广西罗非鱼链球菌病流行菌株PCR鉴定和PFGE基因型分析

为获知近年广西罗非鱼链球菌病流行菌种及其基因型变化信息,采用特异PCR方法对2006-2012年从广西发病罗非鱼分离获得的77株临床菌株进行鉴定,并通过脉冲电场凝胶电泳(PFGE)对2006-2011年分离获得的37株流行菌株进行基因型分析.结果显示,其中20株鉴定为海豚链球菌其余57株鉴定为无乳链球菌.2006-2007年获得的19株流行菌株中有18株为海豚链球菌(94.7％),仅1株无乳链球菌;2009-2012年分离的58株流行菌株中56株为无乳链球菌(96.6％),仅2株海豚链球菌.PFGE图谱聚类显示,海豚和无乳链球菌分别聚类为两个大分支,20株海豚链球菌共产生4种PFGE带型,带型相似度为83.9％～100％;17株无乳链球菌共产生5种PFGE带型,带型相似度为47.4％～100％.研究表明,广西罗非鱼链球菌病流行菌种已从过去(2008年前)以海豚链球菌为主转变为现在(2009-2012年)以无乳链球菌为主;流行菌株PFGE基因型存在多样性.     

常见病害防治方法

罗非鱼链球菌病 病原：无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）,海豚链球菌（Streptococcus iniae）也可以引起罗非鱼大量死亡,但危害程度不如无乳链球菌。链球菌是一种革兰氏阳性、非酸性、无运动氧化酶阳性、过氧化氢酶阳性的菌。     

罗非鱼海豚链球菌16S rRNA基因的序列测定和系统进化分析

为了从分子水平上对1株致病性罗非鱼链球菌进行分类学鉴定,利用原核生物16SrRNA基因通用引物对分离纯化的罗非鱼致病性链球菌进行16S rRNA基因的克隆及序列分析。结果扩增出长约1.5 kp目的片段,测序得到1条长度为1 447 bp核苷酸序列。核苷酸相似性分析表明,序列与NCB I公布的海豚链球菌(Streptococcus iniae,S.iniae)SCCF5L菌株16SrRNA基因核苷酸序列相似性最高(99.4%),暂称为中国广西株(S.iniae-CGX)。同时,亲源关系较近的S.iniae、S.difficilis和S.agalactiae代表菌株构建的系统发育进化树显示,所得菌株与S.iniae代表菌株组成同一进化分支,与S.agalactiae代表菌株组成的另一进化分支距离较近(95.5%),而与S.difficilis代表菌株组成的进化分支距离较远(92.3%)。上述研究证实,本试验从发病罗非鱼脑组织分离到的致病性链球菌为海豚链球菌。     

12种药物对罗非鱼无乳链球菌的抑菌试验

无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)普遍存在于养殖水体中,可产生外毒素,对动物具有致死性,由无乳链球菌和海豚链球菌(Streptococcus inia)引起的罗非鱼链球菌病被认为是对罗非鱼危害最严重的细菌性疾病,而且链球菌还可随伤口感染人类.近几年来,因罗非鱼链球菌病的暴发流行,给罗非鱼养殖业造成极大的危害,甚至威胁到罗非鱼养殖产业的稳定发展.2011年5月～10月,广西多地暴发罗非鱼链球菌病,危害各种规格的养殖罗非鱼,共造成7127吨鱼死亡,经济损失8610.8万元,已严重制约了广西罗非鱼养殖业的健康发展.研究结果表明,近两年广西养殖罗非鱼链球菌病的病原菌为无乳链球菌,且大多表现为多重耐药菌株.而生产实际中,药物防治仍是目前养殖户针对罗非鱼链球菌病普遍采用的主要控制措施.本试验选取12种常用国标渔药,研究其对无乳链球菌的抑菌作用,旨在为罗非鱼无乳链球菌病的药物防治提供参考.     

罗非鱼链球菌病的调查与诊断

<正>随着我国罗非鱼养殖规模扩大,各种传染性疾病的发生呈现不断增长的趋势,尤其是近年来链球菌病的大范围流行,对罗非鱼的养殖造成了巨大的损失。导致罗非鱼链球菌病的病原菌主要是无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)和海豚链球菌(Streptococcus iniae),其中又以前者最为常见。2014年8月~9月间,笔者在广东省湛江市罗非鱼养殖区调查发现,养殖的新吉富罗非鱼爆发疾病,病鱼大小为50g~300g。经解剖和病原学分析,排除了病毒和寄生虫感染的可能,通过细菌分离、纯化和培养,从     

罗非鱼无乳链球菌的分子鉴定

对罗非鱼致病菌株TL60829NA及其人工感染后分离菌株TL60829NA1、TL60829NA2应用原核生物16S rRNA基因通用引物进行分子分类学鉴定.对这些菌株进行16srRNA基因的克隆、序列分析,核酸序列同源性分析表明,TL60829NA及其人工感染后分离菌株TL60829NA1、TL60829NA2为同一种细菌.其中,TL60829NA2与GenBank登陆号为DQ303183的无乳链球菌(Streptococcus agalaciate)菌株ATCC13813序列同源性最高(99.8%).同时,通过与常引起罗非鱼链球菌病的S.agalaciate、S.iniae代表菌株16srRNA基因构建的发育进化树表明,该菌株及其人工感染后分离菌株与S.agalaciate代表菌株构成一个进化分枝,而4株S.iniae代表菌株的16srRNA基因则构成另一个分枝.本研究证实了从发病罗非鱼肝脏组织中分离到的致病性链球菌为无乳链球菌.     

中国罗非鱼主养区无乳链球菌的分子流行特征及其传播方式

为分析2007—2015年中国罗非鱼主养区无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)的分子特征和流行情况,分离并收集了248株罗非鱼源无乳链球菌。通过分子血清型、MLST、毒力基因和前噬菌体等分型方法对248株无乳链球菌进行了分子遗传特征分析。结果表明,229株无乳链球菌(92.3%)的分子血清型是Ⅰa型,其余19株均是Ⅰb型(7.7%)。MLST分析结果表明,所有Ⅰa型无乳链球菌都是ST7型,所有Ⅰb型无乳链球菌都是ST261型。毒力基因检测结果发现,229株Ⅰa-ST7型无乳链球菌的毒力基因型相同,即V1型;19株Ⅰb-ST261型无乳链球菌的毒力基因型相同,即V2型。前噬菌体检测结果表明,Ⅰa-ST7型无乳链球菌可分为两种前噬菌体基因型,分别是P1型(36株)和P2型(193株);Ⅰb-ST261型无乳链球菌的10个前噬菌体基因都是阴性,即P3型。根据以上4种分子分型方法可将248株无乳链球菌分为3种基因型,即Ⅰa-ST7-V1-P1型、Ⅰa-ST7-V1-P2型和Ⅰb-ST261-V2-P3型。2010—2011年主要流行菌株由Ⅰa-ST7-V1-P1型转变为Ⅰa-ST7-V1-P2型,其中Ⅰa-ST7-V1-P1型是2011年之前的主要流行菌株,Ⅰa-ST7-V1-P2型在2011年及之后成为主要流行菌株。研究表明,近年来我国罗非鱼源无乳链球菌发生了明显的遗传变异,同时,根据我国罗非鱼主养区无乳链球菌的流行特点,推测我国罗非鱼源无乳链球菌是通过苗种或水体等介质进行传播的,属于输入性传播方式。     

罗非鱼链球菌病的防治

<正>人们普遍认为罗非鱼抵抗力强,很少有病害发生。但现今,随着罗非鱼养殖密度增大、养殖环境恶化,罗非鱼的病害也会发生并越来越严重,已经有几种疾病在罗非鱼上发现,其中链球菌病是罗非鱼育成期的常见疾病,发病率高、危害严重,常常造成很大的经济损失。一、病原无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)是养殖罗非鱼的主要病原(包括以前定名为S.difficilis、difficiie的链球菌,现在认为是无乳链球菌的同种异名)。海豚链球菌(StroDtococcus iniae)也可以引起罗非鱼大量死亡,但     

罗非鱼海豚链球菌16srRNA基因的序列测定和系统进化分析

为了从分子水平上对～株来源于发病罗非鱼的链球菌进行分类学鉴定，本研究利用原核生物16srRNA基因通用引物对该菌株进行了16srRNA基因的克隆及序列分析。结果扩增出长约1．5kbp目的片段，测序得到一条长度为1447bp核苷酸序列。核苷酸同源性分析表明，该序列与NCBI公布的海豚链球菌（Streptococcus iniae，s．iniae）SCCF5L菌株16srRNA基因核苷酸序列同源性最高（99．496），暂称为中国广西株（S．iniae-CGX）。同时，亲源关系较近的S．iniae、S．difficile和S，agalaciate代表菌株构建的系统发育进化树显示，该菌株与S．iniae代表菌株组成同一进化分支，与s．agalaciate代表菌株组成的另一进化分支距离较近（95．596），而与S．difficile代表菌株组成的进化分支距离较远（92．3％）。本研究证实，从发病罗非鱼脑组织分离得到的致病性链球菌为海豚链球菌。     

海豚链球菌灭活疫苗对罗非鱼免疫效果的初步研究

将海豚链球菌(Streptococcus iniae)淡水分离株TBY-1菌株灭活后制备成无佐剂和添加白油佐剂的疫苗,利用浸泡和腹腔注射复合免疫方式对罗非鱼(Oreochromis niloticus)进行免疫,比较其相对保护率及血清中抗体凝集效价,以评价佐剂的存在与否及免疫次数对海豚链球菌灭活疫苗的免疫效果的影响,同...     

罗非鱼链球菌病防治策略新思考

罗非鱼链球菌病有2种病原,即海豚链球菌和无乳链球菌。在5年前,罗非鱼链球菌病的主要病原是海豚链球菌,且疾病的发生多呈局部性的零星暴发流行。但随着罗非鱼养殖密度增大、养殖环境恶化、抗病性能退化,罗非鱼链球菌病呈现大面积、高死亡的急性流行暴发,且病原主要是无乳链球菌。近3年来,罗非鱼链球菌病的广泛暴发,给罗非鱼养殖业造成极...     

斑点叉尾鮰暴发海豚链球菌病的研究

2006—2007连续两年广西斑点叉尾鮰网箱养殖暴发一种流行性传染病,该病波及面广,传染性强,死亡率30％～100％。发病症状主要表现为浮头、转圈、狂游及发病后期单边眼睛浑浊、突出及伴有全身大面积弥漫性出血。作者先后从症状较为典型发病班点叉尾鮰分离到CMS003～CMS005、CMS009～CMS012共7株代表性菌株,经人工感染实验表明分离菌株对健康斑点叉尾鮰具有很强的致病力,出现症状与自然发病斑点叉尾鮰症状相同。通过常规形态、生理生化及海豚链球菌（Streptococcus iniae）特异性PCR诊断和16S rRNA基因序列系统发育进化分析方法对分离菌株进行分类鉴定,结果表明分离的7株细菌均为海豚链球菌。研究结果表明,海豚链球菌已成为广西斑点叉尾鮰网箱养殖的高致病性病原菌。     

罗非鱼链球菌病检测与防治方法

罗非鱼链球菌病是茂名市罗非鱼养殖过程中常见的细菌病,病原是海豚链球菌（Streptococcys ubuae）或者无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）,属革兰氏阳性菌,每年造成罗非鱼养殖损失很大,但是部分养殖户囿于对此病的认识,难以进行正确的诊断与治疗。茂名市水产技术推广中心站在中山大学李安兴教授和广东省水生动物疫病控制中心的技术支撑下,对罗非鱼链球菌病进行相关的研究,现将罗非鱼链球菌病发病原因、检测方法与防治方法表述如下：     

广西卵形鲳鲹海豚链球菌基因分型、耐药谱型以及毒力基因检测

为了解近年来广西卵形鲳鲹海豚链球菌流行菌株的基因型信息以及菌株间的差异,对2015—2016年从广西地区7个养殖场的患病卵形鲳鲹体内分离得到的17株海豚链球菌菌株分别进行了基因型分析、耐药谱测定以及毒力基因检测。采用随机扩增多态性DNA标记技术(RAPD)和基因组重复序列PCR(rep-PCR)分析其基因型。结果显示,RAPD和rep-PCR指纹图谱结果一致,17株海豚链球菌可分为2种基因型。对海豚链球菌7种主要的毒力相关基因特异PCR检测,所有菌株均为sim A+scp I+pdi+sag A+cps D+pgm A+cfi+毒力基因型,表明这2种基因型的海豚链球菌似乎均为毒力较强的菌株。采用K-B法进行了20种抗生素敏感实验分析其耐药谱,结果表明归于基因1型的菌株耐药谱为AZT,基因2型菌株则出现3种相似的耐药谱,分别为SIZ/T/S/PEN/AZT/SPE/CAZ/PB、SIZ/T/S/PEN/AZT/SPE/CAZ/CRO和SIZ/T/S/PEN/AZT/SPE/CAZ/PB/RIF,证实基因型相同的菌株耐药谱型也相似,2种基因型的菌株耐药谱型差异显著,因此基因型和耐药谱型存在相关性。此结果为卵形鲳鲹海豚链球菌病流行病学研究、疫苗研制以及疫病监测提供理论依据。     

中国七种水生动物源无乳链球菌的分子特征及其对斑马鱼的致病性

为了解中国水生动物源无乳链球菌的分子流行特征,揭示其传播和流行规律,本实验对分离得到并鉴定的10株7种水生动物源无乳链球菌通过分子血清型、多位点序列分型(MLST)分型、毒力基因型和前噬菌体分型等方法进行分子分型;其次,通过斑马鱼评价7种水生动物源无乳链球菌的致病性。分子血清型分析结果表明,10株无乳链球菌可分为3种血清型,即Ⅰa、Ⅰb和Ⅲ型;MLST分型结果表明,Ⅰa型无乳链球菌均为ST7型,Ⅰb无乳链球菌均是ST261型,只有Ⅲ型无乳链球菌是ST739型。进一步分型结果表明,10株无乳链球菌可分为3种毒力基因型和4种前噬菌体基因型。根据4种分型结果可知,10株水生动物源无乳链球菌可分为4种类型,其中虎纹蛙源无乳链球菌具有独立的分子血清型、MLST型、毒力基因型和前噬菌体基因型,即Ⅲ-ST739-V1-P3;罗非鱼源无乳链球菌的基因型有3种,即Ⅰa-ST7-V2-P1、Ⅰa-ST7-V2-P2和Ⅰa-ST7-V3-P4;红尾皇冠鱼、鳙和罗非鱼源无乳链球菌的基因型相同:Ⅰa-ST7-V2-P2;卵形鲳鲹、宝石鲈和罗非鱼源无乳链球菌具有相同的基因型:Ⅰa-ST7-V2-P1;鲮和罗非鱼源无乳链球菌的基因型相同,即Ⅰb-ST261-V3-P4。致病性研究表明,7种水生动物源无乳链球菌对斑马鱼均有强致病性。研究表明,两栖类虎纹蛙源无乳链球菌和鱼源无乳链球菌的基因型明显不同,它们之间遗传变异较大,因此,无乳链球菌在两栖类和鱼类之间相互传播的可能性较小。鱼源无乳链球菌有3种基因型,且这3种基因型均在罗非鱼中流行,这表明无乳链球菌在鱼类中相互传播的可能性较大,尤其是在罗非鱼与其他鱼类之间。     

不同水温下无乳链球菌在尼罗罗非鱼体内的动态分布及其消除规律

本研究以腹腔注射无乳链球菌(Streptococcus agalactiae, WC1535菌株)后的尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus,GIFT strain)为研究对象,研究不同水温下无乳链球菌在尼罗罗非鱼体内的动态分布及消除规律。首先,分析25℃、29℃和33℃3个实验组罗非鱼的感染累积死亡率;其次,对3个实验组罗非鱼进行无乳链球菌的体外分离、培养和计数;然后,分析感染后不同实验组罗非鱼脑、肝脏、脾脏和肾脏组织中无乳链球菌的浓度。结果显示,随着水温的升高罗非鱼的累积死亡率也随之升高,25℃、29℃和33℃组的累积死亡率分别为6.67%、25.56%和78.90%。菌落统计结果显示,随着水温的升高,无乳链球菌在罗非鱼体内的增殖速度加快,同时,单位质量组织(脑、肝脏、脾脏和肾脏)中无乳链球菌的最大载菌量也随之升高。本研究还发现,无乳链球菌在罗非鱼脾脏中的浓度最高,在肾脏中的存活时间最长。综上可知,尼罗罗非鱼感染无乳链球菌后,体内各组织中链球菌的增殖、消除速度均与水温密切相关。本研究为研究无乳链球菌的致病机制奠定基础,也为通过合理调控水温及施药等措施防治尼罗罗非鱼链球菌病的暴发提供科学依据。     

广东省养殖罗非鱼、海鲈、尖吻鲈海豚链球菌感染调查

利用细菌分离培养方法结合特异PCR技术,对广东省珠三角地区养殖罗非鱼(Oreochromis spp.)、海鲈(Lateolabrax japonicus)及尖吻鲈(Lates calcarifer)的海豚链球菌(Streptococcus iniae)感染情况进行了周年调查。每月固定时间在特定养殖区域采集目标鱼的脑、肝、脾、肾和肌肉等组织,并对其进行海豚链球菌的细菌分离培养鉴定。仅从已经患病的尖吻鲈中分离到3株链球菌,经生理生化鉴定和16S rDNA测序确定为海豚链球菌。利用海豚链球菌特异PCR技术对上述养殖鱼类不同组织进行检测,发现罗非鱼、海鲈、尖吻鲈的海豚链球菌感染率分别为30.21%、23.53%、14.55%,其中罗非鱼脑和肌肉的感染率明显较其他组织高(P<0.05),分别为20.65%和23.75%;海鲈的脑部和肌肉感染率也较其他组织高(P<0.05),分别为12.1%和10%;而尖吻鲈各组织感染率没有较大差异(P>0.05)。另外,研究结果还表明采集样本的海豚链球菌感染率随着其体长的增加而呈现下降趋势。     

罗非鱼无乳链球菌巢式PCR检测方法的建立

根据无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)cfb基因序列,设计、合成2对引物,优化扩增条件,建立了快速高灵敏度鉴别无乳链球菌的巢式PCR方法。结果显示:使用该方法对罗非鱼(Oreochromis mossambicus)血液样品进行检测,可检测到活菌浓度为8.7×104CFU/m L的无乳链球菌。对采自广西地区受无乳链球菌感染的19份罗非鱼样品进行检测,18份可获得目的片段,扩增到的序列均为无乳链球菌cfb基因序列,检测准确度达到94.7%。     

中国南方地区罗非鱼无乳链球菌的分子流行病学研究

从广东省以及海南省等地区养殖的患病罗非鱼体内分离、收集到多株致病菌,经生化分析和分子生物学鉴定,均为无乳链球菌。对这些菌株分别进行了耐药谱测定、分子分型试验以及分子血清型分析。药敏试验结果表明,2007—2010年分离到的无乳链球菌耐药谱基本相似;多位点可变数目串联重复序列分析(MLVA)试验中,选择5个高变异指数的可变数目重复位点(VNTR)进行分子分型,结果表明,所有鱼源无乳链球菌菌株为同一MLVA型,而作为对照的牛源无乳链球菌则明显不同;为了对这些菌株进一步分型,分别进行了分子血清型和表面蛋白抗原基因的检测,结果表明,鱼源无乳链球菌的分子血清型均为Ⅰa型,表面蛋白抗原均为alpha-C蛋白。这进一步说明了不同年份和不同地区的鱼源无乳链球菌在基因水平上为同一分子类型,具有相同的起源或传染源。同时也说明,我国南方地区罗非鱼无乳链球菌在这几年中未发生明显的遗传变异。这些结果为罗非鱼无乳链球菌病疫苗研制,疫病监测及药物防治的研究提供理论依据。     

尼罗罗非鱼无乳链球菌微滴式数字PCR检测方法的建立及临床应用

通过设计筛选引物和探针、优化反应浓度和退火温度,构建一种尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)的微滴式数字PCR(dd PCR)检测方法,分析该方法的敏感性、特异性及重复性,并应用于临床样品检测。结果显示：当引物、探针浓度分别为0.9μmol·L^-1、0.3μmol·L^-1且退火温度为56.9℃时,建立的罗非鱼无乳链球菌dd PCR方法阴、阳性微滴分布界限明显,平均拷贝数高,有较高扩增反应效率;线性关系线良好(R²=0.997 3),最低检测限为2.56 copies·μL^-1;与猪链球菌2型、鱼类海豚链球菌和其他5种常见的水生动物疫病病原体无交叉反应;重复变异系数为3.15%;临床样品检测结果与实时荧光PCR方法结果的符合率100%,与细菌分离鉴定方法结果符合率为94.12%。结果表明,建立的罗非鱼无乳链球菌dd PCR检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好,可对罗非鱼无乳链球菌感染的临床样品进行定量检测,为尼罗罗非鱼无...