165份辣椒种质资源的PMMoV分子鉴定

利用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和致病型分析对165份辣椒种质资源进行分子鉴定。结果表明,在165份感病样品中均扩增得到PMMoV 220 bp的目的条带,阴性对照未扩增目的条带。测序结果表明,该序列为PMMo V的外壳蛋白(CP)基因,与已报道的各PMMoV分离物序列同源性达99.5%～100%。通过CP蛋白氨基酸序列分析及系统发育分析显示,该分离物与PMMoV P_1,2致病型完全一致,确定辣椒园圃的PMMoV分离物为P1,2致病型。证实PMMoV已经在辣椒上发生危害,旨在为针对性地制定PMMoV的防控措施以及辣椒抗病毒品种的选育提供基础依据。     

新疆乌苏地区棉花黄萎病菌分离鉴定和致病力分析

为了研究新疆乌苏地区棉花黄萎病菌的致病型和群体间的变异性,从该地区不同棉株上分离8株病原菌,通过对病原菌的菌落培养形态、菌丝和孢子的显微结构、对寄主的致病性、ITS序列的克隆、菌株间的系统进化及营养亲和性分析等方面进行了研究。结果表明：分离的病原菌均属于非落叶型棉花黄萎病菌(Verticillium dahliae),为大丽轮枝菌;系统进化树显示8株菌在系统进化上属于2个不同的进化方式;8株黄萎病菌在相同的寄主上致病性存在差,Vd-1菌株致病力最强,Vd-34致病力最弱;不同致病力的菌株之间的营养亲和性分为2个营养亲和群(VCGs)。新疆乌苏地区棉花黄萎病的致病菌是大丽轮枝菌,病原菌在进化上差异显著。     

甘薯羽状斑驳病毒海南分离物全基因组序列克隆及分析

为了明确海南本地甘薯羽状斑驳病毒(sweet potato feathery mottle virus,SPFMV)种群的遗传进化关系及致病机理,本研究利用Small RNA测序技术对采自海南的甘薯样品进行鉴定,获得与SPFMV序列具有相似性的85个contigs,与NC_001841相似性较高。试验设计了5对共8条引物,分别为SPFMV-1F/1R、SPFMV-11F/1R、SPFMV-2F/2R、SPFMV-3F/3R和SPFMV-3F/33R PCR,扩增获得3987 bp、3710 bp、1996 bp、3369 bp和4730 bp目的片段。在此基础上再分段设计引物,进行基因全序列PCR扩增,序列拼接获得SPFMV-HN基因组全序列,其包含完整编码阅读框。本研究结果首次报道SPFMV海南分离物基因组全长,并且在P1区预测到另一个外框元件(pretty interesting sweet potato potyviral ORF,PISPO),聚合酶滑移机制可以产生带有额外核苷酸的转录变体,这些核苷酸可以翻译为P1N-PISPO和P3N-PIPO。本研究结果为进一步探究SPFMV致病分子机理和培育抗病甘薯品种奠定研究基础。     

江苏大豆上分离的豇豆轻斑驳病毒基因组序列克隆及特征分析

为明确豇豆轻斑驳病毒江苏分离物的基因组结构特征,阐明其分类地位及进化特点,选择采自江苏的CpMMV大豆分离物作为研究对象,针对病毒基因组序列设计了4对特异性引物,以病样总RNA反转录后获得的cDNA为模板,通过分段法对其基因组序列片段进行了PCR扩增,扩增产物克隆至T载体经验证后进行序列测定,获得的序列片段经拼接组装得到病毒全基因组序列。序列分析结果显示,CpMMV江苏分离物基因组核苷酸序列全长8 194 bp,编码6个蛋白,5′端和3′端各含有一个非编码区(UTR),长度分别为72,117 nt;在编码的6个蛋白中,CP与其他分离物之间的同源性较高(96.5%～100.0%),相对保守;而RdRp(81.1%～98.2%)、TGB1(81.0%～97.0%)、TGB3(80.9%～95.6%)同源性相对较低,在不同分离物中表现较好的多样性;基于全基因组序列的系统进化分析结果显示,江苏分离物与已公开的其他CpMMV分离物同源性较高,共同聚类到一个大分支上,其中与中国安徽分离物同源性最高(98.2%),与海南分离物次之(96.0%),而与美国、巴西、印度、墨西哥、肯尼亚等国外分离物同源性...     

鸡肾型传染性支气管炎病毒的分离鉴定

从四川某鸡场疑似肾型传染性支气管炎病死鸡的肾脏中分离到一株病毒,经SPF鸡胚连续传代、血凝试验、鸡胚矮小化试验、鸡新城疫干扰试验、RT-PCR鉴定和动物回归试验,初步确定该病毒为传染性支气管炎病毒,并命名为SC0911株。     

辣椒内生固氮菌的分离鉴定与多样性分析

通过分离湖南省不同地区辣椒的内生固氮菌,探索其多样性,为内生固氮菌资源应用于现实生产提供理论依据。利用改良无氮培养基对辣椒的根、茎、叶中内生固氮菌进行分离和纯化,并进行菌落计数比较其菌群密度,再对分离出的菌株进行16S rDNA序列扩增,分析其多样性,最后通过乙炔还原法结合气相色谱法测其固氮酶活性。结果筛选到内生固氮细菌30株,经16S rDNA序列刚定和分析,结果显示土壤杆菌属(Agrobacteriumsp.)、根瘤菌属(Rhizobium sp.)、泛菌属(Pantoeasp.)、假单胞菌属(Pseudomonas sp.)相对频率较高,是辣椒内生固氮菌的优势种。经乙炔还原法测定固氮酶活性表明,该30株菌株均具有较弱固氮酶活性,范围为4~183nmol/(mL.h),且不同地区同种菌的固氮酶活性存在一定差异。     

马铃薯卷叶病毒(PLRV)内蒙古分离物基因间隔区(IS)的克隆与序列分析

根据Genbank已报道马铃薯卷叶病毒(PLRV)基因组序列,分析其基因间隔区(IS)两端的保守区,自行设计、合成一对特异性引物,以PLRV内蒙古分离物总RNA为模板,经RT-PCR扩增得到含PLRVIS的一段369 bp的cDNA,克隆于载体pBS-T中。重组质粒经PCR鉴定、酶切分析和核苷酸序列测定,并进一步与PLRV其他分离物的同源序列作比对。结果表明:克隆的PLRV内蒙古分离物的IS序列与其他全部已发表的13个全基因组中的IS核苷酸序列有很高的同源性,最高达到100%,平均为97.90%,高于这13个PLRV全基因组序列96.81%的同源性,说明IS序列不仅在PLRV的不同株系间比较保守,而且在PLRV的全基因组序列中也是相对保守的。研究结果预示,将IS构建成RNA干扰型结构导入马铃薯,将有可能获得抗PLRV多种株系且抗性更高的转基因植株。     

黄瓜绿斑驳花叶病毒北京和山东分离物的生物学测定及其基因组比较

为揭示黄瓜绿斑驳花叶病毒的分子流行学特征,通过RT-PCR和cDNA克隆技术获得并分析了从北京甜瓜和山东西瓜上分离的2个黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV)分离物CGMMV-Beijing和CGMMV-Shandong的全序列.结果表明CGMMV-Beijing和CGMMV-Shandong的基因组分别由6423和6427个核苷酸组成,包括5'及3'端非编码区和4个开放性的阅读框,分别编码129kDa和186kDa复制相关蛋白、29kDa的移动蛋白及17.4kDa的外壳蛋白.寄主范围测定显示在供试的6科11种植物中CGMMV-Beijing和CGMMV-Shandong均可侵染葫芦科的葫芦、南瓜和西瓜以及茄科的本氏烟和藜科的苋色藜,不侵染供试的其它植物.CGMMV-Beijing和CGMMV-Shandong基因组的核苷酸同源性为99.5%,186kDa蛋白的核酸和氨基酸同源性分别为99.7%和99.8%,移动蛋白的核酸和氨基酸同源性分别为99.3%和98.1%,外壳蛋白的核苷酸同源性为100%.多序列比对分析结果显示,CGMMV的各分离物之间的分子差异并不明显,核苷酸同源性均在98%以上.将CGMMV-Beijing和CGMMV-Shandong与侵染葫芦科植物的烟草花叶病毒属其它成员比较,结果显示其亲缘关系较远,基因组的核苷酸同源性介于56.7%～59.6%,外壳蛋白的氨基酸同源性在44.7%～54.0%之间.综合分析显示,CGMMV分离物之间的差异并不明显,可能具有共同的侵染来源.     

大豆种粒斑驳抗性的遗传分析及基因定位

运用SSR标记技术及分离群体组群分析法(BSA法), 对大豆品系3C624×东农8143的F₂、F₃代群体接种SMV1号株系鉴定种粒斑驳抗性, 并进行抗种粒斑驳基因的分子定位。结果表明, 东农8143对SMV1号株系的种粒斑驳抗性受1对显性基因控制。用Mapmaker/Exp 3.0b进行连锁分析, 抗种粒斑驳基因位于大豆染色体组的F连锁群上, 并获得了与抗种粒斑驳基因紧密连锁的5个SSR标记Sat_297、Sat_229、Sat_317、Satt335和Sct_188, 标记与抗病基因间的排列顺序和连锁距离为Sat_297–12.4 cM–Sat_229–3.6 cM–SRSMV1–1.7 cM–Sat_317–2.4 cM– Satt335–13.8 cM–Sct_188。其中近距离标记Sat_229(3.6 cM)、Sat_317(1.7 cM)和Satt335(4.1 cM)可用于标记辅助选择育种和抗源筛选。     

草莓轻型黄边病毒CP基因的克隆、序列分析及原核表达

克隆草莓轻型黄边病毒CP基因,并构建其原核表达载体,在大肠杆菌中诱导表达CP蛋白。利用SMYEV的检测引物,通过RT-PCR技术筛选带SMYEV的草莓植株;根据NCBI中SMYEV序列设计扩增CP基因全长引物,通过RT-PCR获得SMYEV沈阳分离物CP基因全长序列;将CP基因克隆到原核表达pGEX-6P-1上,利用IPTG诱导CP基因在大肠杆菌BL21(DE3)中表达蛋白。利用RT-PCR扩增获得SMYEV分离物SY05的CP基因全长序列,由729个核苷酸组成,编码242个氨基酸残基。SY05与其他SMYEV分离物的核苷酸同源性为80.1%～97.4%,氨基酸同源性为92.1%～99.6%,其中,与SMYEV分离物SY03的氨基酸一致性为98.3%。将SY05的CP基因成功克隆到原核表达载体pGEX-6P-1上,构建了重组表达载体p6P-EV-CP,并将其导入大肠杆菌BL21(DE3)中。SDS-PAGE分析表明,IPTG诱导SMYEV分离物SY05的CP基因在大肠杆菌中表达出分子量为52.0 kDa的融合蛋白。克隆出SMYEV分离物SY05的CP基因,实现了其在原核细胞中的表达,为SMYEV抗血清的制备奠定了重要基础。     

裂褶菌蛋白粗提液抗植物病毒活性初探

摘要：以裂褶菌蛋为研究对象,用硫酸铵沉淀其蛋白,制成蛋白粗提液,研究其诱导烟草对烟草花叶病毒（TMV）的抗性,和体外钝化烟草花叶病毒（TMV）的防治效果;结果表明：当蛋白浓度达到100μg/mL时,诱导烟草抗TMV的效果较好,侵染枯斑抑制率可达74.11%±3.7%,对TMV的体外钝化作用的枯斑抑制率为70.05%±1.25%,表明裂褶菌蛋白粗提液通过诱导抗病性和对TMV的体外钝化作用达到了控制TMV的作用;裂褶菌蛋白粗提液对辣椒病病毒（CMV）具有很好控制作用,用100μg/mL的裂褶菌蛋白粗提液处理辣椒植株后,其对CMV的平均防效为66.46%。     

棚栽嫁接西瓜黄瓜绿斑驳花叶病毒病发病动态及其田间扩展研究初报

为明确棚栽嫁接西瓜黄瓜绿斑驳花叶病毒病发生规律,对该病害的发病、蔓延和影响因素进行研究。毛竹搭建塑料大棚,无毒土壤上常规或低密度移栽健康嫁接西瓜苗,移栽后6、30天剪除部分瓜苗顶叶或倒2叶约半片后,将伤口浸渍在毒源中进行接种诱发,常规密度移栽苗自然生长,低密度移栽苗经整枝始终保持单株独立;健康植株用毒源污染剪刀、手指后整枝或毒源与健康藤蔓摩擦诱发。调查病田病株自然扩展以及拔除清除病健株后直播种子和套种瓜苗的控病效果。目测法定期调查显症病株,酶联免疫双抗体夹心检测法确定病株。接种后植株染病率高。低密度移栽苗：移栽后6天接种的瓜苗24天显症、34天突增、85天高峰,分别比移栽后30天接种的植株长4、4和30天;未接种的也在移栽后70天显症、95天高峰。常规密度移栽苗接种株也有类似趋势。显症病株率和带毒株率与日平均温度关系密切。病株中不同藤蔓上的叶片和相同藤蔓内的叶片既表现显症,也有隐症,甚至终生带毒隐症。病健藤蔓摩擦病株率100.0%,而染毒手指、剪刀整枝病株率则为91.7%和83.3%。病田内病情自然扩展先相邻连续,后点片;病地拔除清除病健株后,直播瓜苗和套种嫁接苗带毒株率分别为82.4%和77.0%,控病效果17.6%和23.0%。棚栽嫁接西瓜苗（植株）从感染黄瓜绿斑驳花叶病毒病到表现症状需要20天左右的潜伏期,继之产生显症病株突增和高峰,温度高,潜伏期短、进入突增和高峰快;隐症病株表现在株间、不同分枝藤蔓叶片间和相同藤蔓不同叶片间;移栽密度对发病无明显影响。田间扩展再侵染先相邻后点片,除了其他途径外,病健藤蔓接触摩擦传病作用大;病地当年连作重发的机率高。     

草莓轻型黄边病毒北京分离物的CP基因序列分析

为了明确引起北京地区草莓病毒病的病毒种类和病毒序列的分子变异特点,从北京地区表现畸形症状的草莓叶片中提取总RNA,利用RT-PCR技术扩增得到草莓轻型黄边病毒(Strawberry mild yellow edge virus,SMYEV)的含有外壳蛋白(CP)基因的729 nt特异性核苷酸片段。经序列测定和分析可知,北京地区存在2种不同的SMYEV分离物（BJ1和BJ2）,两者间的核苷酸序列同源性仅为82.72%~82.96%。将北京分离物与分别来自德国、美国、智利、捷克、澳大利亚、比利时、意大利、韩国和中国沈阳等国家或地区的不同分离物的CP基因序列进行分析比较。结果显示,33个分离物可以分为四大组群,BJI和BJ2分别归属不同组群,BJ1与19个其他国家的分离物亲缘关系较近,BJ2与中国沈阳的2个分离物亲缘关系较近。BJ1和BJ2与其他分离物的CP基因核苷酸序列同源性分别为81.10%~98.35%和82.03%~98.63%,氨基酸序列同源性介于82.17%~99.17%和90.91%~94.63%。     

李矮缩病毒外壳蛋白基因克隆及原核表达研究

为制备李矮缩病毒(Prunus dwarf virus, PDV)抗血清,克隆PDV外壳蛋白(CP)基因,构建原核表达载体,优化蛋白表达条件。以阳性感病甜樱桃叶片为试验材料,提取总RNA,根据PDV CP基因(L28145.1)设计特异引物,RT-PCR方法扩增,克隆、测序,构建原核表达载体pET30a-PDVCP,在大肠杆菌BL21(DE3)菌株表达。PDV CP基因（Genbank登录号：JF333587.1）全长657 bp,编码217个氨基酸,与GenBank其他PDV分离物CP基因核苷酸序列的同源性为89.2%~93.9%,推导的氨基酸序列同源性为97%~99%。根据完整CP基因核苷酸序列构建系统进化树显示：12个PDV分离物可分为3组,泰安分离物与巴西、土耳其等分离物属于Ⅰ组。成功构建原核表达载体pET30a-PDVCP,并在体外条件下诱导表达出融合蛋白。转pET30a-PDVCP载体的大肠杆菌BL21（DE3）菌株表达分子量约24 kDa的重组蛋白。该重组蛋白在30℃,1.0 mmol/L IPTG、诱导4 h表达量最大。     

樱桃病毒A外壳蛋白基因克隆及其原核表达

为制备樱桃病毒A(Cherry virus A,CVA)抗血清,克隆CVA外壳蛋白基因(CP),构建原核表达载体,优化蛋白表达条件。根据CVA全基因组序列(NC_003689.1)设计特异引物,RT-PCR方法扩增CVA外壳蛋白基因,克隆、测序,构建原核表达载体pET30a-CVACP,转化大肠杆菌BL21(DE3)株系,采用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白表达。序列分析显示,该区段长为603 bp,编码201个氨基酸,与法国分离物PF(HQ267856.1)的同源性为96.8%,与印度分离物JKSPMi-5(FN669548.1)同源性为86.3%。成功构建了原核表达载体pET30a-CVACP,SDS-PAGE电泳分析显示,转pET30a-CVACP载体的BL21(DE3)菌株表达分子量约24 kDa的重组蛋白,该重组蛋白在37℃、1.5 mmol/L IPTG、诱导4 h条件下表达量最大。     

Inheritance and stability of the virus-resistant gene in the progeny of transgenic sweet potato

Viral diseases of sweet potato are very prevalent and often seriously damaging to the plants. In particular, the severe strain of the sweet potato feathery mottle virus (SPFMV‐S) causes ‘obizyo‐sohi’ disease in Japan. In order to confer viral resistance against SPFMV using current biotechnology, a transgenic sweet potato has been produced, introducing hygromycin‐resistant (hpt) and SPFMV‐S coat protein (CP) genes, which have shown a significant resistance to SPFMV‐S. In the breeding programme, it is important to confirm that the viral resistance conferred in T₀ plants can be inherited by their progeny. In the present study, progeny were obtained from crosses between the transgenic T₀ and a non‐transgenic variety of sweet potato. The results showed that the CP gene was inherited by the next generation and that the stability of viral resistance was also confirmed. Thus, this production system for the virus‐resistant transgenic sweet potato is useful in practical breeding.     

辣椒净光合速率杂种优势与农艺性状间相关性研究

为了选育高产辣椒品种,本文用6个亲本,按（1/2）n（n-1）双列杂交法配制15个杂交组合,研究了辣椒净光合速率杂种优势与农艺性状的相关性。结果表明,辣椒净光合速率离中优势在开花结果前期受叶片、疫病抗性的影响较大;中期主要受叶片、植株生长势和分枝力的影响,对果实发育、产量形成、营养含量产生较大的影响;后期主要受植株生长势和分枝力的影响,对产量形成、抗病性产生较大的影响。超亲优势在开花结果前、中、后期受叶片、CMV、疫病抗性的影响较大,受植株生长势和分枝力的影响较小,三个时期都对果实发育、产量形成、干物质、纤维素含量产生较大的影响。     

新城疫病毒La Sota株HN基因的克隆与序列分析

旨在从分子生物学角度进一步研究新城疫病毒La Sota株HN基因,探究NDV La Sota HN基因的遗传变异情况。研究以试验室冻存的p NDV-HN为模版,根据Gen Bank中登录的NDV La Sota株序列设计引物扩增HN基因,将其克隆到pMD18-T载体后进行鉴定,对鉴定正确的重组质粒p MD-NDV-HN进行测序分析。应用生物信息学软件对新城疫病毒Lasota株HN基因进行系统进化树分析、氨基酸序列同源性分析、糖基化位点、蛋白结构跨膜区分析及磷酸化位点预测分析。核苷酸序列测定结果表明:HN基因的序列长度为1743bp,该基因的开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)总长为1716 bp,编码571个氨基酸。生物信息学表明:试验获得的HN基因具有6个潜在糖基化位点及12个半胱氨酸残基,第5个潜在糖基化位点(508-510 aa)发生缺失及第123位半胱氨酸残基被色氨酸残基取代。La Sota株HN基因编码的蛋白质中有29个丝氨酸、10个酪氨酸和16个苏氨酸可能成为蛋白激酶磷酸化位点。将试验获得的La Sota株HN基因序列和推导的氨基酸序列与新城疫毒株的HN基因相应序列比较后发现,它们的核苷酸序列同源性和氨基酸序列同源性最高均可达到99%,表明HN基因在种属间具有较高的保守性。研究为新城疫病毒的分子病毒学研究奠定了基础。