家禽beta-连环蛋白基因绝对定量PCR方法的建立及应用

根据GenBank中公布的原鸡beta-连环蛋白(β-catenin)参考序列设计特异性引物扩增得到β-catenin基因,并克隆到真核表达载体pcDNA3.1中作为荧光定量PCR标准品;同时利用软件设计家禽β-catenin的荧光定量PCR引物,建立检测β-catenin的绝对荧光定量PCR方法。并利用该方法检测病毒感染组与非感染组1日龄雏鸡不同组织中β-catenin基因的分布和表达情况。结果显示,在感染和非感染病毒的1日龄雏鸡中,β-catenin基因在脑组织中表达水平最高,而在脾脏和法氏囊中表达水平较低。结果表明,成功建立了检测家禽β-catenin基因的绝对定量PCR方法,并检测了β-catenin基因在1日龄雏鸡不同脏器中的表达情况,为进一步研究其生物学功能提供了技术手段。     

HA蛋白多肽抗体的设计、制备与鉴定

利用人工合成的多肽制备HA的特异性多克隆抗体,以期用于HA基因的免疫调控机制研究。根据GenBank中报道的皮蝇素A（HyderminA,HA）一级结构信息以及HA抗原生物学信息,获得三段序列特异性较高的多肽,采用9一氟甲氧羰基固相合成法获得多肽,采用HPLC和LC·MS测定合成多肽的浓度和分子量,试验表明目的多肽纯度达91．2％、目的多肽分子量为28kD。将多肽与KLH进行偶联,并用其免疫新西兰大白兔以获得抗血清和多克隆抗体。采用ELISA和Western blotting测定其效价和特异性,经ELISA检测表明抗血清可与Pep发生特异性免疫反应,经Western blotting试验表明抗血清和多克隆抗体可识别HA特异性条带,其相对分子量为28kD,与预测分子量相符。该抗体的制备为研究HA免疫调控机制提供了有用工具。     

山羊β雌激素受体多克隆抗体的制备及免疫组化方法的建立

本研究旨在克隆济宁青山羊雌激素受体β(ERβ)基因,进行原核表达,制备多克隆抗体,建立免疫组化分析方法,检测济宁青山羊卵巢和子宫内ERβ分布。根据GenBank发布的绵羊ERβ基因序列设计一对引物,应用RT-PCR方法从济宁青山羊卵巢组织中扩增ERβ部分基因。经双酶切和测序分析后,连接到原核表达载体pET32a(+),构建重组表达载体pET32a(+)-ERβ,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和Western blotting分析鉴定;经Ni-NTA纯化融合蛋白后免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体,并检测抗体效价及特异性;使用该抗体检测济宁青山羊卵巢和子宫组织细胞中的ERβ分布。结果表明,成功扩增出ERβ部分基因,并构建原核表达质粒,转化至大肠杆菌中表达出相对分子质量约为53ku的融合蛋白;Western blotting证明该融合蛋白能与兔抗人的ERβ多克隆抗体特异性反应。制备的多克隆抗体经ELISA检测效价达到1∶213,以此抗体代替购置的标准兔抗人ERβ抗体,进行Western blotting反应,特异性良好;使用该抗体建立免疫组化方法检测结果表明济宁青山羊卵巢颗粒细胞和子宫内膜上皮细胞、平滑肌细胞存在ERβ的分布。本研究获得特异性兔抗山羊ERβ多克隆抗体,使用该抗体建立免疫组化方法首次报道了济宁青山羊卵巢和子宫ERβ的分布表达,为进一步研究β雌激素受体的生物学功能奠定了方法学和形态学基础。     

鸡MHCⅠα和β2m的原核表达与多克隆抗体的制备

为制备MHCⅠ基因工程疫苗的基础材料,构建了鸡MHCⅠ分子重组质粒并进行原核表达,进而制备鸡MHCⅠ分子的多克隆抗体。应用PCR方法,克隆鸡MHCⅠα和β2m基因,构建重组载体pETMHCⅠα和pET-MHCⅠβ2m,经PCR、双酶切和测序鉴定后,将重组质粒在大肠埃希菌Rosetta中进行诱导表达,融合蛋白纯化后,接种昆明小鼠制备多克隆抗体,血清稀释后用免疫印迹法(Western blot)分析。结果表明,鸡MHCⅠα和β2m基因在大肠埃希菌中成功表达,融合蛋白分子质量分别约为52.1ku和33.0ku;制备的鼠抗鸡MHCⅠα和β2m链多克隆抗体,经Western blot检测证实抗体特异性较强,可进一步用于鸡MHCⅠ分子的研究。     

扩展莫尼茨绦虫vasa基因的原核表达及多克隆抗体的制备

试验旨在表达、纯化扩展莫尼茨绦虫VASA蛋白,并制备兔抗VASA多克隆抗体。根据扩展莫尼茨绦虫全基因核苷酸序列设计特异性引物,利用PCR方法扩增vasa基因片段;将扩增产物与原核表达载体pET-22b(+)连接,获得重组质粒pET-22b-VASA;经Amp抗性筛选阳性菌,双酶切、PCR测序鉴定后,将其转化大肠杆菌(DE3)感受态细胞中,并进行IPTG诱导表达;重组融合蛋白经镍柱纯化后,进行Western blot鉴定;将融合蛋白免疫兔,制备多克隆抗体。结果显示,重组质粒pET-22b-VASA构建正确,通过IPTG诱导获得大小约32 200的VASA重组融合蛋白;Western blot分析表明其与鼠抗His单克隆抗体呈阳性反应。纯化的VASA蛋白免疫兔获得了多克隆抗体,ELISA检测其效价为1∶128 000。本试验成功制备了具有免疫原性的VASA蛋白及其兔源多克隆抗体,为VASA蛋白生物学功能及该蛋白在绦虫体内的分布等研究奠定基础。     

肝癌细胞靶向肽的筛选与鉴定

利用噬菌体环七肽库筛选与肝癌细胞特异性结合的多肽,并对其亲和力进行生物学鉴定。以HL-7702为消减细胞,HepG2为筛选靶细胞,对噬菌体随机环七肽库进行4轮全细胞消减筛选,并随机挑取60个阳性噬菌体克隆,以ELISA法鉴定其与HepG2细胞的结合活性,并取阳性克隆进行测序分析,并合成多肽进行免疫细胞化学染色鉴定。经4轮筛选,噬菌体在靶细胞HepG2上出现明显富集;利用ELISA从随机挑选的60个噬菌体克隆中得到15个与肝癌细胞具有高结合力的阳性克隆,测序并进行序列分析比对发现氨基酸序列无同源性,经免疫细胞化学染色鉴定后,发现1条多肽序列亲和力较高,为提高抗菌肽对肿瘤细胞的靶向杀伤作用奠定基础。     

禽胰多肽小脑膜受体多克隆抗体的制备与效价测定研究

本试验对禽胰多肽小脑膜受体多克隆抗体进制备,进而进行效价测定研究。试验表明:成功制备出禽胰多肽小脑膜受体多克隆抗体,构建的多克隆抗体效价是稳定的,效价也是较为满意的。     

牛偏爱密码子优化后的Beta蛋白多克隆抗体制备

本研究旨在优化λ噬菌体bet基因,使其能够在牛细胞中高效表达,通过密码子优化及全基因合成方法制备牛bet基因,并进行原核表达和多克隆抗体制备及抗体效价评估。从GenBank中获得λ噬菌体bet基因的序列,登录号为AP005153,用牛偏爱密码子对其进行优化并将其合成。根据优化后的基因序列设计引物,用PCR扩增优化后的bet基因,随后将其克隆到pET28原核表达载体,并转化入大肠杆菌BL21中进行诱导表达。表达的蛋白产物利用亲和层析的方法进行纯化,用His tag的抗体进行Western blot鉴定。用纯化后的蛋白免疫CD1小鼠,得到抗Beta蛋白的血清,通过ELISA测定该多克隆抗体的滴度。结果表明:通过双酶切和测序,成功挑选出正确的原核表达质粒pET-bet;SDS-PAGE,电泳结果显示融合蛋白表达成功;用纯化后的蛋白免疫试验鼠后得到多克隆抗体,经Western blot检测,该多克隆抗体能与His-Beta融合蛋白特异性结合;经ELISA方法检测该多克隆抗体的滴度为1∶41 700。成功地制备了Beta蛋白的多克隆抗体,为深入探索bet基因的生物学功能和在牛及大型哺乳动物中的应用奠定了基础。     

鸭MHCⅡβ基因的克隆、表达及多克隆抗体的制备

据NCBI上已发表的序列设计引物,通过RT—PCR从北京鸭脾脏的总RNA中扩增得到MHCⅡβ基因,将其克隆至pMD18-T载体上,经酶切分析及测序鉴定后,进一步亚克隆至原核表达载体pGEX-KG中,转化大肠杆菌BL21中诱导表达。蛋白纯化后,免疫昆明小鼠制备多克隆抗体,经1：100倍稀释后用于Westernblot分析。结果表明：克隆得到了鸭MHCⅡβ链基因,大小为798bp,经核苷酸测序与已登录的基因序列同源性为92％;成功构建了原核表达载体,融合蛋白得到了高效表达且纯化后纯度达95％。制备的鼠抗鸭MHCⅡβ多克隆抗体,经酶联免疫吸附实验（ELISA）与免疫印迹法（Westernblot）证实抗体的效价高、特异性强,为深入研究鸭MHCⅡ奠定了基础。     

D型流感病毒NP蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

该研究旨在对D型流感病毒(influenza D virus, IDV)NP蛋白进行原核表达并制备多克隆抗体，为D型流感快速诊断技术奠定基础。采用PCR技术扩增D/bovine/Mississippi/c00046N/2014毒株的NP片段编码区，并对其序列进行跨膜区、信号肽、疏水键、抗原性及结构域分析，筛选出最优区段以制备多克隆抗体。该研究将IDV NP最优编码区序列插入原核表达载体pET-B2M,构建pET-B2M-NP重组阳性质粒，经PCR和测序鉴定后将重组阳性质粒转化至大肠杆菌Trelief^TM 5α中；IPTG诱导表达后采用镍柱亲和层析法纯化重组NP蛋白，并免疫新西兰白兔制备多克隆抗体。序列分析结果显示，1～500氨基酸区段无跨膜区和信号肽序列，局部亲水性好且具备良好的免疫原性，为制备重组NP蛋白的最佳抗原区段。经测序验证构建了pET-B2M-NP重组阳性质粒，转化后经IPTG诱导，主要以包涵体的形式表达了相对分子质量大小约为72 kDa的蛋白，符合预期。间接ELISA结果显示，制备的多克隆抗体效价达1∶100000且免疫原性良好。Western blo...     

绵羊Gfrα1基因的部分cDNA克隆与抗原表位多肽的原核表达

旨在克隆绵羊Gfrα1基因序列,深入研究绵羊精原干细胞(SSCs)。本研究通过RT-PCR扩增和分子克隆的方法克隆到了绵羊Gfrα1基因的编码区大部分片段。结果,克隆得到的绵羊Gfrα1基因的大部分cDNA序列长1 312bp,包括1 311bp的开放阅读框(ORF),编码437个氨基酸,与牛、人、黑猩猩、大鼠和小鼠相应核苷酸序列的同源性分别为98.5%、91.3%、91.0%、88.9%和88.0%。根据获得的cDNA序列,预测已知片段的抗原表位区,并将抗原表位区序列插入pET-44a(+)载体,经转化得到重组菌,经IPTG诱导表达,并通过亲和柱层析,纯化制备GFRα1抗原表位多肽。Western blot检测发现,经诱导表达的GFRα1抗原表位多肽约为18.2ku,与预测的大小一致。绵羊Gfrα1基因的克隆和表达研究,为进一步制作该基因的多克隆抗体奠定基础,为绵羊SSCs的分子水平鉴定及功能分析提供了研究条件。     

猪NLRP6蛋白的原核表达、纯化及其多克隆抗体的制备

试验旨在表达、纯化猪NLRP6蛋白,并制备鼠抗NLRP6多克隆抗体。根据猪NLRP6全基因核苷酸序列(GenBank登录号:XM_003124236.4)设计特异性引物,利用PCR方法从pMD-19T-NLRP6重组载体中扩增NLRP6基因片段,将扩增产物与原核表达载体pET-32a(+)连接,获得重组质粒pET-32a-NLRP6,经抗性筛选阳性菌、双酶切鉴定、PCR及测序分析后,将其转化大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞中,并进行IPTG诱导表达及Western blotting鉴定。对获得的重组融合蛋白进行可溶性分析,经变性、镍柱亲和纯化、复性后得到纯化的融合蛋白,将其免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体。结果显示,试验成功克隆大小约为576 bp的NLRP6基因序列,经鉴定重组质粒pET-32a-NLRP6构建正确,通过IPTG诱导获得大小约34 ku的NLRP6重组融合蛋白,Western blotting分析表明其与小鼠抗6×His单克隆抗体呈阳性反应。可溶性分析结果显示,NLRP6重组融合蛋白以包涵体形式存在,约占95%。纯化的NLRP6重组融合蛋白免疫BALB/c小鼠获得多克隆抗体,经Western blotting分析显示出特异性反应。本试验成功制备了具有免疫原性的NLRP6蛋白及其鼠源多克隆抗体,为NLRP6蛋白生物学功能及相关疾病致病机制研究提供了基础材料。     

猪NLRP6蛋白的原核表达、纯化及其多克隆抗体的制备

试验旨在表达、纯化猪NLRP6蛋白,并制备鼠抗NLRP6多克隆抗体。根据猪NLRP6全基因核苷酸序列（GenBank登录号：XM_003124236.4）设计特异性引物,利用PCR方法从pMD-19T-NLRP6重组载体中扩增NLRP6基因片段,将扩增产物与原核表达载体pET-32a（+）连接,获得重组质粒pET-32a-NLRP6,经抗性筛选阳性菌、双酶切鉴定、PCR及测序分析后,将其转化大肠杆菌Rosetta（DE3）感受态细胞中,并进行IPTG诱导表达及Western blotting鉴定。对获得的重组融合蛋白进行可溶性分析,经变性、镍柱亲和纯化、复性后得到纯化的融合蛋白,将其免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体。结果显示,试验成功克隆大小约为576 bp的NLRP6基因序列,经鉴定重组质粒pET-32a-NLRP6构建正确,通过IPTG诱导获得大小约34 ku的NLRP6重组融合蛋白,Western blotting分析表明其与小鼠抗6×His单克隆抗体呈阳性反应。可溶性分析结果显示,NLRP6重组融合蛋白以包涵体形式存在,约占95%。纯化的NLRP6重组融合蛋白免疫BALB/c小鼠获得多克隆抗体,经Western blotting分析显示出特异性反应。本试验成功制备了具有免疫原性的NLRP6蛋白及其鼠源多克隆抗体,为NLRP6蛋白生物学功能及相关疾病致病机制研究提供了基础材料。     

猪细小病毒NS基因原核表达与多克隆抗体制备

旨在制备抗猪细小病毒(PPV)非结构蛋白共有氨基酸的NS多肽多克隆抗体。根据GenBank(MK993540)公布的PPV基因组序列,克隆其非结构蛋白NS1、NS2共有基因序列(NS基因),并进行生物信息学分析。进而将NS基因克隆至原核表达载体pET-32a,构建重组质粒pET-32a-NS,转化至大肠埃希菌Rosetta(DE3)中进行诱导表达,利用镍柱亲和层析技术纯化表达的重组多肽,用重组多肽免疫Balb/c小鼠制备多克隆抗体。结果显示,PPV杨凌株NS基因长258bp,编码86个氨基酸的多肽,是具有亲水性的非跨膜NS多肽,具有大量的B细胞线性表位。NS多肽在37℃、0.8mol/L IPTG条件下,诱导6h有大量的可溶性表达。免疫印迹试验结果显示,该多肽具有较好的抗原性。用纯化NS多肽免疫小鼠后获得鼠抗NS多肽的血清抗体效价为1∶12800。用制备的NS多克隆抗体检测纯化的NS重组多肽及真核表达的NS1蛋白,均能检测出相应特异性条带,为进一步研究NS蛋白在PPV致病过程中的作用奠定了基础。     

北京鸭β-catenin基因cDNA的克隆和生物信息学分析

试验探讨了北京鸭β-catenin基因的生物学功能,为进一步研究该基因对鸭皮肤毛囊的影响奠定基础。以北京鸭胚胎皮肤组织为材料,根据GenBank中发表的鸡、鹅等物种的β-catenin基因序列,设计并合成4对引物,采用RT-PCR方法,克隆北京鸭β-catenincDNA,并运用DNAMAN软件及在线工具对所得到的序列进行生物信息学分析。结果表明:北京鸭β-catenin基因cDNA长度为2996bp(Genbank登录号为FJ169885),包含由2346个碱基组成的编码区(CDs),有起始密码子ATG和终止密码子TAA,编码781个氨基酸;北京鸭β-catenin基因核苷酸序列与鸡、鹅、中华鳖、人和家猪相应区段(CDs)的同源性分别为95.06%、94.12%、90.11%、84.83%、84.31%;其氨基酸序列与鸡、鹅、中华鳖、猪、人的氨基酸同源性达99%以上,表明在进化关系上,β-catenin氨基酸序列有很高的保守性。     

猪δ冠状病毒RBD蛋白多肽抗体的制备与鉴定

【目的】设计合成猪δ冠状病毒(Porcine deltacoronavirus, PDCoV)受体结合结构域(receptor binding domain, RBD)的抗原表位,制备并鉴定多克隆抗体。【方法】为了特异性检测PDCoV RBD抗原,应用生物信息学技术预测其潜在抗原表位,将表位氨基酸序列与δ冠状病毒属中的其他15株病毒株以及14株其他猪冠状病毒株进行相似性比对,将筛选的优势抗原表位与载体蛋白血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin, KLH)偶联,合成多肽并免疫小鼠,制备PDCoV RBD特异性抗体。通过Western blotting试验对不同系统表达的PDCoV RBD以及PDCoV、TGEV和PEDV感染ST细胞表达的S蛋白进行鉴定,通过间接ELISA方法测定抗体效价。【结果】经序列比对,利用生物信息学技术预测合成的表位抗原与δ冠状病毒属中的其他15株病毒株(0～14.28%)以及14株其他猪冠状病毒株(0～7.14%)序列相似性非常低,具有良好的保守性;Western blotting结果显示,制备的多肽抗体1∶500、1∶1 000、1∶2 ...     

鸡toll样受体7的克隆表达及多克隆抗体的制备

本试验旨在制备兔抗鸡toll样受体7(chicken toll-like receptor 7, chTLR7)多克隆抗体，根据GenBank已发表的chTLR7序列设计引物，采用RT-PCR方法扩增chTLR7胞外区基因片段，并构建原核表达重组质粒，通过优化蛋白表达条件，用获得的融合蛋白免疫兔制备多克隆抗体，通过免疫印迹及间接免疫荧光试验鉴定制备的兔抗chTLR7多克隆抗体的特异性。结果显示，该片段长度为1 122 bp，与预测的片段大小、碱基序列一致。构建的原核表达重组质粒pGEX-6P-1-chTLR7经IPTG诱导后，表达出预期63 kDa的重组蛋白，免疫兔可产生特异性抗体。制备的兔抗chTLR7多克隆抗体具有良好的特异性，为后续实验研究chTLR7传导通路、免疫机制等相关研究提供有利工具。     

鸭疫里默杆菌通过外膜蛋白Omp45结合鸭补体调节因子Vitronectin

旨在筛选和鉴定与鸭补体调节因子Vitronectin(Vn)结合的鸭疫里默杆菌(Riemerella anatipestifer,R.anatipestifer)外膜蛋白。在酵母表达鸭Vn及间接免疫荧光和免疫斑点杂交试验检测鸭疫里默杆菌结合Vn的基础上，以重组Vn为诱饵蛋白进行His pull-down及LC-MS/MS质谱鉴定，筛选外膜蛋白并进行生物信息学分析；原核表达候选外膜蛋白及截短片段，制备多克隆抗体，利用Far-Western blot验证与鸭Vn结合，并用间接ELISA测定肝素和氯化钠对结合的影响；测定Vn及抗外膜蛋白抗体对血清杀菌活性的影响。结果显示，鸭疫里默杆菌能在体外结合鸭Vn,经His-pull down、质谱鉴定及蛋白质结构分析，筛选出的外膜蛋白Omp45具有β桶状结构及7个暴露于细胞膜外的多肽环；成功原核表达Omp45及截短片段，制备的抗Omp45多克隆抗体间接ELISA效价超过1∶12 800,Western blot检测多克隆抗体可以与重组蛋白发生特异性反应；Far-Western blot及间接ELISA结果显示，Omp45、包含2个及以上细胞膜外多肽环的...     

猪流感病毒新型核糖体移码蛋白PA-X特有序列的原核表达、纯化及鉴定

核糖体移码蛋白PA-X是流感病毒的一种新型蛋白,为了研究该蛋白对于猪流感病毒的生物学特性的影响,我们进行了PA-X特有序列的原核表达、蛋白纯化及其鉴定。通过RT-PCR和重叠PCR方法扩增PA-X特有序列的基因,利用基因重组技术构建原核表达载体,并进行菌液PCR和菌液测序鉴定,鉴定正确后克隆转化到BL21(DE3)中,进行蛋白表达及可溶性分析,同时用镍柱亲和层析法对其进行纯化。通过菌液PCR序列鉴定,PA-X特有序列的原核表达载体序列正确,编码框正确。转化BL21后目的蛋白表达成功,且大多数为可溶性蛋白。Western blot结果表明制备的多克隆抗体具有良好的免疫反应性。     

绵羊MAVS基因的原核表达及多克隆抗体的制备

通过RT-PCR方法从绵羊肺细胞(sheep lung cells,SLT)扩增获得MAVS(mitochondrial antiviral signaling protein)基因,并将其克隆至原核表达载体pET-32a,测序鉴定结果表明成功获得重组质粒pET-32a-MAVS。将其转化至感受肽细胞BL21中,经IPTG诱导获得重组蛋白。将纯化的MAVS蛋白免疫BALB/c雌鼠,制备抗MAVS的鼠源多克隆抗体。SDS-PAGE结果表明该抗体具有良好的反应原性。MAVS多克隆抗体的成功制备为其生物学功能研究奠定了基础。