仔猪致泻性大肠杆菌毒力因子多重PCR检测方法的建立与应用

本研究以致泻性大肠杆菌(DEC)的4种毒力因子EAST1、LT、STa和STb为模板设计特异性引物并优化各项反应条件,以建立仔猪DEC的多重PCR检测方法.该方法具有较好的特异性,只对DEC产生特异性条带,对非DEC及其他病菌则呈阴性.利用所建立的多重PCR方法对吉林省各猪场采集的样本进行检测,结果表明,在测定的猪场中...     

四种致泻性大肠杆菌多重PCR检测方法的建立及在大熊猫上的应用

致泻性大肠杆菌可引起大熊猫血水样便、休克,严重者可危及生命。为准确鉴定4种致泻性大肠杆菌病原,本研究通过对引物浓度、退火温度、反应条件等进行优化,建立了能同时检测EPEC和EHEC的多重PCR方法以及ETEC和EAEC的多重PCR方法。结果得出：两种多重PCR方法特异性强,仅对特有的毒力基因进行扩增,对其他10种大熊猫源病原菌的扩增结果均为阴性;敏感性较高,细菌基因组DNA检测中EHEC和EPEC的检测下限为2.71×10⁴拷贝/μL,EAEC的检测下限为3.23×10⁴拷贝/μL,ETEC的检测下限为3.23×10³拷贝/μL;菌液检测中EPEC和EHEC的检测下限为1.85×10⁴CFU/mL,ETEC的检测下限为2.9×10³CFU/mL,EAEC的检测下限为2.62×10⁴CFU/mL;不同时间段重复8次,均扩增出对应的目的条带,证明重复性好。利用多重PCR和单一PCR方法分别检测110份样品,结果得出esc V基因阳性率为1.82%(2/110)...     

多重PCR方法鉴定5类牛源致泻性大肠埃希菌

为建立鉴定5类牛源致泻性大肠埃希菌(DEC)多重PCR检测方法,对陕西关中奶牛场犊牛粪便中分离的大肠埃希菌进行检测。以EAEC(astA、aggR、pic)、EHEC(stx1、stx2)、EPEC(escV、bfpB)、EIEC(invE)和ETEC(lt、stp、sth)5类DEC中11种毒力基因为目标,uidA基因为阳性对照,建立两体系(体系Ⅰ和Ⅱ)多重PCR检测方法,通过改变引物浓度、退火温度等检测条件进行优化,并对其特异性和灵敏度进行检测。结果显示,体系Ⅰ检测EAEC、EHEC,体系Ⅱ检测EPEC、EIEC、ETEC,除astA引物浓度为0.5μmol/L,其余均为0.3～0.4μmol/L;退火温度以59℃最佳;ETEC的检测下限最低(1.09×10³ CFU/mL),其余依次为EHEC(1.27×10³ CFU/mL)、EIEC(2.43×10³ CFU/mL)、EPEC(5.71×10³ CFU/mL)、EAEC(7.98×10³ CFU/mL);经验证该方法只...     

鉴定猪产毒素大肠杆菌多重PCR方法的建立

根据GenBank数据库的基因序列建立了一种快速鉴定仔猪产毒素致病性大肠杆菌 3种常见毒素LTⅠ、STa和VT2e的多重PCR方法。将待检样本接种麦康凯琼脂平板 ,然后挑取单一的红色菌落直接作模板 ,加入预混好的PCR反应液进行PCR即可对产生这 3种毒素的猪大肠杆菌进行鉴定。 3种毒素基因的PCR产物的大小分别是 2 83bp、2 2 1bp和 4 87bp。     

内蒙古羊屠宰场致泻性大肠杆菌和沙门氏菌污染状况分析

为了解内蒙古地区羊屠宰场各屠宰环节致泻性大肠杆菌和沙门氏菌的携带情况,评估是否存在污染风险,选取不同规模屠宰场,用棉拭子法分别采集不同屠宰环节样品349份,36 h内进行试验;应用PCR方法分离鉴定病原菌,对鉴定为致泻性大肠杆菌的分离株进行16S r DNA测序并构建系统发育树。结果显示:从刚宰杀的羊胴体表面和环境中共分离到致泻性大肠杆菌12株,其中11株携带毒力基因elt,1株携带毒力基因eae和elt;大中型屠宰场(1.21%)的致泻性大肠杆菌阳性率低于小型屠宰场(5.43%),不同规模屠宰场的预冷间均未检出致泻性大肠杆菌和沙门氏菌;从屠宰环境中分离出1株携带inv A基因的沙门氏菌,阳性率为0.29%;经高压冲洗和排酸预冷等屠宰工艺后,在羊胴体表面均未发现致泻性大肠杆菌和沙门氏菌。     

猪源肠毒素性大肠杆菌菌毛基因多重PCR检测方法的建立

为了对猪源产肠毒素性大肠杆菌（ETEC）的4种主要菌毛（K88、K99、F41和987p）进行快速检测和分型，建立了检测4种菌毛的多重PCR方法。首先设计合成4对4种菌毛特异性的引物，然后用4种菌毛参考ETEC菌株优化了多重PCR方法。该方法对K88、K99、F41和987p 4种菌毛的扩增产物分别为201，314，380和459bp。对4种扩增产物分别进行酶切鉴定，结果均得到与预期一致的2个片段。对各个参考菌株不同组合的检测结果为100％符合。结果表明，该多重PCR方法具有很好的特异性和敏感性，可用于ETEC性腹泻的辅助诊断及ETEC菌毛抗原分型检测。     

云南南涧地区致仔猪腹泻性大肠杆菌血清型鉴定与耐药性分析

对2018—2020年采集的南涧县不同养殖场中患腹泻病仔猪肛拭子、粪便、肝脏等共243份病料进行大肠杆菌分离鉴定,采用人工感染小白鼠试验、玻板凝集试验、结晶紫微孔板法和K-B药敏纸片法,对分离的致泻性大肠杆菌的致病性、血清型、生物被膜形成能力及耐药性进行检测。结果显示,从243份仔猪腹泻病料组织中分离得到了113株大肠杆菌,其中有87株为致病性大肠杆菌,87株致病性大肠杆菌属于14种不同的血清型,以038 (17.2%)、0101 (18.4%)和0142 (14.9%)为主要流行优势血清型,强形成被膜能力菌株有24株(27.6%)、中形成被膜能力菌株有34株(39.1%)、弱形成被膜能力菌株有17株(19.5%)、不形成被膜菌株有12株(13.8%)。分离的87株致病性大肠杆菌对阿莫西林、氨苄西林、链霉素等10种药物的耐药率较高,耐药率在49.4%以上,对其他药物的耐药率在9.2%～26.4%之间。     

不同禽源致病性大肠杆菌的多重耐药性分析

采用K-B法,对实验室分离、保存的37株不同年代、不同禽源致病性大肠杆菌,用14种药物进行了体外敏感性测定.结果显示,20世纪80年代分离株耐药性较低,耐药谱从1重耐药到6重耐药,未见5重耐药和超级耐药株,其中,3重耐药株数最多,占总分离株比例的16.2%;多数分离株对呋喃唑酮、头孢氨苄、新霉素、壮观霉素、洛美沙星和诺氟沙星等6种药物具有高度敏感性.20世纪90年代以后的分离株均出现了不同程度的多重耐药,耐药谱从8重耐药到11重耐药,其中8重耐药菌株数最少,占总株数比例的2.7%,11重耐药最高,占总株数比例的18.9%;14种抗菌药物耐药率也出现新高,其中链霉素耐药率达到了94.4%.结果表明,随着时间的推移,大肠杆菌耐药性问题日益严重,应加强重视和研究,严格控制大肠杆菌耐药性的广泛传播以及由此带来的恶性循环.     

霍乱弧菌及肠出血性大肠杆菌多重PCR检测方法的建立

针对霍乱弧菌肠毒素和肠出血性大肠杆菌志贺毒素基因（ctx、stx1和stx2）设计引物,扩增大小不同的特异性片段,优化反应条件,建立多重PCR方法,对人工污染的水样品进行模拟检测。结果显示,多重PCR扩增系统针对目的菌具有高度的特异性。敏感性试验证实,当多重PCR反应体系中模板含量在10CFU时仍能检出。模拟水样品多重PCR检测的敏感性试验证明,人工污染的河水直接集菌检测敏感性为100～1 000CFU/mL,增菌培养后多重PCR检测敏感性可达1CFU/mL。本试验于同一PCR体系检测霍乱弧菌和肠出血性大肠杆菌的毒素基因,可用于这2种致腹泻性病原菌的快速检测。     

猪源大肠杆菌多重耐药性的检测与分析

大肠杆菌存在于人和动物肠道中,是人及动物体内的主要共生菌,极易产生耐药性.其耐药性是抗菌药物压力的指示器,也是耐药基因的潜在来源库.大肠杆菌病之所以广泛流行,与大肠杆菌中含有的耐药质粒有关.因此开展大肠杆菌耐药性调查十分必要,具有重要的公共卫生意义.     

产肠毒素大肠杆菌多重PCR检测方法的建立

为快速检测和鉴定产肠毒素大肠杆菌(ETEC)菌毛(K88和K99)和毒素(STa)基因,本研究设计合成了针对K88、K99和STa基因的3对特异性引物,对K88、K99和STa基因扩增条件进行优化,建立了检测K88、K99和STa的多重PCR方法.该方法对Kss、K99和STa基因的扩增产物分别为237 bp,314 bp和166 bp;此外,该方法具有良好的灵敏性和特异性.本实验建立的多重PCR方法为致幼畜腹泻ETEC的检测提供了快速准确方法.用所建立的多重PCR方法对实验室分离的23株大肠杆菌进行检测,结果2株为K99/STa阳性,1株为STa阳性.     

我国部分地区乳房炎奶样中大肠杆菌的分离鉴定及耐药性分析

为了解我国部分地区奶牛乳房炎奶样中大肠杆菌的耐药情况,以指导牛场合理使用抗生素,提高治疗效果和畜产品质量,从全国六个省市自治区采取158例奶牛乳房炎的奶样,对奶样中的大肠杆菌进行分离纯化与鉴定,并进行药敏试验。结果显示,158份奶样中,共分离出38株大肠杆菌,其中黑龙江18株(分离率为36.0%)、上海3株(分离率6.0%)、北京3株(分离率27.2%)、新疆10株(分离率33.3%)、山东4株(分离率26.7%)、陕西0株(分离率0)。药敏试验显示,磺胺异噁唑耐药率最高,为73.7%;环丙沙星、诺氟沙星、四环素、链霉素药物的敏感率最高,为100%。分离菌株最多耐13种药物,最少耐4种药物,呈现多重耐药性。不同种类的抗生素中,上海和山东对β-内酰胺类药物和氯霉素类药物以及黑龙江、上海和新疆对磺胺类药物的耐药情况比较严重,耐药率高达50%以上。结果表明,各地区分离株对多种抗菌药物产生了不同程度耐药性和多重耐药,临床兽医在治疗时应注意合理用药,提高疗效和畜产品质量,减少耐药性的产生。     

应用多重PCR方法检测出血性大肠杆菌O157:H7

选择O157：H7的产志贺样毒素基因stx1、stx2和β-葡糖醛酸糖苷酶基因(uidA)分别设计引物,在同一扩增体系中进行PCR反应。在优化好的多重PCR反应条件下,对菌株及其它肠道菌进行检测。试验结果为：O157：H7菌株在250,207,179bp处均出现特异条带。试验结果表明,选择3对引物的多重PCR方法可特异、快速而且灵敏地对大肠杆菌O157：H7进行检测。     

致猪水肿病大肠埃希菌多重PCR检测方法的建立及应用

本研究旨在建立一种快速鉴定致猪水肿病大肠埃希菌的多重PCR检测方法.分别针对大肠埃希菌16S rDNA、志贺毒素Stx2e A亚基和菌毛F18ab A亚基保守序列设计合成3对特异性引物,优化多重PCR反应条件,并进行特异性和敏感性检测.结果显示,阳性对照菌株扩增产物大小分别为1 062、733和313 bp.特异性和灵敏性检测结果表明,与肠炎沙门菌、多杀性巴氏杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌、支气管败血波氏杆菌和猪链球菌等猪常见致病菌均无交叉反应;菌体直接扩增法最低检出量为1 875 CFU.利用建立的多重PCR检测方法对分离收集的128株大肠埃希菌进行鉴定,得到36株致猪水肿病大肠埃希菌,其中30株既有菌毛F18ab又产志贺毒素Stx2e,另外6株仅产志贺毒素Stx2e.结果表明,本试验所建立的多重PCR检测方法对致猪水肿病大肠埃希菌的快速诊断和流行病学调查具有一定的应用价值.     

多重PCR对猪病毒性繁殖障碍疾病的调查分析

为了解猪群中病毒性繁殖障碍疾病的流行状况,用多重PCR诊断方法,对太原市附近14个养猪场和门诊病例共1068份样品进行了猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪瘟病毒（CSFV）、猪细小病毒（PPV）、猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪圆环病毒2型（PCV-2）的检测,其平均感染率分别为：PRRSV 32%、CSFV 40%、PPV 20%、PRV 12%、PCV-2 27%。其中混合感染2种病毒的猪群为39%,感染2种病毒的猪为24%。用RT-PCR试剂盒对山西省11个地市66个猪场及121个散养户的1572份血样进行了PRRSV和CSFV的检测,结果PRRSV感染率为33%,CSFV感染率为46%。用间接血凝试验对61个县38个乡136个村179户的1593份血样进行了猪瘟免疫抗体的检测,平均合格率为43.9%,从而为防控此类疫病的发生,制定综合防制措施提供试验数据。     

不同血清型牛源巴氏杆菌多重PCR检测方法的建立

巴氏杆菌是引起牛出血性败血症的主要病原之一,其致病血清型主要有荚膜A、B和E型。本试验选择、合成了针对3种不同血清型菌株的引物,建立了检测不同血清型菌株的多重PCR鉴别诊断方法。试验用2.5ngDNA模板即可扩增出目的基因,通过对引进的参考菌株进行检测表明,用该方法进行牛源巴氏杆菌的诊断和菌株分型特异性好,敏感性高。     

猪细小病毒、伪狂犬病病毒和猪圆环病毒2型多重PCR检测方法的建立及应用

根据猪细小病毒(PPV)、伪狂犬病病毒(PRV)和猪圆环病毒2型(PCV-2)的基因序列,分别选取各自的保守区段设计引物,通过反应条件的优化,建立了检测PPV、PRV和PCV-2的多重PCR方法.用建立的方法对采自陕西省部分猪场的286份病料及血样进行检测,从对临床健康猪全血样品中PPV、PRV和PCV-2的检测结果看...     

肠出血性大肠埃希菌O157:H7多重PCR检测方法的建立

为建立肠出血性大肠埃希菌O157:H7的多重PCR检测方法,针对O157菌特异性eaeA基因、fliC基因、志贺毒素基因(stx1和stx2)及rfbE基因设计5对引物,构建多重PCR反应体系,优化反应的引物浓度和温度检测其特异性和敏感性,并对牛、猪、鸡及犬等不同动物来源的样品进行了大肠埃希菌O157检测。结果显示,该方法具有良好的特异性和敏感性,敏感性达到5×10~3CFU。从检测阳性样本中均分离到目的菌。应用建立的方法在确定样品中是否含有大肠埃希菌O157的同时,还能对菌株毒力进行初步判定。成功建立了肠出血性大肠埃希菌O157:H7多重PCR检测方法,为该病原菌感染的预防和监测提供了简便、快速的技术手段,具有良好的应用前景。     

用PCR鉴定大肠杆菌O157∶H7

根据大肠杆菌Ｏ１５７∶Ｈ７的编码ｅａｅ蛋白的ｅａｅＡ基因和大肠杆菌编码Ｈ７抗原的ｆｌｉＣ基因的核甘酸序列,合成了２对寡核苷酸引物,建立了一个检测大肠杆菌Ｏ１５７∶Ｈ７的ＰＣＲ方法。对１１株已知大肠杆菌Ｏ１５７∶Ｈ７（ＮＭ;无运动性）株和其他不同属的４２株已知肠道致病菌的检测结果表明,该方法只从大肠杆菌Ｏ１５７∶Ｈ７（ＮＭ）株的ＤＮＡ中产生预期的扩增产物,而从其他菌株的ＤＮＡ中未扩增出任何ＤＮＡ产物。该方法从基因水平直接确定大肠杆菌的血清型,特异性强,克服了以往血清学方法有非特异性反应的缺陷,为检测和鉴定大肠杆菌Ｏ１５７∶Ｈ７（ＮＭ）提供了一个新方法。     

猪细小病毒、猪伪狂犬病病毒和猪圆环病毒2型多重PCR检测方法的建立与应用

根据GenBank中已发表的猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)、猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)和猪圆环病毒2型 (porcine circovirus type 2,PCV2)基因序列,对各病毒基因区进行同源性分析,确定PPV 的VP2、PRV的 gD、和PCV2的ORF2基因为各病毒的诊断靶序列,设计特异性引物,在建立各病毒单项PCR技术的基础上,优化多重PCR反应条件,建立了3种病毒的多重PCR技术,可同时扩增PPV 313 bp、 PRV 217 bp和PCV2 447 bp的特异性片段。用多重PCR技术与单项PCR技术对比检测试验证明两者的符合率为100％,表明建立的多重PCR检测方法,具有特异、快速、准确的特点,可同时鉴别诊断这3种病毒。从10个发病猪场和门诊病例的病猪采集的211份样品,用建立的多重PCR检测方法,检出PPV阳性42份,阳性率为19.91%;PRV阳性26份,阳性率为12.32%;PCV2阳性56份,阳性率为26.54%;2种以上病毒混合感染25份,混合感染阳性率为11.85%。检测结果表明,山西省猪群已感染这3种疫病。