细小病毒(Goose parvovirus,GPV)SYG61v弱毒疫苗株与5个分离于不同年代的GPV强毒株,在编码蛋白氨基酸序列及非编码调控区碱基序列进行了比对,确定了SYG61v的特征性突变位点,而5个强毒株中这些位点均高度保守。SYG61v株的VP1和Rep1蛋白,分别产生了11个和10个氨基酸位点突变。Rep1的10个突变氨基酸中,7个均处于Rep1蛋白羧基端的100个氨基酸范围内,而VP1蛋白中的10个突变氨基酸中,推测仅有1个位点处于病毒衣壳表面。在左侧末端倒置重复序列(inverted terminal repeat,ITR)与P9启动子之间非编码区,存在两段共7个碱基的连续碱基突变。SYG61v弱毒株中突变位点的确认为进一步明确他们各自在弱毒株毒力减弱中的作用奠定了基础。     

Ⅰ型鸭肝炎病毒A66弱毒株全基因组分子克隆及序列分析

采用RT-PCR法对Ⅰ型DHV A66弱毒株基因组全序列进行了分子克隆与测序.研究结果表明,不含Poly(A)尾巴的A66株的基因组全长为7 704个核苷酸残基,包括626个核苷酸残基的5′端非编码区、6 750个核苷酸残基的开放阅读框和314个核苷酸残基的3′非编码区.应用分子生物学软件将A66株与GenBank公布的其他DHV-Ⅰ全基因序列进行同源性比较分析,结果表明,除了90D和04G两株变异株外,A66株ORF的核苷酸序列与其他各株的同源性在94.3%～99.7%之间,氨基酸序列的同源性在97.3%～99.6%之间,并且A66与C80、JX弱毒株的核苷酸和氨基酸序列的同源性均很高,在99.4%以上,各毒株氨基酸序列同源性比核苷酸同源性略高.Ⅰ型DHV病毒基因组的一级结构高度保守.     

鹅细小病毒HN株的分离鉴定及全基因组序列分析

为研究鹅细小病毒(GPV)基因遗传变异特征,采集海南某养鹅场疑似鹅细小病毒感染的病料,将其处理后接种番鸭胚成功分离到一株病毒,经PCR鉴定为鹅细小病毒,命名为HN株,并获得了其全基因组序列,将该序列与GenBank数据库中登录的16条鹅和番鸭细小病毒基因序列进行了比对分析。结果显示,该株病毒基因组全长为5 106bp,由ITR、NS、VP构成,其中ITR为444bp,NS1为1 844bp,VP1为2 199bp;HN株与SHFX1201株的NS1基因和VP1同源性最高,分别达到99.8%和99.7%,与番鸭细小病毒株FM的NS1基因同源性最低,为82.7%;与90-0215株VP1同源性最低,为80.1%。HN株的遗传进化树可以看出,GPV可以分成明显的2个基因亚群,HN株与鹅细小病毒匈牙利株(B)、欧洲疫苗株(VG32/1)和台湾株(82-0321V、82-0321、06-0329)均处在第I亚群,且与安徽分离株Y株以及SHFX1201株同源性最接近,番鸭源匈牙利株FM单独处于第Ⅱ亚群。本研究丰富了GPV的数据资料,为研究GPV分类地位以及遗传进化关系提供了依据,同时也为研究GPV流行趋势和疫苗的开发奠定了基础。     

IBV D41株主要结构基因及3′端非编码区序列分析

采用反转录及聚合酶链式反应 ( RT-PCR) ,成功地扩增出鸡传染性支气管炎病毒 ( IBV)人工致弱毒D41株 S1基因、M基因、N基因和基因组 3′端非编码区 ( U TR)的 c DNA。序列测定结果表明 :D41株的 S1基因全长 1611bp(从 ATG到 S前体蛋白裂解位点 ) ,编码一条由 53 7个氨基酸组成的多肽 ;M基因全长 678bp,编码一条由 2 2 6个氨基酸组成的多肽 ;N基因全长 12 3 0 bp,编码一条由 410个氨基酸残基组成的多肽 ,3′端 UTR长度为52 5bp,其中高变区 ( HVR)长度为 2 2 5bp。与国内外已报道的一些 IBV标准毒株的相应基因序列进行核苷酸序列同源性分析后发现 :D41株与麻省血清型的毒株同源性最高 ,尤其与国际常用的标准疫苗株 H52和 H12 0的亲缘关系最接近。但它与国内“腺胃型”毒株 QXIBV在系统发生进化树上却相隔较远     

鹅细小病毒辽宁分离株全基因测序与遗传演化分析

为研究辽宁地区鹅细小病毒的遗传演化及分子生物学等特征,参考GenBank已公布的鹅细小病毒DY16毒株设计8对引物,对辽宁分离株全基因分段进行扩增并测序,采用DNAMEN软件将测序结果依次拼接后进行序列比对分析。结果表明:辽宁分离株基因序列全长5 106 bp,并命名为LNGPV20。基因组5'端和3'端具有一致的末端倒置重复序列(ITR),均由444个碱基组成,包括362个碱基配对形成的回文茎部、43个碱基构成的泡区以及39个碱基不参与序列的反向互补配对。辽宁分离毒株与14个毒株全基因序列同源性在93.2%～98.9%之间,表明国内鹅细小病毒全基因序列同源性较高,可能是近年来养鹅业迅速发展,鹅苗流通增加,交叉感染所致。     

一株猪蓝耳病毒的分离鉴定及其全基因组序列的比较分析

从湖北省某猪场分离了一株猪蓝耳病毒(CH-WH-19)，其基因组全长是14993 bp。同源性分析结果显示CH-WH-19与NADC30、JXA1、CH-1a、VR-2332和GM2的相似性分别为91.9%、84.3%、83.9%、83.3%和80.5%，但是与欧洲型的毒株Lelystad virus相似性仅有58.9%。GP5基因和全基因组的进化树分析显示，CH-WH-19与NADC30毒株处于同一分支。Nsp2基因氨基酸比对结果发现，CH-WH-19和NADC30毒株与VR2332毒株相比具有不连续的131个氨基酸缺失的特征。同源性和进化树的结果都显示了CH-WH-19属于新变异的类NADC30毒株。GP5序列比对结果表明，CH-WH-19有一些氨基酸的突变，A137是疫苗株VR2332的标志，但CH-WH-19毒株突变成了S，N34是四个潜在的N-糖基化位点之一，突变成了D。试验表明，本研究分离了一株变异的NADC30毒株，生物学特性分析也表明属于类NADC30毒株。     

四川彭州猪流行性腹泻流行株全基因序列测定及其遗传变异分析

为了对四川省彭州某免疫过猪流行性腹泻病毒(PEDV)疫苗猪场猪感染的PEDV毒株基因组特征和遗传变异规律进行研究,本试验采用RT-PCR法筛选PEDV阳性样本,命名为SCXM株,对全基因组序列克隆测序获取全基因组序列,并对主要结构基因进行遗传变异分析和系统进化分析。结果显示,SCXM株的遗传变异主要集中在S基因,与71个毒株相比同源性为90.4%～99.2%,与猪场免疫疫苗株CV777相比同源性仅为93.8%。与国内常用疫苗毒株相比,在5个线性抗原表位(P1、S1P2、S1P3、SS5和SS6)和1个中和抗原表位(SID)均存在氨基酸位点突变。遗传进化分析表明,SCXM株属于G2b亚型PEDV,与湖北HBXY3株和越南毒株同在一个分支,表明这些地区流行毒株的演化过程存在相关性。另外对ORF3、M和N基因分析结果显示,SCXM与疫苗株相比均存在一定数量的氨基酸突变,但变异程度相对较小,且未引起抗原性预测值的变化。结果表明,PEDV SCXM株属新型变异毒株,其S基因发生较大程度的变异,S基因多个氨基酸突变和抗原性的变化可能是导致猪场疫苗免疫失败的原因之一。本研究丰富了PEDV基因学研究资料,探讨了SCXM株PEDV遗传变异和演化特征,为PEDV的分子演化研究奠定了基础。     

羊口疮病毒疫苗株与野毒株VIL-10基因的比较分析

试验旨在比较分析羊口疮病毒(orf virus,ORFV)VIL-10基因在疫苗株和野毒株之间的差异特征。参照GenBank中公布的ORFV NZ2株的VIL-10基因序列设计并合成1对特异性引物,分别以疫苗株和野毒株提取的基因组DNA为模板,采用PCR方法扩增ORFV的VIL-10基因全序列并进行测序,应用生物信息学相关软件分析基因的核苷酸、氨基酸变异情况及蛋白结构。结果显示,本试验测定的疫苗株和野毒株VIL-10基因核苷酸序列同源性为94.4%,差异主要是单个碱基的突变,其中疫苗株在132~134bp核苷酸序列出现缺失;氨基酸序列同源性为92.5%,出现了15个氨基酸位点的突变,其中疫苗株第42位氨基酸天冬酰胺出现缺失;蛋白质在一级结构及理化性质、二级结构、三级结构、抗原表位参数及有无信号肽之间均存在一定程度的差异,而疫苗株和野毒株编码的蛋白质均无跨膜结构域。系统进化树分析结果表明,本试验测定的野毒株与疫苗株属于不同分支,遗传关系较远。研究结果提示,野毒株与疫苗株的VIL-10基因发生较明显的变异,这些变异可能与ORFV疫苗株的毒力致弱有关。     

牛病毒性腹泻病毒CC13B株全基因组序列及分析

从长春地区某牛场发生疑似为牛病毒性腹泻-黏膜病的病牛粪样中分离到1株病毒,经序列测定为牛病毒性腹泻病毒命名为BVDV CC13B株。核苷酸序列的测定结果显示,CC13B毒株的完全基因组序列由12 265个核苷酸组成,其中5′端非编码区包含380个核苷酸,3′端非编码区包含188个核苷酸。病毒基因组含有1个大的读码框架,编码1个由3 898个氨基酸组成的前体多聚蛋白。序列对比结果显示,CC13B毒株的核苷酸和氨基酸序列与国外CP-5A毒株同源性最高,分别为为96.2%和97.3%;而与国内分离株JZ05-1的同源性最低,分别为69.8%和71.0%。系统进化树分析结果表明,CC13B毒株与国内分离的长春184、Xinjiang-3156和H等分离株归类为BVDV基因Ⅰ型的Ib基因亚型。结果表明,长春地区近年发生的牛病毒性腹泻-黏膜病依然主要由BVDV基因Ⅰ型毒株引起。     

虎源猫杯状病毒的分离及其基因组遗传变异分析

从贵州省某动物园因发热、呼吸道等症状死亡的东北虎脾脏组织中分离得到1株猫杯状病毒(FCV),命名为FCV-YH/16。采用RT-PCR的方法扩增了该病毒的全基因组,序列测定显示,FCV全基因组长7 687 nt(GenBank序列登录号为KX815169),该基因组包含3个开放阅读框。基因组核苷酸序列分析显示,该毒株与12Q087-1、 GD、SH和FB-NJ-13在一个大的分支上,而与疫苗株F4、F9和F65等不在一个分支上;其中与12Q087-1基因组同源性最高为80.5%,与疫苗株F9同源性最低为76.3%;衣壳蛋白氨基酸进化分析显示,与21株国内外代表株相比,该毒株的VP1氨基酸序列发生了9处新的单个氨基酸变异,5个区域的3个连续的氨基酸发生了变异,这些变异是否影响病毒毒力还需进一步研究。     

一株鹅细小病毒全基因特征分析

根据GenBank登录的鹅细小病毒基因序列和基因组结构特征,采用PCR技术扩增获得一株鹅细小病毒株（Goose parvovirus,GoPV）全基因序列,为中国大陆地区首次报道。GoPV株病毒全基因大小为5106nt,其基因组5’端和3’端均含有相同的末端倒置重复序列（inverted terminal repeats, ITR）,ITR全长为444nt。GoPV基因组主要由左右两侧两个开放阅读框组成,左侧编码非结构蛋白（non-structureprotein,NS）NSl和NS2,右侧编码3种结构蛋白（viral structural protein,VP）VP1、VP2和VP3。NS基因全长为1884nt（537-2420nt）,其中NS2全长1356nt（1065～2420nt）;VP基因全长2199nt（2439-4637nt）,其中Ⅵ叼全长1764nt（2874-4637nt）,VP3全长1605nt（3033-4637nt）,在其右侧的ITR前有一个Poly（A）的尾。GoPV株病毒全基因和欧洲疫苗株（EU583392（VG32／1,Europe））核苷酸同源性最高,高达98．6％。本研究为进一步研究GPV分类地位以及进化关系提供依据,也为研究GPV强毒株和疫苗株之间生物学特性以及GPV治病机理和开发基因工程疫苗奠定基础。     

马立克氏病病毒“814”疫苗株基因组重复区序列测定及分析

为了解马立克氏病病毒(MDV)强、弱毒株主要致肿瘤相关基因变异情况,本研究根据MDV GA株基因组序列,设计合成扩增基因组重复区的引物,得到MDV814疫苗株病毒基因组中约26kb的序列片段。与GenBank登录的强、弱毒株进行比较分析表明,扩增的MDV1型814疫苗株的长重复区为12774bp,预测的开放阅读框(ORF)有48个;短重复区为11426bp,预测的ORF有38个。发现了4个MDV814株特有的ORF。814株在编码Meq、RLORF6和23ku的重叠基因内具有类似于疫苗株CVI988的177bp的插入;在RLORF12基因编码区内存在69bp的缺失,该缺失位于病毒复制起始位点内。同时,发现7个814疫苗株特有的氨基酸突变,分布在6个ORF内。单核苷酸多态性(SNP)的鉴定发现,多个基因具有单核苷酸的突变,主要分布于Meq基因,其中氨基酸A115V(丙氨酸-缬氨酸),N142D(天冬酰胺-天门冬氨酸)的变异是814疫苗株所特有的。MDV814疫苗株重复区的基因序列的比较分析将有助于MDV致肿瘤机制的研究。     

四川彭州猪流行性腹泻流行株全基因序列测定及其遗传变异分析

为了对四川省彭州某免疫过猪流行性腹泻病毒（PEDV）疫苗猪场猪感染的PEDV毒株基因组特征和遗传变异规律进行研究,本试验采用RT-PCR法筛选PEDV阳性样本,命名为SCXM株,对全基因组序列克隆测序获取全基因组序列,并对主要结构基因进行遗传变异分析和系统进化分析。结果显示,SCXM株的遗传变异主要集中在S基因,与71个毒株相比同源性为90.4%~99.2%,与猪场免疫疫苗株CV777相比同源性仅为93.8%。与国内常用疫苗毒株相比,在5个线性抗原表位（P1、S1P2、S1P3、SS5和SS6）和1个中和抗原表位（SID）均存在氨基酸位点突变。遗传进化分析表明,SCXM株属于G2b亚型PEDV,与湖北HBXY3株和越南毒株同在一个分支,表明这些地区流行毒株的演化过程存在相关性。另外对ORF3、M和N基因分析结果显示,SCXM与疫苗株相比均存在一定数量的氨基酸突变,但变异程度相对较小,且未引起抗原性预测值的变化。结果表明,PEDV SCXM株属新型变异毒株,其S基因发生较大程度的变异,S基因多个氨基酸突变和抗原性的变化可能是导致猪场疫苗免疫失败的原因之一。本研究丰富了PEDV基因学研究资料,探讨了SCXM株PEDV遗传变异和演化特征,为PEDV的分子演化研究奠定了基础。     

鸡肾型IBV山东分离株核蛋白基因的遗传变异分析

应用RT-PCR方法扩增到了山东省2006-2007年分离的10株肾型IBV核蛋白(N)基因片段,并将其进行了克隆、序列测定及分析.结果发现,10株肾型IBV分离株核蛋白基因均含有1个长1 230 bp的ORF,编码由409个氨基酸残基组成的多肽,未发现碱基的插入和缺失.与GenBank中的20个IBV参考毒株核蛋白基因序列进行比较和分析,发现10株肾型IBV分离株主要分布于2个群中.第Ⅰ群与弱毒疫苗株H120和参考毒株D41、D1466的亲缘关系较近,第Ⅱ群与参考毒株LX4、GDS14的亲缘关系较近.对核蛋白基因及其局部功能区序列比较发现,山东分离株与H120疫苗株核蛋白相比存在广泛的氨基酸变异,以点突变为主,突变位点无明显规律性.     

3株樱桃谷鸭源新型鹅细小病毒的分离及分子特征解析

为了深入揭示引起樱桃谷鸭短喙与矮小综合征（SBDS）的新型鹅细小病毒（NGPV）的鹅胚增殖特性及分子特征,对从山东省不同地区采集的3份SBDS典型病例在9日龄鹅胚上进行了病毒分离,并对其全基因组序列及编码蛋白序列进行比对。结果成功分离到3株NGPV,分别为SDHT16、SDJN19和SDLC19。3株病毒均能在鹅胚中稳定传代,但致死鹅胚的时间明显长于经典型GPV。3株NGPV之间基因组的同源性高达98.9%～99.7%,而与经典GPV强毒株的同源性则稍低,为95.2%～96.1%。基于3株NGPV与已发表的NGPV毒株和经典GPV强毒株的编码蛋白比对分析显示,与国内经典GPV强毒株相比,NGPV毒株结构蛋白VP1共产生了16个氨基酸点突变,其中9个氨基酸位点与欧洲的B株相同;非结构蛋白Rep1则产生了12个氨基酸位点突变。与经典GPV LH株的末端倒置重复序列（ITR）相比,SDHT16、SDJN19和SDLC19在ITR的回文区茎部分别多出2、4、4个碱基,ITR的同源性达到98.1%～100.0%,而与LH株的同源性为93.0%～94.0%。本研究结果为今后进一步深入研究NGPV的...     

北京鸭源鹅出血性多瘤病毒的分子检测

鹅出血性多瘤病毒(Goose hemorrhagic polyomavirus,GHPyV)是鹅出血性肾炎肠炎的致病病原,迄今为止,国际上已从鹅、番鸭和半番鸭中检测到GHPyV。为了解北京鸭是否存在GHPyV的感染,本研究从北京、山东、河北、河南等地的北京鸭种鸭场采集肝脾组织样品68份,并用GHPyV特异性PCR进行了检测。结果显示,从5份肝脾组织样品中检出GHPyV的VP1基因。选一株北京鸭源GHPyV(106株)测定了基因组序列。测序结果显示,北京鸭源GHPyV基因组长度为5 254bp,相对于德国鹅源GHPyV毒株Germany 2001,106株基因组在其编码区共有10个碱基位发生突变,但只有2个碱基位的突变引起氨基酸的置换;此外,106株基因组的非编码区存在2个核苷酸的缺失。对不同水禽来源的GHPyV基因组序列进行比较的结果表明,GHPyV的基因组序列具有高度保守性。由于GHPyV可感染鹅、番鸭、半番鸭和北京鸭,表明该病毒具有较广泛的宿主范围。     

水貂犬瘟热CDV_3疫苗株基因组序列测定及H基因遗传稳定性分析

对水貂犬瘟热CDV3疫苗株基因组进行全序列测定与分析,以阐明该疫苗株的来源亲本毒株,基因特征及H基因遗传稳定性。将CDV3疫苗株基因组cDNA分9个重叠片段进行RT-PCR并克隆入pMD 18-T载体中,测定全长cDNA序列。并与CDV野毒参考株和疫苗株N、F和H基因氨基酸序列比对分析其基因变异情况。通过对CDV3疫苗株6个不同生产批次(Vero细胞培养代次)H基因序列测定以分析毒株的分子遗传稳定性。基因序列分析结果表明:CDV3疫苗株基因组全长15 690 bp,与CDV野毒株基因组同源性较低(93.0%~95.3%)。H基因核苷酸和氨基酸序列与Lederle疫苗株(EF418783)同源性最高,分别为99.6%和98.7%。而6个不同培养代次CDV3疫苗株H基因氨基酸序列无任何差异。由此证实CDV3疫苗株的亲本毒株与Lederle疫苗株有着最密切关系,不同培养代次的CDV3疫苗株H基因具有较高的遗传稳定性。     

雏番鸭细小病毒和传染性法氏囊病病毒混合感染的检测

2017年12月,广西某番鸭养殖场的鸭群出现生长缓慢,临床表现软脚,拉白色粪便的腹泻并伴有一定的神经症状等;剖检可见肝脏肿大出血、腹腔有纤维素性渗出物、肠黏膜有不同程度的充血,法氏囊萎缩等病变;于20日龄开始发病,30日龄送检时发病率20%、死亡率10%。无菌取番鸭的病变组织,分别进行番鸭细小病毒(MDPV)和传染性法氏囊病病毒(IBDV)的核酸特异性检测,结果均呈阳性,并成功分离到一株番鸭细小病毒(命名为MDPV GX1712)和一株传染性法氏囊病病毒(命名为GL1712);基因序列分析结果显示,分离株GX1712与GX5、P 1988、 SAASSHNH等MDPV参考株的亲缘性最近,相似性高达98.5%～99.1%,在进化树中处同一个分支,并且与疫苗株FZ91-30亲缘性相距较远,表明该分离株为MDPV野毒株;基于VP1-b序列分析IBDV分离株GL1712与中国新型超强毒株HLJ0504同属HLJ0504-like cluster,而基于vVP2序列则与中等偏强毒力参考株同属C2-intermediate IBDV genotype,为基因重排毒株。根据发病日龄、临床症状、病理剖检和实验室诊断,确诊该临床发病番鸭群混合感染了番鸭细小病毒和传染性法氏囊病病毒。