番木瓜环斑病毒外壳蛋白基因在大肠杆菌中的表达

番木瓜环斑病毒（PRV）外壳蛋白（CP）基因cDNA克隆到pUC18上构型建成大肠杆菌（Escherichia coli)表达载体，Western blot检测结果表明该表达载体在E.clidDH5α中有两种特异蛋白表达，分子量为34kd的蛋白与推测的表达产物大小相符，且与PRVCP的一个“组分”大小相似；而分子量为16kd的蛋白可能是34kd蛋白的降解物或者是PRV CP基因不完全表达产物。     

番木瓜环斑病毒CP基因dsRNA原核表达载体的快速构建

重点介绍了一种快速构建dsRNA原核表达载体的方法。以番木瓜环斑病毒外壳蛋白基因（PRSV-CP）3＇端-279 bp保守区段为基础,通过OZ-LIC法构建861 bp,432 bp和279 bp 3种不同长度的发卡结构,再通过XhoⅠ和ClaⅠ双酶切,将其连接到pSP73原核表达载体上,构建成PRSV-CP基因dsR...     

番木瓜环斑病毒的提纯研究

详细报道了影响番木瓜环斑病毒（ＰＲＶ）粗提纯效果的几个主要因素（繁殖寄主种类，有机澄清剂，分散剂，病毒浓缩前的去渣离心力，浓缩病毒的超离心力等）的最佳选择，繁殖寄主以角葫瓜最好。该研究综合上述最佳选择而拟定的一次差速离心和一次３０％蔗糖硫酸连续密度梯度离心３ｈ的简单程序较好地提供了ＰＲＶ提纯的病毒有典型核蛋白紫外吸收曲线，Ａ２６０／Ａ２８０＝１．６８，提纯产量为２．５６ｍｇ／１００ｇ西葫芦病叶，所     

番木瓜环斑病毒研究进展

综述了番木瓜病毒株系、生物学特性、检测及防治方法的最新研究进展。     

转番木瓜环斑病毒复制酶基因番木瓜的多重定性检测

为监测和管理转基因番木瓜华农1号的商品化生产、销售,建立了相应的转基因定性检测方法.选用木瓜蛋白酶作为番木瓜的内源对照基因,建立对转基因番木瓜PRSV-Rep基因、外源CaMV35S启动子序列、NOS终止子序列和NPTⅡ基因的常规PCR检测体系.退火温度为40～60℃时,都分别扩增出了清晰的目的基因.单基因常规PCR检测转基因模板量的下限为5×10-7g.建立的三重PCR检测技术,检测了包括NPTⅡ、Rep和CaMV35S;NPTⅡ、Rep和Nos;NPTⅡ、Rep和Papain等3个组合.建立了NPTⅡ、ReP、CaMV35S和Nos4个基因的四重PCR检测技术.     

番木瓜环斑病毒株系的生物学和血清学研究

本文对华南地区番木瓜环斑病毒的Ｙｓ，Ｖｂ和Ｓｍ３个株系和夏威夷ＨＡ５－１弱株系的生物学和血清学等进行了进一步的研究。确证了ＰＲＶ在华南地区至少有３个株系。在株系间亲缘关系方面，华财３个株系间的关系较密切，而与ＨＡ５－１株系的较疏远。在西葫芦植株体内增殖和运转，Ｓｍ株系病毒增殖和运转最快，在体内的浓度最高；Ｖｂ次之；Ｙｓ再次之；而ＨＡ５－１则更次之。     

华南地区番木瓜环斑病毒和畸型花叶病毒调查鉴定研究

调查鉴定了广州、南宁、厦门和福州市番木瓜病毒病病原种类，发现都是由番木瓜环斑病毒引起的，未发现番木瓜畸型花叶病毒。     

华南番木瓜病毒病及环斑病毒株系的调查鉴定

根据田间调查、病毒粒子和内含体形态、血清反应、寄主范围和症状、昆虫介体、物理性质、潜育期等试验结果、认为华南４省区的番木瓜病毒病只有ＰＲＶ一种。根据在西葫芦上的症状特点，将ＰＲＶ初步区分为４个株系，即Ｙｓ、Ｖｂ、Ｓｍ和Ｌｃ。在３１３份标样中，它们单独所占比例分别为４０．５７％，１０．２２％，０．６４％，４．４７％，Ｙｓ＋Ｖｂ（复合侵染）占４４．０８％，这表明Ｙｓ为优势株系，Ｖｂ次之，Ｌｃ和Ｓｍ发生少分布不广。研究结果还表明，以前有人报道的ＰＭａＬＶ实则是本研究的Ｖｂ，而不是一个新病毒。     

华南番木瓜病毒病及环斑病毒株系调查鉴定

根据田间调查、病毒粒子和内含体形态，血清反应，寄主范围和症状，昆虫介体，物理性质，潜育期等试验结果，认为华南４省区的番木瓜病毒病只有ＰＲＶ一种，根据在西葫芦上的症状特点，将ＰＲＶ初步区分为４个株系，即Ｙｓ，Ｖｂ，Ｓｍ和Ｌｃ。在３１３份标样中，它们单独所占比例分别为４０．５７％，１０．２２％，０．６４％，４．４７％Ｙｓ＋Ｖｂ（复合侵染）占４４．０８％这表明Ｙｓ为优势株系，Ｖｂ次之，Ｌｃ和Ｓｍ发生少分     

烟草环斑病毒外壳蛋白基因片段原核表达载体的构建及表达

根据烟草环斑病毒外壳蛋白(TRSV-CP)基因的保守序列设计引物,采用RT-PCR方法,获得烟草环斑病毒基因组中编码外壳蛋白部分基因片段,将其插入原核表达载体pET28a中,获得重组表达质粒pET-CP,转化大肠杆菌BL21(DE3)后,利用IPTG诱导蛋白大量表达.重组蛋白经过Ni -NTA纯化后,SDS-PAGE和Western blotting分析结果表明,TRSV-CP基因在大肠杆菌中获得了高效表达,产生的融合蛋白分子质量约为34ku,并具有免疫学活性.以纯化的表达蛋白免疫新西兰大白兔,多抗血清效价达1:409600,可以与重组蛋白发生抗原抗体反应.     

番木瓜美中红品种体胚转化体系的建立

利用已构建的番木瓜环斑病毒(Papaya ringspot virus,PRSV)基因,通过农杆菌介导法,建立美中红番木瓜(Carica papaya L.)体胚的转化体系。结果表明:共培养时,当农杆菌EHA105携带pCAMBIA2300质粒时,农杆菌的浓度(OD600 nm)应小于或等于0.1,其共培养后抑制农杆菌的羧苄青霉素浓度应以750 mg/L为宜;当农杆菌EHA105携带pBI121质粒时,则农杆菌的浓度(OD600 nm)应小于或等于0.8,其共培养后抑制农杆菌的羧苄青霉素的浓度则为500 mg/L;加上滤纸处理,抗生素洗涤以及洗涤后的干燥处理,可完全抑制体胚表面的农杆菌生长。对再生的番木瓜体胚进行PCR检测,结果表明PRSV基因已转入体胚中,但还需要成苗后的进一步检测。     

7种番木瓜环斑病毒分离株外壳蛋白基因的克隆与序列比较

采用RT-PCR技术对我国海南、云南、广西和广东等不同番木瓜生产区的7个番木瓜环斑病毒外壳蛋白基因(PRSV-CP)进行克隆和鉴定分析。PRSV-CP编码区在864～873核苷酸之间,编码288～291氨基酸。对分离的7个PRSV-CP的核苷酸及氨基酸序列的比较结果表明大部分序列差异都处于N端,而各产区番木瓜PRSV-CP基因的3′端586～864bp区段,即278bpDNA片断的同源率最高,达到98.5%。这一同源序列的获得为利用植物基因工程培育广谱抗病性的番木瓜新品系奠定了基础。     

SYBR-Green实时荧光PCR检测转基因番木瓜

分别以RBCL基因和PRsV-cP基因、PRSV-RP基因为内源基因和目标基因，设计了3对特异性引物，对转基因番木瓜进行了SYBRGreen实时荧光PCR检测．结果表明，RBCL基因引物对所有供试样品成功扩增，0值为15～16，PRSV-CP引物对转PRSV-CP基因番木瓜样品成功扩增，Ct值为20～25，PRSV-RP引物对转PRSV-RP基因番木瓜样品成功扩增，Ct值为21～22．运用熔解曲线进行产物分析，验证了试验结果的特异性和准确性．     

番木瓜环斑病毒海南分离物全基因组结构分析

从感病的海南番木瓜叶片中提取总RNA,经RT-PCR和RACE方法分段扩增番木瓜环斑病毒(PRSV)全基因组序列.序列拼接结果显示,PRSV中国海南分离株(HaiNan-P)基因组除3'-末端polyA尾巴外,由10323个核苷酸组成,编码3343个氨基酸.同源性分析表明,HaiNan-P编码的氨基酸序列与GenBank中公布的11株PRSV同源性为89.8%～93.2%,略高于全长核苷酸的82.3%～89.1%.P1蛋白编码区同源性较低,仅为65.4%～80.1%,而HC-Pro、CI及CP同源性相对较高.运用MEGA 3.1软件、NJ法绘制系统进化树,分析结果显示,PRSV分离株类群分化与地理分布有一定的相关性.     

凋亡素融合基因原核表达载体的构建及可溶性表达

在获得凋亡蛋白融合基因的基础上,成功地构建了重组表达质粒PET-22b-SPA,将阳性重组质粒转化表达受体菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达,表达产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,凋亡蛋白融合基因获得高效表达。软件分析结果表明表达蛋白占菌体蛋白的20%,上清表达量约为10%。上清蛋白经纯化后,Western blot结果显示,利用凋亡蛋白单克隆抗体可以很好地与所表达的蛋白带特异性结合。     

产肠毒素大肠杆菌k88ac基因原核融合表达载体的构建

利用PCR技术扩增出菌毛K88ac基因片段,并将其插入到原核表达载体pET32a( )的多克隆位点上。测序结果表明:与Genbank中序列比对同源性达到99%以上,成功构建了原核表达载体。为进一步的研究工作,奠定了基础。     

抗PRSV转基因番木瓜研究进展

番木瓜花叶环斑病毒（PRSV）严重影响着热带亚热带的重要水果番木瓜的生产,在物理和化学防治措施效果不佳的情况下,利用病原获得抗性防治PRSV的方法给番木瓜的生产带来一线生机。综述了近年来转基因番木瓜中所采用的PRSV病毒的几个基因及其优缺点。     

抗PRSV转基因番木瓜研究进展

番木瓜花叶环斑病毒（PRSV）严重影响着热带亚热带的重要水果番木瓜的生产,在物理和化学防治措施效果不佳的情况下,利用病原获得抗性防治PRSV的方法给番木瓜的生产带来一线生机。综述了近年来转基因番木瓜中所采用的PRSV病毒的几个基因及其优缺点。