表达鸡Ⅱ型干扰素重组鸡痘病毒的构建及其特性分析

将鸡Ⅱ型干扰素(ChIFNγ)基因插入到鸡痘病毒转移载体pSY681中，获得重组转移载体pSY681-ChIFNγ。将pSY681-ChIFNγ转染已感染亲本鸡痘病毒S-FPV-017株的鸡胚成纤维细胞，使其在鸡胚成纤维细胞内与鸡痘病毒基因组发生同源重组，产生表达ChIFNγ的重组鸡痘病毒rFPV-ChIFNγ。在含有X-ga1的营养琼脂培养基上进行蓝斑筛选，通过PCR和间接免疫荧光等实验证实获得纯化的、表达ChIFNγ的重组鸡痘病毒。将在鸡胚成纤维细胞中培养72h的rFPV-ChIFNγ上清接种小鼠成纤维细胞(L929)，通过细胞病变抑制实验证明重组ChIFNγ具有抑制水疱性口炎病毒复制的活性，培养上清的抗病毒效价为2048U／mL。     

含绿色荧光蛋白基因与强毒部分糖蛋白B基因的马立克病毒CVI988株转移载体的构建

提取马立克病毒病毒疫苗毒株CVI988／Rispens感染的鸡（Gallus domesticus)胚成纤维细胞（CEF）的总DNA为模板，利用PCR技术扩增出病毒生长非必要的US2基因（约2.0kb)，将其克隆入T－easy载体获得载体pGUS2。用Eco R I和Bam H I消化pUR-MDVEgB质粒，回收1.8kb包含糖蛋白B（gB)基因主要抗原位点片段，插入pEGFP-C1质粒多克隆位点，构建了在CMV启动子和增强子控制下的含GFP及部分gB基因的表达盒。将此表达盒克隆入pGUS2载体US2基因中，成功地构建了含GFP及部分gB基因的转移质粒载体pEGFPgB。为其与CVI988毒株共转染CEF可获得表达GFP及强毒部分gB蛋白重组CVI988疫苗毒株打下基础。     

鸡痘病毒载体复制非必需片段优化及强启动子的筛选

以痘苗病毒启动子Ｐ７．５调控的β－半乳糖苷酶基因为检测基因,分别插入三个复制非必需片段构成重组质粒,脂本介导转染鸡痘病毒中国疫苗株２８２Ｅ４感染原代鸡胚成细胞（ＣＥＦ）单层,蓝斑选纯化病毒;将重组病毒感杂次代ＣＥＦ,收获细胞后制备提取物,检测其中的β－半乳糖苷酶的活性,由此得到一个基因表达效率高的复制非必需片段ｐＦＰＶ７ｓ。根据痘苗病毒天然启动子Ｐ７．５的结构,人工合成４条寡核苷酸,形成一个早期和     

表达鸡传染性法氏囊病病毒VP2重组鸡痘病毒的构建

含ＩＢＤＶ保护性抗原ＶＰ２的质粒,以ＳｐｈＩ消化,然后用Ｔ４噬菌体ＤＮＡ聚合酶将末端补平,产物纯化后再以ＳａｌＩ消化一次,经再次纯化后与ＳｍａＩ和ＳａｌＩ分步酶切的鸡痘病毒插入载体ｐＦＧ１１７５－１相连,使唤基因顺向插入到载体Ｐ７５启动子下游,得到含ＩＢＤ ＶＰ２基因的重组插入载体ｐＦＧ ＶＰ２。     

表达GFP和gpt基因的重组CVI988病毒的构建

以马立克氏病病毒（MDV）CVI988株基因组为模板,利用PCR技术扩增出约2.7和3.0 kb的基因片段,将上述片段同时插入pUC19中,获得约5.5 kb MDV同源重组臂;以该基因片段的US2区的BglⅡ为插入位点,分别插入基因表达盒CMV-gpt-ployA和CMV-gfp-polyA,构建转移载体pUS-gpt-GFP,将该载体瞬时转染CHO细胞,在荧光显微镜下,可以观察到绿色荧光蛋白的表达;将该转移载体转染已用MDV CVI998株感染的次代CEF细胞,利用MX-HAT培养基筛选重组病毒,并用荧光显微镜挑选表达绿色荧光蛋白的蚀斑,结果获得重组病毒rMDVgptGFP。通过PCR检测和病毒生长测定,证明重组病毒获得纯化。     

鸡γ干扰素对H5亚型禽流感疫苗的免疫增强作用

利用表达鸡γ干扰素的重组鸡痘病毒(rFPV-IFN-γ)与表达H5亚型禽流感病毒血凝素基因的重组鸡痘病毒(rFPV-HA)或灭活疫苗联合应用，接种SPE鸡、无母源抗体商品鸡和含有母源抗体商品鸡，研究鸡γ干扰素的免疫增强作用。结果发现，rFPV-IFN-γ和rFPV-HA联合应用诱导的HI抗体应答水平同rFPV-HA单独免疫相近；rFPV-IFN-γ和灭活疫苗联合应用后HI抗体应答水平略低于灭活疫苗单独免疫组。攻毒后，对于SPF鸡和无母源抗体商品鸡，rFPV-IFN-γ与rFPV-HA或灭活疫苗联合免疫诱导的保护率同相应疫苗单独免疫相当，均为95％～100％；对含有母源抗体的商品鸡，10^6PFU的rFPV-HA与10^5PFU的rFPV-IFN-γ联合免疫组保护率(33．5％)高于rFPV-HA单独免疫组(11．4％～16．8％)，而其它剂量组合的rFPV-HA与rFPV-IFN-γ联合应用不能提高免疫保护效力；rFPV-IFN-γ与灭活疫苗联合免疫含母源抗体商品鸡诱导的保护率同灭活疫苗单独免疫组相近。结果表明，rFPV-IFN-γ不能促进疫苗诱导的HI抗体应答；适当剂量组合的rFPV-HA与rFPV-IFN-γ联合免疫含有母源抗体的商品鸡，可提高免疫保护效力，发挥免疫增强作用。     

传染性法氏囊病病毒VP2基因的克隆及其重组鸡痘病毒转移载…

根据已发表的ＩＢＤＶ基因组序列设计并合成一对特异扩增ＩＢＤＶ ＶＰ２ｃＤＮＡ的引物，以纯化的ＩＢＤＶ－Ｄ７８弱毒疫苗株基因组为模板，利用ＲＴ－ＰＣＲ技术扩增出约１．５ｋｂ产物。将ＰＣＲ产物克隆到ｐＵＣ１９的Ｓｍａｌ位点，经酶切图谱分析等方法鉴定出重组ＶＰ２ｃＤＮＡ质粒（ｐＶＰ２）。将ＶＰ２基因正向插入ＦＰＶ启动子ＬＰ２３Ｐ２下游，连同痘苗病毒启动子Ｐ１１启动的ＬａｃＺ报告基因盒插入ＦＰＶ转移载体中     

新城疫病毒F48E8株核衣壳蛋白基因在鸡痘病毒中的表达及其部分序列分析

通过反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增了新城疫病毒(NDV)F48E8株核衣壳蛋白(NP)基因,并克隆到pUC18中,得阳性克隆pUCNP.应用分子克隆技术,将NP基因导入鸡痘病毒(FPV)转移载体pFG1175-1中P7.5启动子的下游,得到含NDV NP基因的质粒pFGNP1175-1.利用脂质体转染技术,将该质粒转染FPV疫苗株282E4感染3～4 h的鸡胚成纤维细胞,采用蓝斑筛选方法纯化多次,得到稳定的重组FPV.用狄高辛标记的探针进行斑点杂交实验,结果表明pFGNP1175-1已与FPV 发生同源重组;用抗NDV的SPF鸡的阳性血清进行间接免疫荧光实验,证实重组FPV在感染细胞中表达了F48E8株NP蛋白.该基因两端部分序列与已发表的D26株NP基因对应区域的核苷酸同源性为89.1%,推断的氨基酸同源性则为93.1%.     

鸡MxA基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

MxA是由Ⅰ型干扰素诱导宿主细胞所产生的抗病毒蛋白家族的成员之一。采用RT-PCR方法从鸡胚成纤维细胞(CEF)中扩增MxA,将其克隆至载体pMD-T18中,筛选阳性克隆后回收目的片段,将其克隆入原核表达质粒pGEX-6p-1,构建其重组表达质粒pGEX-MxA,以IPTG诱导表达,经SDS-PAGE、鸡胚新城疫病毒增殖干扰实验和VSV-CEF微量细胞抑制实验进行分析、鉴定。结果表明,经RT-PCR扩增获得的MxA序列与GenBank报道的序列一致,SDS-PAGE和干扰实验证实重组质粒可以表达出相应分子量为45kD的蛋白,与GST-MxA融合蛋白分子量一致,影像分析系统分析显示表达的融合蛋白约占菌体蛋白的30%。     

鸡输卵管组织特异性分泌表达载体的构建和表达

摘要：为了实现外源基因在鸡(Gallus gallus )输卵管上皮细胞内的特异性分泌表达，采用RT-PCR的方法扩增了鸡溶菌酶基因的450 bp的cDNA片段，该片段保留了5ˊ端信号肽编码序列。将该片段插入到含有1.2 kb卵清蛋白5ˊ调控序列的特异性表达载体pOVA-GFP中，与绿色荧光蛋白基因形成融合基因，使融合蛋白具有分泌功能。新构建的分泌表达载体pOVALG转染鸡胚成纤维细胞和大鼠乳腺上皮细胞系SHZ-88后，成功地检测到了绿色荧光蛋白的表达。     

香蕉乙烯受体基因RNA干扰表达载体的构建

设汁两对引物，PCR扩增香蕉乙烯受体基因cDNA序列自AUG启始密码子起长538bp区段的正向(记为5‘I)、反向(记为AI’)DNA区段。构建含该正、反向互补重复序列DNA片段的中间载体，经测序证实连接正确后。克隆到植物表达载体pCAMBIA-1301中的GUs基因位置并经双酶切证实。在所得表达载体pCAMBIA-1301-S5’I-AI’中，该插入正反互补重复片段处于35S启动子之后，由此转录的mRNA因两端序列反向互补而形成发夹式RNA，因此可应用于RNA干扰研究。同时，文中对构建含正、反向重复序列插入片段植物表达载体过程中出现的插入片段链内退火引起连接困难等问题进行了分析讨论。     

性连锁矮小鸡（dwdw）生长激素受体（cGHR）基因突变的精确定位

本研究根据已知正常鸡的ＧＨＲ第１０个外显子和３’ＵＴＲ区的ＤＮＡ序列，设计一对引物，分别对正常农大褐鸡和矮小型农大褐鸡进行了ＰＣＲ扩增。结果正常鸡扩增片段为２０２６ｂｐ，矮小鸡为２５５ｂｐ。将矮小鸡ＰＣＲ产物克隆在ｐＧＥＭ－Ｔ载体上进行测序，精确定位了农大褐矮小鸡ＧＨＲ基因缺失突变位点。     

鸡生长激素受体基因的克隆与部分序列分析

利用高盐法从鸡血中提取高分子量ＤＮＡ，以λＥＭＢＬ３为载体构建了鸡染色体文库，用鸡生长激素受体ｃＤＮＡ基因的部分序列作探针，从文库中筛选得到３个阳性克隆。通过对阳性克隆Ｉ插入片段的酶切和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析，表明它含有全长的鸡生长激素受体基因，建立了该基因的限制性酶切图谱。将插入片段亚克隆到ｐＧＥＭ－７Ｚｆ（＋）质粒上，对含有基因５’端序列的２．５ｋｂＥｃｏＲＩ酶切片段进行了序列分析。     

鸡传染性法氏囊病毒Ts、OH毒株、鱼传染性胰脏坏死病毒DRT毒株的同源性分析

用幼鸡成纤维细胞繁殖鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)Ts毒株,病毒颗粒经提纯后提取基因组dsRNA.根据已报道的加拿大OH株序列设计引物,用RT-PCR进行 cDNA扩增,获得976 bp、774 bp和997 bp的三个部分重叠的片段,分别克隆于pGEM-Teasy载体,利用SP6,T7特异引物及PCR引物进行序列分析,并连接为一个完整的大片段.结果表明,所克隆片段为2 665 bp的IBDV VP1基因的大开放读框.序列分析表明:Ts株与OH株的核苷酸序列同源性为91 %;与DRT毒株的氨基酸序列同源性为42.5 %.尽管Ts株与DRT株的整体同源性很低,但在VP1蛋白的中部仍发现有高同源区段.在两种病毒中均发现与GTP结合蛋白、依赖于RNA的RNA聚合酶(RdRp)相关的保守序列.然而,与单链RNA病毒不同的是:作为RdRp家族特征的G-D-D序列在两种病毒中都未发现.     

鸡γ-干扰素cDNA的克隆和在大肠杆菌中的温度诱导型表达

克隆了鸡(Gallus gallus)的γ-干扰素cDNA，并用大肠杆菌(Escherichia coli)进行了温度诱导型表达。用PCR方法扩增了鸡γ-干扰素基因组基因，将其克隆到载体pGEM-T上。对重组载体的插入片段进行酶切分析和部分序列测定：证明了基因的正确性；克隆的鸡γ-干扰素基因的编码序列中存在一个点突变(G→A)，这一突变导致一个三联体密码子GAA变为AAA，编码的氨基酸由谷氨酸(Glu)变为赖氨酸(Lys)。用鸡γ-干扰素基因组基因构建了真核表达载体pCI-ChIFN。将这一真核表达载体转染兔成纤维细胞的细胞系中进行表达实验：提取转染后细胞裂解物中的RNA，再以此为模板进行RT—PCR，获得了完整的鸡γ-干扰素cDNA基因，同时证明鸡γ-干扰素基因组基因能在兔成纤维细胞系中表达。用鸡γ-干扰素cDNA构建了温度诱导型原核表达载体pBVcDNA，并将其转导到大肠杆菌DH5α中，经细菌发酵和温度诱导，表达了一个18kD的特异蛋白，其表达量占细菌总蛋白的8．75％。     

新城疫病毒F48E8株核衣壳蛋白基因在鸡痘病毒中的表达及其？…

通过反转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）扩增了新城疫病毒（ＮＤＶ）Ｆ４８Ｅ８株核衣壳蛋白（ＮＰ）基因,并克隆到ｐＵＣＮＰ。应用分子克隆技术,将ＮＰ基因导入鸡痘病毒（ＦＰＶ）转移载体ｐＦＧ１１７５－１中Ｐ７．５启动子的下游,得到含ＮＤＶ ＮＰ基因的质粒ｐＦＧＮＰ１１７５－１。利用脂质体转染技术,将该质粒转染ＦＰＶ疫苗株２８２Ｅ４感染３－４ｈ的鸡胚成纤维细胞,采用蓝斑筛选方法纯化多次,得到稳定的重组Ｆ     

加强Psy基因表达和通过RNAi抑制Lcy基因表达的载体构建

通过基因工程手段加强八氢番茄红素合成酶（Psy）基因的表达和通过RNAi抑制番茄红素β-环化酶（Lcy）基因（该基因是调控番茄红素转化为其他类胡萝卜素的主要的基因）的表达是培育高番茄红素品种的重要手段之一。根据GenBank中拟南芥的Psy基因序列（NM-121729），通过聚合酶链式反应（PCR）从拟南芥的cDNA中扩增出了长1296的Psy基因。根据GenBank中番茄的Lcy基因序列（X86452）和Pds启动子序列（U46919）分别设计特异引物从番茄中扩增出了Lcy基因的高度保守的长302bp的DNA片段和长1790的Pds启动子片段。根据RNAi的原理，将Lcy基因的长302bp的DNA片段以正反两个方向通过一段内含子序列连接在一起形成RNAi片段插入到抗Kan的pVCT2020的表达载体中，并通过具有果实特异性特点的启动子——八氢番茄红素去饱和酶基因（Pds）启动子控制该干扰片段的表达，同时将Psy基因在Pds启动子调控下插入到同一载体中，从而构建成了能同时加强Psy基因的表达和抑制Lcy基因表达的植物表达载体。     

鸡传染性法氏囊病毒Ts,OH毒株,鱼传染性胰脏坏死病毒DRT …

用幼鸡成纤维细胞繁殖鸡传染性法氏囊病病毒（ＴＢＤＶ）Ｔｓ毒株,病毒颗粒经提纯后提取基因组ｄｓＲＮＡ。根据已报道的加拿大ＯＨ株序列设计引物,用ＲＴ－ＰＣＲ进行ｃＤＮＡ扩增,获得９７６ｂｐ、７７４ｂｐ和９９７ｂｐ的三个部分重叠的片段,分别克隆于ｐＧＥＭ－Ｔｅａｓｙ载体,利用ＳＰ６,Ｔ７ 异引物及ＰＣＲ引物进行序列分析,并连接为一个寒带的大片段,结果表明,所克隆片段为２６６５ｂｐ的ＩＢＤＶＶＰ、基因的大     

鸡γ-干扰素基因(ChIFN-γ)的瞬时表达及其抗病毒活性检测

采用PCR技术从质粒pET-ChIFN-γ中扩增得到鸡(Gallus gallus)γ-干扰素(chicken interferon gamma,ChIFN-γ)基因,将其亚克隆到真核表达载体pCAGGS中.将鉴定正确的克隆命名为pCAGGS-ChIFN-γ,体外转染鸡胚成纤维(CEF)细胞,24 h后经间接免疫荧光(IFA)和免疫印迹(Western blot)检测,表达蛋白具有良好的免疫原性.然后利用表达绿色荧光蛋白(GFP)的重组水疱口炎病毒(VSV*GFP)在CEF细胞上检测表达的ChIFN-γ抗病毒活性(AVA),经检测其抗病毒活性为2×10~3AU/mL,并且其活性可被抗鸡IFN-γ的多克隆抗体阻断.     

甜橙β-胡萝卜素羟化酶cDNA克隆及其瞬间反义表达*

根据已报道的温州蜜柑(Citrus unshiu)β-胡萝卜素羟化酶(BCH)cDNA序列(AF296158)，设计1对引物，以华盛顿脐橙(C.sinensis)成熟果实cDNA为模板，采用PCR扩增出1条长为1057bp的cDNA片段，将此片段克隆入pUCm—T载体，测序结果表明，所得序列与已报道序列同源99．62％，表明所获得的基因是BCH基因。将该基因反义插入到pBI121中构建成反义植物表达载体，其正确性得到测序的鉴定。含有该植物表达载体的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)在脐橙白皮层中诱导了β-胡萝卜素积累。