雏鸡肠组织β1基因的鉴定及时空表达特性

设计1对引物,建立RT-PCR方法对β1基因mRNA进行鉴定;以GAPDH基因为内参,建立检测鸡β1基因表达水平的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法,并用此方法测定1²0日龄雏鸡不同肠段组织β1基因表达水平。结果显示,从鸡肠组织成功鉴定出β1基因mRNA;检测内参基因GAPDH和目的基因β1的实时荧光定量PCR方法扩增效率一致(扩增曲线斜率差<0.1),满足使用比较Ct值法对β1基因mRNA进行相对定量分析的前提;扩增曲线、熔解曲线及凝胶电泳结果提示该方法特异性好。实时荧光定量PCR检测结果表明,1日龄雏鸡十二指肠和盲肠、10日龄雏鸡空肠和直肠、5日龄雏鸡回肠组织中β1基因相对表达量最高。结果表明,鸡肠组织中存在β1基因表达,并在不同日龄不同肠段表达水平存在差异。     

家禽beta-连环蛋白基因绝对定量PCR方法的建立及应用

根据GenBank中公布的原鸡beta-连环蛋白(β-catenin)参考序列设计特异性引物扩增得到β-catenin基因,并克隆到真核表达载体pcDNA3.1中作为荧光定量PCR标准品;同时利用软件设计家禽β-catenin的荧光定量PCR引物,建立检测β-catenin的绝对荧光定量PCR方法。并利用该方法检测病毒感染组与非感染组1日龄雏鸡不同组织中β-catenin基因的分布和表达情况。结果显示,在感染和非感染病毒的1日龄雏鸡中,β-catenin基因在脑组织中表达水平最高,而在脾脏和法氏囊中表达水平较低。结果表明,成功建立了检测家禽β-catenin基因的绝对定量PCR方法,并检测了β-catenin基因在1日龄雏鸡不同脏器中的表达情况,为进一步研究其生物学功能提供了技术手段。     

雏鸡肠组织β1基因的鉴定及时空表达特性

设计1对引物,建立RT—PCR方法对β1基因mRNA进行鉴定;以GAPDH基因为内参,建立检测鸡β1基因表达水平的sYBRGreenI实时荧光定量PCR方法,并用此方法测定1～20日龄雏鸡不同肠段组织81基因表达水平。结果显示,从鸡肠组织成功鉴定出β1基因mRNA;检测内参基因GAPDH和目的基因β1的实时荧光定量PCR方法扩增效率一致（扩增曲线斜率差〈0．1）,满足使用比较Ct值法对B1基因mRNA进行相对定量分析的前提;扩增曲线、熔解曲线及凝胶电泳结果提示该方法特异性好。实时荧光定量PCR检测结果表明,1日龄雏鸡十二指肠和盲肠、10日龄雏鸡空肠和直肠、5日龄雏鸡回肠组织中β1基因相对表达量最高。结果表明,鸡肠组织中存在β1基因表达,并在不同日龄不同肠段表达水平存在差异。     

不同ELISA检测方法在检测出壳雏鸡禽白血病病毒感染中的应用

通过雏鸡胎粪中群特异性衣壳蛋白27(p27)抗原检测以判定禽白血病病毒(ALV)垂直传播是实施禽白血病净化的关键步骤,为对比不同ALV-p27抗原ELISA试剂盒对我国四类广泛流行的亚群ALV垂直传播的检测效果,本试验设置ALV-A、ALV-B、ALV-J和ALV-K感染组,以无菌生理盐水作为对照组,在8胚龄时以卵黄囊接种的方式感染SPF鸡胚,建立鸡胚携带ALV-A、ALV-B、ALV-J和ALV-K的垂直感染模型。采集各组雏鸡胎粪样品和血浆样品,死亡鸡胚肝脏样品,死亡雏鸡胎粪样品、血浆样品和肝脏样品,其中血浆和肝脏样品需接种鸡胚成纤维细胞系(DF-1细胞)进行病毒分离,各样品以4家公司提供的ALV-p27抗原ELISA试剂盒进行检测,并以实时荧光定量PCR(RT-qPCR)进行平行检测,比较阳性检出率和灵敏度。结果显示,4家公司的ALV-p27抗原ELISA试剂盒对于同一样品的阴阳性判定结果基本一致,但灵敏度存在差异;胎粪样品直接ELISA检测不能将ALV阳性鸡只全部检出,相对于胎粪样品,血浆和肝脏病毒分离样品ELISA检测更具有灵敏度优势。本试验所建立的对比方法不仅有助于评估4家公...     

禽白血病病毒衣壳蛋白P27慢病毒载体的构建及其在鸡肝癌细胞中的表达

为构建禽白血病病毒(ALV)衣壳蛋白P27慢病毒表达载体,并检测其在鸡肝癌细胞LMH中的表达,试验以实验室前期构建的pcDNA3.1-p27为模板,扩增p27基因,克隆入pLVX-IRES-ZsGreen1载体,构建的重组质粒命名为pLVX-p27,与辅助质粒psPAX2和pMD2.G共转染至HEK293T细胞,包装获得表达p27基因的重组慢病毒。将慢病毒上清感染293T和LMH细胞,检测细胞中p27基因的转录水平和蛋白表达水平。结果显示:重组质粒pLVX-p27构建正确,收集的慢病毒上清滴度为9×10⁴TU/mL;实时荧光定量PCR、Western blot和共聚焦荧光试验结果显示P27蛋白主要定位于胞浆,p27基因的RNA和蛋白表达量在感染后96 h内随着感染时间延长逐渐升高。研究表明:表达p27基因的慢病毒包装成功,并且能感染293T及禽源LMH细胞,为进一步研究P27的生物学功能提供了工具。     

雏鸡肠组织中CD44的鉴定及时空表达特性

为了解CD44分子在雏鸡肠组织内的表达及其时空表达特性,设计1对引物,建立RT-PCR方法对CD44mRNA进行鉴定;以GAPDH基因为内参,建立检测鸡CD44基因表达水平的SYBR Green Ⅰ实对荧光定量(Q-PCR)方法,对1～28日龄商品鸡肠组织不同部位中CD44 mRNA表达水平进行检测.结果显示,从鸡肠组织中成功鉴定出CD44 mRNA,建立的荧光定量方法能特异性检测到CD44 mRNA,CD44和GAPDH基因的扩增效率分别为95％和101％,线性范围均在108～104拷贝/μL,敏感度高,最低检测限分别为45和77个拷贝.建立的CD44SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法具有特异、灵敏、快速、重复性好等优点.雏鸡不同日龄,不同肠组织中CD44表达水平有所差异,5～20日龄时的空肠组织和5～10日龄时的直肠组织中CD44表达量较高.     

家禽糖原合成酶激酶-3β基因荧光定量PCR方法的建立及应用

旨在建立家禽糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)基因荧光定量方法并检测分析马立克病病毒(MDV)感染雏鸡不同脏器组织中GSK-3β基因的表达水平。参考GenBank中提供的GSK-3β参考序列设计全长基因的扩增引物,构建pCAGGS-GSK-3β重组质粒作为阳性标准品,并绘制标准曲线,建立了家禽GSK-3β荧光定量PCR方法。通过家禽GSK-3β基因荧光定量PCR方法检测MDV感染雏鸡不同组织脏器中GSK-3β基因的分布和表达变化。检测表明,病毒感染雏鸡中脑组织表达GSK-3β水平最高(P<0.000 1),最低的是盲肠组织(P<0.000 1);而正常对照组雏鸡中GSK-3β表达水平最高的也是脑组织,较低的是肝脏组织和胰腺组织。本研究为进一步探究GSK-3β的生物学功能提供了理论依据。     

鸡胚胎期及新生期肝脏中瘦素受体的表达

本研究通过实时荧光定量PCR的方法检测了14、18日胚龄鸡胚以及2日龄雏鸡肝脏中瘦素受体的表达情况.结果表明:瘦素受体在14、18日胚龄鸡胚以及2日龄雏鸡肝脏中均有表达;随着胚胎及个体的发育,瘦素受体的表达水平降低.     

鸡传染性贫血病病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

根据鸡传染性贫血病病毒(chicken infectious anemia virus,CAV)基因组保守区域设计1对特异性引物和探针,通过优化反应条件,建立了一种快速检测CAV的TaqMan实时荧光定量PCR方法,同时验证其特异性、灵敏性和重复性.本试验建立的TaqMan实时荧光定量PCR方法灵敏度可达1.8×10¹拷贝/μL,远高于常规PCR方法;并与禽类其他病毒性疾病无交叉反应,具有高特异性.用分离的病毒人工感染1日龄SPF雏鸡,14日龄剖检,对感染鸡体内各器官的病毒分布及载量进行检测,结果表明,在脑、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胸腺、法氏囊和血清中均可检测到病毒,肝脏、胸腺病毒载量明显高于其他组织.本研究建立的TaqMan实时荧光定量PCR方法特异性强、灵敏度高、重复性好,可同时检测大量临床样品,适用于CAV的诊断与流行病学分析.     

REV对SPF雏鸡细胞凋亡相关miRNA及其靶基因表达的影响

为探究禽网状内皮组织增生病病毒(Reticuloendotheliosis virus,REV)对SPF雏鸡细胞凋亡相关信号通路的影响,通过REV感染1日龄雏鸡后,对其临床症状、大体病理学变化进行观察,并应用高通量测序及实时荧光定量PCR方法,检测并验证其法氏囊中与细胞凋亡信号通路相关的miRNA及其靶基因表达情况。结果显示:SPF雏鸡感染REV后第21天法氏囊萎缩最显著,法氏囊中gga-mir-18a-5p、gga-mir-155和gga-mir-222b-5p表达量显著下调,其靶基因分别为Caspase-6、Caspase-7和p27,上述靶基因表达量显著上调;同时还发现gga-mir-29b-3p表达量上调,其靶基因Mcl-1表达量下调。证明REV通过下调gga-mir-18a-5p、gga-mir-155和gga-mir-222b-5p以及上调gga-mir-29b-3p的表达量,来降低或增加对其靶基因的抑制,从而使促凋亡因子Caspase-6、Caspase-7和p27的表达量显著增加,同时抑凋亡因子Mcl-1表达量显著减少来促进细胞凋亡的发生。研究结果为REV致病机理的相关研究提供了理论依据。     

STC-1基因在大、小体型猪中表达与分布的差异分析

试验分别采集40日龄小体型猪（巴马猪）和大体型猪（大白猪）的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、头骨、骨骼肌组织,利用实时荧光定量PCR检测斯钙素-1（stanniocalcin 1,STC-1）基因mRNA在各个组织中的表达水平,并通过Western blotting检测STC-1蛋白在各个组织中的分布。实时荧光定量PCR检测结果表明,STC-1基因mRNA在巴马猪和大白猪肺脏、肾脏中相对表达水平较高,在骨骼肌中的表达水平最低;除心脏和骨骼肌外,巴马猪其余各组织中STC-1基因mRNA表达水平均显著高于大白猪（P < 0.05）。Western blotting检测结果表明,巴马猪肝脏中STC-1蛋白的表达量最高,而大白猪脾脏中STC-1蛋白表达量最高,两者差异显著（P < 0.05）;巴马猪肺脏、肝脏、骨骼肌及心脏组织中STC-1蛋白表达量均极显著高于大白猪（P < 0.01）;而巴马猪肾脏、脾脏中STC-1蛋白表达量极显著低于大白猪（P < 0.01）。本研究首次对大、小体型猪不同组织的STC-1基因mRNA表达水平及其STC-1蛋白分布进行检测,导致该基因表达与分布差异的原因可能与两种猪受外界环境应激及生长发育差异有关。     

IBDV感染雏鸡不同组织Mx基因的分布研究

为了探究传染性法氏囊病病毒(IBDV)感染雏鸡后抗病毒基因Mx在其体内不同组织的表达变化,试验以IBDV感染3天(22日龄)的SPF蛋鸡为研究对象,应用实时荧光定量PCR方法,检测了IBDV感染组雏鸡与对照组雏鸡法氏囊、盲肠扁桃体、脾脏、胸腺、肝脏、腺胃、十二指肠、卵巢等组织中Mx mRNA和IBDV VP2 mRNA表达水平。结果表明:IBDV感染雏鸡3 d后,Mx mRNA在盲肠扁桃体中表达水平最高,显著高于其他组织(P0.05);其次为法氏囊和肝脏;卵巢表达量最低(P0.05)。IBDV感染组雏鸡各组织Mx mRNA表达水平均显著高于对照组(P0.05)。IBDV感染雏鸡3 d后,IBDV VP2 mRNA在法氏囊中的表达量最高(P0.05),脾脏次之,其他被检组织无统计学差异(P0.05)。说明雏鸡感染IBDV 3 d后,IBDV载量在免疫器官较非免疫器官高;抗病毒基因Mx转录表达水平相对都比较高,其转录表达水平与器官的病毒载量没有明显的相关性。     

猪圆环病毒2型TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

本研究以猪圆环病毒2型(PCV2)核衣壳蛋白ORF2基因为目的基因,设计合成特异性引物和探针。PCR扩增得到目的基因,并克隆到pMD18-T载体,筛选得到标准阳性质粒。通过对荧光定量PCR反应条件的优化,建立了PCV2的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。试验结果表明,该方法特异性强,对猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)等猪常见病原的检测结果均为阴性;与普通PCR方法相比,其敏感性高出100倍,可达100拷贝/μL;对临床样品的检测证明,该方法可有效检测出淋巴结、肺脏等组织中的PCV2。     

鸡宿主限制因子SAMHD1实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立一种快速检测chSAMHD1表达量的方法,本研究以SPF鸡外周血单个核细胞总cDNA为模板,构建了包含chSAMHD1全长CDS的重组质粒pMD-chSAMHD1。跨chSAMHD1内含子设计1对荧光定量PCR特异性引物,以构建的重组质粒作为标准品,建立chSAMHD1实时荧光定量PCR检测方法,并对其敏感性、特异性及重复性进行验证,将其应用于1日龄SPF鸡组织chSAMHD1表达量的检测。结果显示:用建立的实时荧光定量PCR方法对5×10^8~5×10^4拷贝/μL的标准质粒进行检测,所得标准曲线呈现良好的线性关系;最低检测限为50拷贝/μL,灵敏度是普通PCR的100倍;特异性良好,仅能检测到鸡源细胞中SAMHD1基因;重复性好,组内和组间变异系数均小于2%;应用该方法检测1日龄正常SPF鸡心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、脑、神经、胸腺、法氏囊、十二指肠、腿肌、腺胃等组织的chSAMHD1基因拷贝数,结果显示chSAMHD1具有广泛的组织分布性。本研究为chSAMHD1功能研究提供了一种准确、有效的检测手段。     

小鼠细胞因子实时定量PCR检测方法的建立及应用

采用荧光SYBR Green I建立小鼠细胞因子mRNA实时定量PCR的检测方法;并利用建立的实时定量PCR的检测方法时感染H5N1禽流感病毒的BALB/c小鼠不同时间采集的肺脏组织中几种重要致炎细胞因子及趋化因子mRNA表达水平进行了检测.对HSN1禽流感病毒感染的BALB/c小鼠肺脏细胞因子的检测具有高度的特异性,检测的灵敏度为10~1～10~2拷贝数.H5N1禽流感病毒感染BALB/c小鼠后,小鼠肺脏中IL-1β、IL-6、TNFα、MIG、IP-10、RANTES、MIF和HMGB1细胞因子mRNA表达水平与时照组小鼠相比均有明显差异.建立的实时定量PCR能在基因转录水平敏感和特异地反应细胞因子的表达水平,该技术在基础和临床免疫研究中,具有良好的应用价值.     

猪圆环病毒3型荧光定量PCR检测方法的建立及其在猪体中的组织分布研究

为了解猪圆环病毒3型(PCV3)在猪体中的组织分布情况,针对PCV3 Cap蛋白基因设计筛选出一对特异性引物和探针,通过对荧光PCR引物、探针浓度进行优化,建立了基于TaqMan探针实时荧光定量PCR技术的PCV3检测方法,并应用该方法对人工感染PCV3猪的多种组织器官进行病毒含量检测。结果显示,建立的PCV3实时荧光定量PCR检测方法特异性较好且灵敏度高,可检测低至1 copy/μL的PCV3病毒核酸量,而对其他几种常见猪病毒病原的检测结果均为阴性。PCV3主要存在于肺脏、淋巴结,在扁桃体和脾脏中有少量存在。试验表明,所建立的荧光定量PCR检测方法可用于PCV3的快速定量检测,对PCV3在猪体中的组织分布情况的研究为进一步揭示PCV3的组织嗜性和致病机理提供理论依据。     

反转录病毒载体RCASBP介导的EGFP基因在DF-1细胞中的表达

为建立反转录病毒载体RCASBP介导的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因在DF-1细胞中的表达体系,本研究将PCR获得的EGFP基因插入反转录病毒载体RCASBP,构建重组反转录病毒载体RCASBP-EGFP,之后将重组载体转染DF-1细胞;用基于禽白血病病毒(ALV) p27抗原的ELISA检测盲传至第4代的细胞上清,ELISA阳性结果说明重组病毒拯救成功;荧光显微镜观察发现80%以上DF-1细胞都有明显的绿色荧光信号,证明DF-1细胞表达绿色荧光蛋白;对DF-1细胞基因组进行特异性PCR检测,扩增出特异性条带说明重组反转录病毒载体RCASBP-EGFP携带的EGFP基因整合到DF-1细胞的基因组中。本研究建立的RCASBP介导反转录病毒表达体系为研究ALV基因的结构和功能奠定了基础。     

实时荧光定量RT-PCR检测禽白血病病毒J亚群

将禽白血病病毒J亚群(ALV-J)NX0101毒株接种1日龄和7日龄SPF雏鸡并设阴性对照组,采用实时荧光定量RT-PCR方法,定期检测病毒在体内的复制情况。根据GenBank发表的ALV-Jenv基因保守序列(AY897227)设计1对特异性引物扩增目的基因;根据鸡的3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因序列(K01458),在保守区内设计1对引物扩增内参照基因,分别克隆入质粒作为标准品制作标准曲线,采用SYBR GreenⅠ染料建立荧光定量PCR法,并对方法的特异性、敏感性和重复性进行评价。结果显示,标准曲线的Ct值与标准品浓度的对数值之间存在线性关系;最低每个反应可检测到60个拷贝的病毒数,比常规PCR灵敏度高1 000倍。检测结果分别采用绝对定量法和相对定量法进行分析,都达到了良好的效果。通过对病毒含量变化的检测发现,在雏鸡4周龄时,2个接毒组ALV-J病毒突然呈对数式增长。据此分析ALV-J病毒在体内经过3~4周潜伏后,突然呈暴发式增长,这种情况可能和临床表现的免疫抑制直接相关。结果表明,本试验建立了一种特异性强、敏感性高、可定量分析ALV-J病毒增殖的方法,为进一步相关研究奠定了基础。     

鸡肌肉组织实时荧光定量PCR及Western杂交内参基因的筛选

本研究对5种常用"持家基因"作为鸡肌肉组织发育早期基因和蛋白检测内参基因的有效性进行了评价,为鸡肌肉发育相关分子检测中内参基因的选择提供科学依据。应用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和Western blot技术,分别检测了鸡12胚龄、17胚龄、1日龄和14日龄胸肌中β肌动蛋白(ACTB)、β微管蛋白(TUBB)、TATA结合蛋白(TBP)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)和热休克蛋白70(HSP70)的mRNA和蛋白表达水平。结果表明,在鸡发育早期胸肌组织中,仅HSP70mRNA和蛋白在各阶段间表达水平差异不显著,GAPDH、TUBB、TBP和ACTB的mRNA和蛋白表达水平在检测的各个时间点间均差异显著或极显著(P0.05或P0.01)。HSP70更适合作为鸡肌肉发育早期基因和蛋白检测的内参基因。本结果为研究发育期鸡肌肉组织相关功能基因和蛋白提供了必要的方法学基础,对其他物种的相关研究也有重要借鉴意义。     

羊凋亡细胞因子Fas、FasL、TNFR1和TNF-α实时荧光定量检测方法的建立

为探讨羊痘病毒感染后机体的凋亡细胞因子mRNA表达水平的变化,深入探讨羊痘病毒免疫机制,本研究设计针对羊凋亡细胞因子Fas、FasL、TNFR1和TNF-α特异性引物,建立羊凋亡细胞因子实时荧光定量方法。分别建立荧光定量PCR反应体系并进行优化。结果表明:Fas、FasL、TNFR1和TNF-α的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR各基因的溶解曲线均呈单一溶解峰。组内变异系数均小于2.00%。本研究建立的羊凋亡细胞因子SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测方法为凋亡细胞因子mRNA表达水平提供了技术平台。