蜂毒前溶血肽原及其加工产物生物信息学比较分析

为了深度了解蜂毒前溶血肽原及其加工产物的结构与功能的关系,利用生物信息学工具对其理化性质、保守性、信号肽、跨膜区域及酶切位点等进行了分析。结果表明,蜂毒前溶血肽原种间结构保守,理化性质种间差异不大但与加工成的蜂毒肽有明显区别;蜂毒前溶血肽原具有明显的信号肽序列和跨膜区域;有多种肽酶在蜂毒肽结构域没有酶切位点。为研究其结构改造以便利用基因工程合成蜂毒前溶血肽原并进行加工提供了理论依据。     

蜂毒前溶血肽原基因的改造及其原核表达

为进一步探讨利用基因工程技术生产蜂毒肽的方法,根据大肠杆菌密码子偏好性、基因GC含量、合成蛋白加工需求等对蜂毒前溶血肽原基因序列进行改造,并利用人工化学合成方法完成改造后全基因的合成。构建蜂毒前溶血肽原与GST融合表达重组质粒pGEX-4T-1/PPMel,转化大肠杆菌BL21感受态细胞后分别在20、37℃条件下经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,并利用SDS-PAGE和Western Blot对产物进行检测。结果表明,表达体系成功表达了目的融合蛋白,在20℃条件下可获得可溶性表达产物,为进一步分离纯化目的蛋白及获得蜂毒肽提供了基础。     

二种胡蜂前溶血肽原基因在昆虫杆状病毒系统中的表达

构建亚非马蜂和额斑黄胡蜂前溶血肽原基因的重组供体质粒pBacHT-PhPPM和pBacHT-VmPPM,转化到穿梭载体Bacmid的受体菌DH10Bac中,得重组穿梭载体Bacmid-PhPPM和Bacmid-VmPPM,再用Lipofectin介导其DNA转染粉纹夜蛾细胞系Tn-5B1-4,最后观察细胞表达时相动态.经ELISA法证实,胞内表达产物具有良好的抗原性,证明二种重组病毒Bacmid-PhPPM和Bacmid-VmPPM已在昆虫细胞中得到了表达.     

Myo5a特异性片段原核表达重组质粒的构建

为了构建Myo5a特异性片段的原核表达重组质粒PGEX-4T-3/Myo5a,采用PCR扩增出Myo5a基因特异性片段的蛋白编码序列,经BamH I和Xho I双酶切后,将片段插入原核表达载体pGEX-4T-3,构建重组子PGEX-4T-3/Myo5a。最后重组质粒PGEX-4T-3/Myo5a经鉴定完全正确。     

酿酒酵母ARS304及其侧翼序列重组质粒的构建与鉴定

采用PCR扩增酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Ⅲ号染色体ARS304序列(S1)及以ARS304为核心上下游延伸1 kb的侧翼序列(S2),并将目的片段分别构建到酵母整合载体pRS405中,获得重组质粒pRS1和pRS2.质粒电转化试验发现重组质粒pRS2的转化率大于pRS1,说明ARS304侧翼序列能显著提高ARS304在酿酒酵母中自主复制的能力.     

新城疫病毒(NDV)HN基因真核表达重组质粒的构建

应用一对自行设计的引物,通过反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)获得新城疫病毒(NDV)Lasota株的血凝素神经氨酸酶(HN)基因片段,其长度约为1.7 kb,与已报道的NDV-HN基因片段大小一致.再将该HN基因片段定向插入真核表达质粒pcDNA3中,经酶切和测序鉴定,表明构建的重组质粒含有NDV-HN基因片段.     

烧烤肉制品中3,4-苯并(a)芘检测的前处理方法

采用超声提取、液液萃取和固相萃取联用,建立了烧烤肉制品中3,4-苯并(a)芘检测的前处理方法.结果表明:烤肉样品中的3,4-苯并(a)芘经超声处理8 min后用15 mL二甲亚砜液液萃取,再用C18固相萃取柱进行净化,回收率达到74.98%～108.82%,相对标准偏差为2.35%～3.82%,检测限为0.04 μg·L-1.该方法操作简单,所需时间短,提取效果好,适用于烧烤肉制品中3,4-苯并(a)芘残留检测的前处理.     

斑马鱼Tg(Crystal-pro-gsdf-2A-egfp)质粒的构建及验证

为研究性腺体衍生因子基因(gsdf)在斑马鱼Danio rerio精巢发育过程中相关分子调控机制模型,提取了斑马鱼精巢总RNA,逆转录合成c DNA,并以其为模板,用RT-PCR法扩增得到gsdf基因,构建了以小鼠gamma-crystalin启动子启动的斑马鱼gsdf基因与增强型绿色荧光蛋白基因(egfp)融合的荧光素酶报告质粒Tg (Crystal-pro-gsdf-2A-egfp),采用显微注射技术注射该质粒至1细胞期的斑马鱼受精胚胎中。结果表明:在荧光显微镜下观察到19尾能在眼部晶状体中特异表达绿色荧光蛋白基因(gfp)的F0代斑马鱼,将表达了绿色荧光蛋白基因的斑马鱼同野生型(WT)非转基因斑马鱼杂交,最终获得能特异表达绿色荧光蛋白基因的F2代,且gsdf基因能在斑马鱼眼部晶状体中特异表达并稳定遗传。研究表明,在斑马鱼上建立的Tg (Crystal-pro-gsdf-2A-egfp)转基因品系,为研究和观察斑马鱼精巢发育的分子调控机制提供了新的方法。     

烧烤肉制品中3,4-苯并(a)芘检测的前处理方法

采用超声提取、液液萃取和固相萃取联用,建立了烧烤肉制品中3,4-苯并(a)芘检测的前处理方法.结果表明:烤肉样品中的3,4-苯并(a)芘经超声处理8 min后用15 mL二甲亚砜液液萃取,再用C18固相萃取柱进行净化,回收率达到74.98%～108.82%,相对标准偏差为2.35%～3.82%,检测限为0.04 μg·L-1.该方法操作简单,所需时间短,提取效果好,适用于烧烤肉制品中3,4-苯并(a)芘残留检测的前处理.     

重组A群链球菌三磷酸甘油醛脱氢酶与脂蛋白(a)的相互作用

三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)是A群链球菌(group A Streptococcus,GAS)表面的纤溶酶原(Plg)受体之一,其C末端的赖氨酸残基可以与Plg的赖氨酸结合位点(LBS)相结合.脂蛋白(a)[Lp(a)]中的载脂蛋白(a)[Apu(a)]与Plg有很高的同源性.因此本实验室提出了Lp(a)可能与GA...     

里下河地区水生蔬菜+克氏原螯虾共(轮)作关键技术及效益分析

阐述了江苏里下河地区茭白[Zizania latifolia(Griseb.)Stapf]、莲藕(Nelumbo nucifera Gaertn.Fruct.et Semin.)、芡实(Euryale ferox Salisb.ex DC)和水芹[Oenanthe javanica(Bl.)DC.]等水生蔬菜+克氏原螯虾(Procambarus clarkia Girard)共(轮)作的田间工程、时空耦合农事年历、关键技术及效益分析,为发展生态种养循环农业,转变传统单一种植、养殖方式提供了新思路与技术支撑。     

猪源嗜性衣原体HB1043株主要外膜蛋白(MOMP)基因的分析及重组表达

根据GenBank中衣原体主要外膜蛋白(MOMP)全基因序列设计特异性引物,以临床分离的衣原体病原中提取的衣原体全基因组为模板,利用特异性引物PCR扩增得到MOMP全基因序列.通过BLAST比对,结果显示其与已提交的猪流产衣原体CG1株的MOMP序列(EU531729)有1个碱基不同.根据对测序结果进行信号肽序列预测及内切酶位点分析,选用BamH Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切将目的蛋白序列克隆到表达载体pET-28a上,得到重组质粒pET-28a-MOMP.将重组质粒转化入E coli BL21进行表达,表达产物使用镍离子亲和层析柱进行纯化得到目的蛋白rMOMP.目的蛋白经Western-blot检测,证明其具有免疫学活性.     

黄瓜质膜型Na~+/H~+逆向转运蛋白基因(SOS1)的克隆与序列分析

采用RACE(rapid-amplification of cDNA ends)方法从黄瓜Cucumis sativusL.中克隆出质膜Na+/H+逆向转运蛋白基因的cDNA(CsSOS1),该cDNA全长3 638bp,其中开放阅读框为3 435bp,编码1 145个氨基酸。氨基酸同源性分析表明,CsSOS1氨基酸序列与水稻OsSOS1和拟南芥AtSOS1的氨基酸序列同源性较高,分别为64%和58%,而与液泡型的Na+/H+逆向转运蛋白氨基酸序列亲缘关系较远。蛋白质跨膜结构分析表明CsSOS1包含11个完全跨膜片段。激光共聚焦显微镜显示CsSOS1基因的编码区与YFP基因融合后,定位在细胞膜上。酵母功能互补试验结果显示CsSOS1参与Na+与H+的转运,表明该基因转化酵母后可以补充酵母SOS1的缺失。