猪圆环病毒2b型Cap蛋白多克隆抗体制备及其生物学特性分析

为了使猪圆环病毒2b型(PCV2b)Cap蛋白在猪圆环病毒病等疾病的诊断和防制方面取得更有效的应用,本试验将编码PCV2b Cap蛋白的ORF2基因克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,并构建pET-32a-ORF2重组质粒,重组质粒转化大肠杆菌BL21受体菌后,通过IPTG诱导表达重组蛋白,将重组蛋白用镍柱进行纯化并免疫大白兔,制备兔抗PCV2b Cap蛋白的多克隆抗体。利用ELISA、Western blotting、间接免疫荧光及病毒交叉反应等试验对制备的多克隆抗体进行生物学特性检测。ELISA检测结果显示,该抗体效价可达到1:2¹⁶;Western blotting检测结果显示,该多克隆抗体可与PCV2b产生特异性的反应条带,说明其具有较好的反应活性;间接免疫荧光试验结果显示,该多克隆抗体能识别感染PK-15细胞中的PCV2b,说明该多克隆抗体具有鉴别诊断PCV2b的能力;病毒交叉试验结果显示,该多克隆抗体能与PCV2b反应,而不与猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪轮状病毒(PRoV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)等猪源病毒发生交叉反应,表明该多克隆抗体具有高度特异性。本试验制备的抗PCV2b Cap蛋白多克隆抗体为PCV2b病原特性研究及该病的临床检测奠定基础。     

免疫小鼠血清中猪圆环病毒2型抗体ELISA检测试剂盒的研究

为研制一种小鼠血清中猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2,PCV2）抗体检测试剂盒,以PCV2 Cap蛋白兔多抗作为包被用抗体,捕获纯化的PCV2 Cap蛋白,制备抗原检测板,辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗小鼠IgG作为二抗,建立检测小鼠血清中PCV2抗体ELISA检测方法并制备试剂盒。采用所制备的ELISA试剂盒对50份已知阴性血清样本进行检测,临界OD450nm值为0335;采用ELISA试剂盒与IFA分别对100份血清检测,总符合率为96%,检测小鼠血清敏感性效价达1∶16000,与其他常见的猪病毒小鼠阳性血清无交叉反应,2～8 ℃保存15个月稳定,批内变异系数为2.28%～4.17%,批间变异系数为4.27%～6.02%,具有良好的敏感性、特异性、稳定性及重复性;采用ELISA试剂盒对不同来源疫苗免疫组小鼠血清进行检测,均显示良好效果。研究表明,本研究制备的ELISA试剂盒可用于小鼠血清中PCV2抗体效价检测。     

猪圆环病毒2型Cap蛋白特异性纳米抗体的原核表达研究

为利用大肠埃希菌表达猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白特异性纳米抗体,并对其抗原结合活性进行鉴定,以Cap蛋白特异性纳米抗体基因(vhh cap)序列为模板,利用Primer 5.0软件设计一对通用vhh cap特异性扩增引物,通过PCR方法扩增vhh cap基因片段,经双酶切处理后分别克隆到pCold-SUMO和pET-32a(+)载体上,转化宿主菌E.coli BL21(DE3),使用IPTG进行诱导表达,表达产物通过Ni 2+亲和层析柱进行纯化,经SDS-PAGE分析和Western blotting鉴定,同时使用ELISA方法对两种载体表达的纳米抗体ELISA效价进行检测和对比分析。SDS-PAGE结果显示pCold-SUMO和pET-32a(+)载体均能实现VHH cap纳米抗体重组蛋白的原核可溶性表达,Western blotting表明纳米抗体重组蛋白可通过6×His-Tag进行检测;ELISA结果显示pCold-SUMO载体表达的纳米抗体重组蛋白效价为1∶500,ELISA效价明显高于pET-32a(+)载体表达产物。PCV2 Cap特异性纳米抗体成功表达为PCV2检测及治疗用新型的抗体开发奠定了基础。     

猪圆环病毒2型Cap蛋白双抗体夹心ELISA定量检测方法的建立

为了建立起双抗体夹心ELISA定量测核衣壳蛋白(caspid protein,Cap)抗原方法,采用氯化铯密度梯度超速离心方法制备猪圆环病毒2型Cap蛋白标准品,制备出针对PCV2-Cap单克隆抗体及PCV2-Cap多克隆抗体,筛选最佳包被抗体和酶标抗体的稀释度,绘制标准曲线,验证方法,并应用该方法对不同转移载体构建的PCV2-Cap蛋白随时间变化的表达量进行测定。结果显示:最佳包被抗体和酶标抗体的稀释度均为1∶10 000,标准曲线的范围是15.6~250 ng/m L,线性相关系数≥0.99,准确性为(103.46±12.50)%,特异性良好;检测不同转移载体构建的Cap表达量随时间的变化,发现Cap含量接种后24 h开始表达,72 h达到高峰,呈S形曲线增长模式。结果表明:已建立的双抗体夹心ELISA定量测Cap抗原方法灵敏度、精密性和准确性均符合研究要求。     

猪圆环病毒2型阻断ELISA抗体检测试剂盒的研制与应用

为了进一步提高对猪圆环病毒2型(PCV2)检测的特异性,利用PCV2Cap蛋白及酶标记Cap单克隆抗体,建立了一种检测猪血清中PCV2Cap蛋白抗体的阻断ELISA方法,并将其组装成试剂盒。对阻断ELISA试剂盒进行了敏感性、特异性、重复性、符合率和保存期测定。结果显示,其敏感性高,特异性强,批内批间重复性好,与商品化试剂盒符合率高,保存期长且性质相对稳定。先后制备了5个批次的阻断ELISA试剂盒,用于检测PCV2不同疫苗免疫猪血清、规模猪场PMWS发病猪及同群健康猪血清、不同日龄猪群血清.结果显示,PCV2油佐剂免疫组血清抗体水平相对较高,PWMS发病猪血清抗体水平高于同群健康猪,猪群中育肥猪血清抗体水平最高。     

猪圆环病毒2型(PCV2) Cap基因原核表达及抗血清制备

Cap蛋白作为猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)的重要结构蛋白,可以实现诱导机体免疫保护。以本实验室分离保存的PCV2毒株的Cap基因作为模板,设计特异性引物进行PCR扩增,并将该PCR产物连接至原核表达载体pET-28a上,获得重组质粒pET-28a-PCV2 Cap。将验证正确的菌种接入HB-pET自诱导培养基,过夜培养,SDS-PAGE及Western blot验证其表达,可获得28 000左右的目的蛋白。利用亲和层析技术纯化PCV2 Cap蛋白,免疫BALB/c小鼠获得小鼠阳性血清,通过ELISA方法检测其效价,并用Western blot验证其活性。结果显示,本试验成功应用大肠杆菌表达了PCV2 Cap蛋白,表达的蛋白具有免疫原性,并获得小鼠阳性血清,为PCV2 Cap蛋白的功能研究、鉴定、抗体及疫苗研制和病原检测奠定理论基础。     

猪圆环病毒2型Cap蛋白表达及免疫原性鉴定

以猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2,PCV2）WH株基因组DNA为模板,扩增ORF2截短基因,经BamH I/NotI双酶切处理后与经相同酶切处理的pET32a（＋）原核表达载体连接,获得重组质粒pET32a-Cap2。将重组质粒转化至BL21（DE3）,经IPTG诱导,对表达产物进行SDS-PAGE和Western blot分析。纯化的重组蛋白免疫小鼠,并对获得的血清进行间接ELISA检测和中和活性测定。SDS-PAGE分析表明,ORF2截短基因在大肠杆菌中得到表达,蛋白分子质量大小为40 kDa,重组PCV2 Cap蛋白主要以上清的形式存在。Western blot证实重组蛋白能够识别抗PCV2阳性血清。经间接ELISA检测,鼠抗PCV2 Cap血清抗体效价能达到1：25 600,间接免疫荧光检测分析表明,鼠抗PCV2 Cap血清能特异性识别PCV2感染细胞中的Cap蛋白。病毒血清中和实验证实,抗PCV2 Cap血清抗体具有中和病毒的活性,中和效价为1：36。猪圆环病毒2型Cap蛋白的表达,为进一步研究该蛋白的功能及Cap蛋白亚单位疫苗和检测试剂盒的制备奠定了基础。     

PCV3 Cap基因在昆虫杆状病毒中的表达与鉴定

试验旨在获得具有天然构象且反应原性良好的猪圆环病毒3型(porcine circoviurs 3,PCV3)Cap蛋白。以本实验室保存的PCV3 Cap基因为模板,设计不同引物扩增Cap基因,将其亚克隆至pEASY-Blunt载体上,验证正确后将目的基因分别克隆至杆状病毒表达载体pFastBac~(TM)上(含有双启动子),获得含有2个PCV3 Cap基因的重组质粒pFBD-P2C。将该重组质粒转化大肠杆菌DH10-Bac~(TM)感受态细胞当中,进行蓝白斑筛选,获得重组杆状质粒Bacmid P2C,利用脂质体转染至SF9细胞中进行病毒拯救,转染后72 h,收取上清病毒液,盲传3代,收取SF9细胞应用间接免疫荧光法(IFA)及Western blot检测目的蛋白是否表达。结果显示,重组质粒pFBD-P2C酶切验证正确,重组杆粒Bacmid P2C构建成功,杆状病毒中能够表达PCV3 Cap蛋白且能与His-tag抗体发生特异性反应,IFA鉴定出现特异性绿色荧光,表明成功表达了PCV3 Cap蛋白且具有反应原性,为深入开展PCV3抗体制备、新型疫苗研发奠定了基础。     

猪圆环病毒2型一步间接免疫荧光试验的建立及初步应用

本研究利用大肠杆菌表达的猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)Cap蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,然后将其与FITC标记羊抗兔二抗预混相互作用,制成预混液后与预固定样品(病料或组织细胞)相互作用,通过荧光观察检测PCV2,建立了一步间接免疫荧光试验(one-step indirect immunofl uorescence assay,OS-IIFA)。应用OS-IIFA和PCR对广东省各地猪场采集的79份病料样品进行检测,阳性率分别为58.23%和69.62%,二者的阳性符合率为80%,阴性符合率为91.66%,总符合率为83.54%,因此,该方法可作为PCV2流行病学调查及临床监测的有效手段。     

绵羊肌肉抑制素C-端的表达、纯化及多克隆抗体的制备

为深入了解绵羊myostatin基因的表达及调控机理,进行了绵羊myostatin蛋白多克隆抗体的制备.首先将绵羊myostatin基因C-端克隆人含组氨酸标签的表达载体pET-30a-c(+)中,转化大肠杆菌BL21后IPTG诱导表达,然后利用Ni2+亲和层析纯化重组蛋白,薄层扫描及Bradford法分别检测纯化后蛋白的纯度与含量.应用重组蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,利用间接ELISA法检测多克隆抗体效价,用Western blot及免疫细胞化学染色检测抗体特异性.结果,薄层扫描分析纯化后蛋白纯度可达95%以上,Bradford法检测蛋白浓度约5 mg·mL-1,制备的抗血清效价可达1:250 000以上,Western blot检测证明抗体特异性良好,免疫细胞化学染色表明抗血清可检测剑肌肉细胞中内源性myostatin的表达,说明所制备的多克隆抗体可以应用于进一步研究,有助于阐明绵羊myostatin的表达及调控机理.