传染性囊病病毒VP2蛋白诱导细胞凋亡的研究

在体外分别构建了3种重组表达质粒，含传染性囊病病毒GZ911株VP2基因的pGVP2、含HK46株VP2基因的pHVP2以及含HK46株5‘-端序列（包括非编码区，VP5和VP2基因）的pHVP2 5用不同的重组质粒转染质代鸡胚成纤维细胞（CEF），在转染后0、14、38h，收集对照组和转染组细胞，用酶联免疫吸附试验检测CEF中降解DNA量，结果，在14和38h，各组细胞中测得的Dλ值均为转染pHVP2 5组最大，其次为转染pHVP2,pCVP2的组，并都大于其他对照组，表明2个IBDV毒株的VP2蛋白在CEF中表达后都能诱导CEF发生凋亡，但不同毒株的VP2蛋白诱导CEF凋亡的能力不则；VP5蛋白可增强VP2蛋白诱导CEF凋亡的作用。     

鸭坦布苏病毒E蛋白及其结构域Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ对DEF细胞周期与凋亡的影响

【目的】探究鸭坦布苏病毒(Duck Tambusu virus,DTMUV) E蛋白全长及其结构域I、II和III (DI、DII和DIII)对鸭胚成纤维细胞(Duck embryo fibroblast,DEF)的细胞周期与凋亡的影响。【方法】本研究设计、合成DTMUV E蛋白全长及其DI、DII和DIII真核表达质粒,并转染至DEF,用流式细胞仪检测不同蛋白引起的DEF细胞凋亡和细胞周期的变化。【结果】细胞凋亡结果显示：质粒转染细胞24 h后,E蛋白全长及DI、DII、DIII诱导的DEF早期凋亡率分别是16.4%、15.1%、14.0%和17.2%;质粒转染细胞36 h后,E蛋白全长及DI、DII、DIII诱导的DEF早期凋亡率分别是23.4%、18.5%、26.7%和29.4%。细胞周期检测结果显示：E蛋白全长及DI、DII、DIII的质粒转染细胞24、36 h后,DNA合成期(S期)细胞比例都明显高于pEGFP-N1空载体转染组。质粒转染24 h后,E蛋白及DI、DII、DIII的S期细胞比例分别为5.43%、22.58%、12.75%和12.80%;质粒转染细胞36 h后,...     

鸡TIGAR基因真核表达质粒的构建及其抗凋亡功能评价

【背景】 TP53诱导的糖酵解和凋亡调节因子（TP53-induced glycolysis and apoptosis regulator,TIGAR）是p53下游的靶基因,具有调节糖酵解水平和去除活性氧（Reactive oxygen species,ROS）并降低由活性氧诱发的细胞凋亡水平。【目的】 构建鸡源TIGAR基因的真核表达质粒,并检测TIGAR基因在DF1细胞中的抗凋亡作用,为建立稳定表达鸡TIGAR基因的细胞系做准备。【方法】根据GenBank（登录号：XM_417232.6）中预测基因设计引物,利用RT-PCR的方法从SPF鸡脾脏中扩增鸡TIGAR基因,将扩增产物克隆至载体（Flag-CMV14）后送公司测序验证;随后构建进化树对鸡TIGAR基因与其他哺乳动物及水生动物的TIGAR基因进行同源性分析。将重组质粒（Flag-TIGAR）转染入DF1细胞24 h后,使用新城疫病毒诱导细胞凋亡,利用Western Blot检测重组质粒表达情况以及Poly ADP-Ribose Polymerase（PARP）裂解情况。此外还将重组质粒（Flag-TIGAR）转染入DF1细胞,并于收样前2 h使用Staurosporine刺激细胞发生凋亡,分别在转染后24、48 h收集样品,并用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。【结果】 RT-PCR扩增TIGAR基因,在843 bp处出现目的条带与预测相符,构建的TIGAR真核表达质粒（Flag-TIGAR）经测序,结果显示其序列与GenBank上预测的基本一致。Western Blot结果显示在30 h、36 h收集的样品中PARP均被裂解且转染重组质粒（Flag-TIGAR）的实验组与未转染质粒（MOCK）组或转染空载体（Flag-CMV14）组的样品相比,裂解的PARP表达量明显降低,且差异极显著（P<0.01）。流式结果显示：24 h 检测转染Flag-CMV14后细胞总凋亡率为11%（早期凋亡7.8%,晚期凋亡3.2%）,而转染Flag-TIGAR后细胞总凋亡率仅为4%（早期凋亡3.7%,晚期凋亡0.3%）,转染Flag-CMV14的早期凋亡率和晚期凋亡率均高于转染Flag-TIGAR组,且差异显著（P<0.05）。48 h转染Flag-CMV14后细胞总凋亡率为20.3%（早期凋亡14.3%,晚期凋亡6.0%）,而转染Flag-TIGAR后细胞总凋亡率为6.4%（早期凋亡4.8%,晚期凋亡1.6%）,转染Flag-CMV14组的细胞早期凋亡和晚期凋亡率均高于转染Flag-TIGAR的组,且差异极显著（P<0.01）。【结论】成功扩增出鸡TIGAR基因,并构建了其真核表达质粒,通过Western Blot和流式实验均证实过表达TIGAR后可降低细胞的凋亡程度并有利于细胞存活。     

慢性阻塞性肺疾病患者外周血中性粒细胞凋亡的研究

目的：研究慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者不同病期外周血中性拉细胞(PMN)凋亡及相关基因(bcl-2)的表达。方法：分离外周血中性粒细胞，流式细胞仪分析培养24h PMN凋亡及bcl-2基因表达的情况。结果：COPD患者PMN凋亡率明显低于对照组，bcl—2基因表达上调，急性期组PMN凋亡率又明显低于缓解期组，bcl-2基因表达也明显上调。结论：COPD患者PMN凋亡减少，bcl-2上调。     

外源bcl—2基因和脂质体对鸡卵泡颗粒细胞体外分裂和凋亡的影响

选用正在产蛋的罗曼鸡，取其排序第3的卵泡分离层颗粒层细胞，用含血清培养基培养，并用含脂质体每孔0．0，0．6，1．2，2．4，4．8μL和bcl-2基因重组质粒每孔0．2μg转染卵泡颗粒细胞。用流式细胞术等方法分析转基因后的源代细胞和传代细胞的生长与凋亡情况。结果发现，与未转染组相比，转染后的传代细胞分裂速度较快（P＜0．01）、凋亡比率较低，G2／M＋S期细胞极显著高于对照（P＜0．01），且与脂质体浓度有剂量依赖关系。在转染时间为12h、DNA含量为每孔0．2μg的条件下，脂质体最佳转染浓度为每孔1.2μL。这些结果进一步证明，外源bcl-2基因或脂质体具有促进细胞分裂、抑制细胞凋亡、延长细胞寿命的作用。     

热应激对鸡胸腺细胞凋亡的影响及其调节机理

18只AA肉鸡于 2 2℃饲养。 30日龄时 ,随机分成 3组 ,分别进行 0 ,5和 10h的 4 1℃高温应激处理。用流式细胞仪检测胸腺细胞DNA含量、细胞凋亡率以及细胞caspase 3和Bcl 2的表达。结果 :应激处理 0 ,5和 10h时 ,(1)DNA合成期 (S期 )细胞比例分别是 2 77% ,3 2 8%和 2 31% ;(2 )胸腺细胞凋亡率分别是 3 99% ,11 15 %和3 31% ;(3)caspase 3表达阳性细胞率分别为 14 2 4 % ,2 7 0 1%和 10 84 % ,Bcl 2表达阳性细胞率分别是 2 0 5 9% ,15 13%和 2 7 92 % ;(4 )应激 5h与 0和 10h的细胞凋亡率、caspase 3和Bcl 2的阳性细胞表达率均有显著差异 (P <0 0 5 ) ;(5 )应激处理鸡的胸腺细胞凋亡率、caspase 3表达阳性细胞率从 0h到 5h逐渐升高 ,以后又逐渐下降。在高温应激过程中 ,胸腺细胞凋亡率与caspase 3表达阳性细胞率呈平行的变化关系 ,而与Bcl 2表达阳性细胞率呈反向变化关系。这些结果均说明 :高温应激能明显影响胸腺细胞凋亡 ,而这种细胞凋亡的变化受caspase 3和Bcl 2表达的调节。     

粒细胞集落刺激因子在羊成纤维细胞中的表达及对细胞增殖和凋亡的影响

【目的】研究粒细胞集落刺激因子（granule cell stimulating factor,GCSF）在羊成纤维细胞体外培养中对其增殖、周期和凋亡的影响,为今后基于羊GCSF为靶标诱导全能干细胞进行分子遗传育种研究提供理论依据。【方法】将羊GCSF真核表达质粒pRTL1-GCSF和对照载体质粒pRTL1分别转染到1×10⁵个细胞/mL的羊成纤维细胞中,培养48 h后,利用Trizol法分别提取总RNA并反转录为cDNA,通过实时荧光定量PCR检测羊GCSF在羊成纤维细胞中的瞬时表达水平。通过GCSF依赖型细胞系NFS-60,利用细胞活力检测试剂alamarBlue测定转染48 h后羊成纤维细胞培养上清中分泌表达的GCSF的生物学活性。通过HEK 293F悬浮培养细胞系真核表达分泌型羊GCSF蛋白后,用Ni-NTA凝胶对细胞表达至细胞培养基中的GCSF蛋白进行纯化,并SDS-PAGE检测。加入纯化的30 ng·mL^-1 GCSF蛋白后在24和48 h时,通过alamarBlue测定羊成纤维细胞的增殖状态,利用流式细胞术检测羊成纤维细胞的细胞周期和凋亡变化。【结果】羊GCSF真核表达质粒转染羊成纤维细胞48 h,检测发现在羊成纤维细胞中GCSF表达量得到显著提高。在羊成纤维细胞中,转染了pRTL1-GCSF质粒的羊GCSF表达量是转染了pRTL1空载对照组的（50 615.92±4 738.83）倍（P<0.01）;羊成纤维细胞瞬时分泌表达的含有GCSF蛋白的培养基上清加入到GCSF依赖型细胞系NFS-60后,试验组和阳性对照组中的NFS-60的荧光强度与阴性对照组和空白对照组相比显著升高（P<0.01）,试验组中的NFS-60的荧光强度与阳性对照组相比均差异不显著（P>0.05）,结果显示羊GCSF能显著刺激NFS-60细胞的增殖,表明在羊成纤维细胞中表达的羊GCSF具有生物学活性。用HEK 293F悬浮培养细胞系真核表达分泌型羊GCSF蛋白后,纯化得到羊GCSF蛋白。在羊成纤维细胞中添加30 ng·mL^-1的羊GCSF后,体外培养24和48 h,GCSF试验组与培养基稀释液对照组相比,细胞活力变化差异不显著,而细胞周期的分布出现显著改变。24 h时,与对照组相比试验组的G1期细胞比例由(55.29±1.68)%增加到(69.37±0.24)%,差异极显著（P<0.01）;S期细胞比例由(15.99±0.38)%变为(15.39±0.60)%,差异不显著（P>0.05）;G2/M期细胞显著增多（P<0.05）,比例由(22.88±1.00)%增大到(26.76±0.82)%。表明在羊成纤维细胞中加入羊GCSF的24 h后,处于分裂状态和间期的细胞显著增多。48 h时,与对照组相比试验组G1期细胞比例由(65.96±0.37)%减少为(45.69±0.26)%,差异极显著（P<0.01）;S期细胞比例由(13.45±1.33)%增加为(37.87±2.43)%,差异极显著（P<0.01）;G2/M期细胞比例由(16.42±1.29)%变为(21.80±1.86)%,差异不显著（P>0.05）。表明加入GCSF的羊成纤维细胞在48 h时,处于间期的细胞显著减少,同时DNA复制状态的细胞显著增多。试验组凋亡率和对照组相比,培养24 h时对照组（Ctr）和试验组（GCSF）的凋亡率分别是(7.51±0.38)%和(9.16±0.46)%。48 h时对照组和试验组的凋亡率分别是(5.73±0.29)%和(5.39±0.27)%。72 h时对照组（Ctr）和试验组（GCSF）的凋亡率分别是(8.88±0.45)%和(5.41±0.27)%,24 h和72 h凋亡率差异极显著（P<0.01）,48 h检测时凋亡率差异不显著（P>0.05）,表明在GCSF添加的24 h内促进了细胞凋亡,随着时间的延长,细胞的凋亡受到抑制。【结论】羊成纤维细胞中可以瞬时过量表达羊GCSF,并具有生物学活性。GCSF不影响羊成纤维细胞的增殖,但可调控其周期,影响细胞凋亡。该结果为今后通过羊成纤维细胞介导GCSF培育具有高免疫力、高抗病性的羊进行分子遗传育种奠定了基础。     

转人抑癌基因p53鸡的研究

【目的】探索MAR调控序列对外源人抑癌基因p53在转基因鸡体内整合稳定性的影响,为转基因禽类输卵管生物反应器的建立奠定基础。【方法】利用脂质体包埋法,将pEGFP-N1-p53/MAR重组真核表达载体转染人肝癌细胞(Hep3B),荧光显微镜和透射电镜检测转染含人野生型p53基因的Hep3B细胞形态及超微观结构的变化情况;显微注射法将脂质体介导的重组载体注入鸡X期胚盘的明区和暗区,制备G0代转基因鸡。以EGFP为报告基因,人工授精法制备G1代转基因鸡,对G0代和G1代鸡体外源基因p53进行PCR检测,并对G1代转基因鸡进行小动物活体成像检测。【结果】转染含人p53基因重组载体的Hep3B细胞明显皱缩变圆;微观结构层面,粗面内质网不明显,线粒体肿胀,细胞核中异染色质边集明显,并出现凋亡小体。G0代转基因鸡暗区组孵化率(45%)显著高于明区组孵化率(0)(P0.05),但均显著低于对照组孵化率(82.5%)(P0.05);获得4只基因组中含有外源p53基因的G0代转基因鸡,外源基因转染率为22.2%(4/18);获得2只G1代转基因鸡,转基因世代遗传率为3.08%(2/65)。【结论】重组真核表达载体pEGFP-N1-p53/MAR可以促进人肝癌细胞Hep3B的凋亡;脂质体介导的含MAR序列调控元件的pEGFP-N1-p53/MAR质粒,可以提高p53在转基因鸡基因组中的整合稳定性,并可遗传给后代。     

bcl-2基因在成年和胚胎鸡免疫器官中的表达及其与细胞凋亡的关系

用一步法从17 日龄来克亨SPF鸡胚和90 日龄成年鸡的法氏囊、脾脏和胸腺组织中提取总RNA(TRNA),用鸡B-细胞淋巴瘤/白血病-2基因 (bcl-2) cDNA探针进行Northern blot杂交。发现bcl-2 在成年和胚胎鸡的不同免疫器官中表达量不同, 成年鸡bcl-2 的表达量多少依次为胸腺、脾脏、法氏囊, 而胚胎鸡则是胸腺、法氏囊、脾脏。同时用流式细胞法测定这些器官的细胞凋亡情况, 胚胎鸡法氏囊、脾脏和胸腺的细胞凋亡率分别是0.40% , 0.68% 和0.38% ; 成年鸡则是6.98% , 1.17% 和0.61% 。结果表明, 鸡bcl-2 基因通过阻抑细胞凋亡直接调控正常免疫器官的发育, 在淋巴细胞发育过程中bcl-2是免疫细胞亚型选择的重要调节物。     

脂质体介导质粒DNA法转染藏鸡成纤维细胞的研究

采用Lipofectin阳离子脂质体介导质粒DNA转染藏鸡成纤维细胞,通过优化重组质粒转染细胞的各种参数以寻求最佳的转染条件。结果表明:6孔培养板中细胞汇合度达70%~80%时,用2μL脂质体介导1.5μg重组质粒转染10 h即可获得较满意的转染效率。说明Lipofectin能有效介导质粒pEGFP-N3转染藏鸡成纤维细胞,转染率与细胞生长汇合程度、脂质体包被质粒的浓度比例及转染时间直接相关。     

浅谈饲料中有效能的测定技术

饲料中有效能是供动物生长发育的基础.不同动物所用的有效能体系不同,目前大多数动物采用消化能、代谢能体系,但随着研究的发展与深入,发现最能反映饲料有效能的是净能体系.无论哪种体系,采用合理的测定技术准确测定饲料中的有效能值显得尤其重要,通过对饲料有效能值的准确测定可以实现动物所需能量的精确供给,减少养殖成本,使经济效益最大化.文章综述了几种有效能评价体系的测定技术.     

山茱萸多糖提取工艺优化及马钱苷含量测定

采用L（934）正交设计试验,对山茱萸浸提液中山茱萸多糖的酶水解法提取工艺进行了优化研究,并对浸提液的中有效成分马钱苷含量进行了HPLC法分析。结果表明,山茱萸多糖浸提的最佳工艺为：液料比1∶5,浸提时间4 h,浸提温度80℃,果胶酶添加量0.55 g/L。用HPLC法测定出的山茱萸浸提液中马钱苷平均含量为0.512 ...     

探究板栗的科学贮藏方法

板栗属壳斗科栗属(Castanea mollisima Blume),其种子属于顽拗型种子,不耐贮藏。基于近年来板栗贮藏保鲜技术研究成果,从合理采收、贮前处理、贮藏方法等方面进行论述。     

切花菊耐热性鉴定方法研究

以8个切花菊品种为材料,通过对离体叶片进行50℃高温胁迫后,采用电导法、电阻抗图谱法测定电导率、电阻,并对大田栽培植株进行田间高温胁迫试验,比较品种间的耐热性。结果表明:电导法测得的50℃直接相对电导率、修正相对电导率和电阻抗图谱法测得的胞外电阻在品种间有明显差异,但与田间高温胁迫法测定的热害指数不完全一致。电导法和电阻抗图谱法都可以作为测定切花菊耐热性的方法,但需要结合田间耐热性观察。     

生态旅游潜在客源市场特征的调查研究--以湖南永州金洞森林旅游开发为例

为探明客源市场生态旅游消费的潜在特征,采用问卷调查的形式,就长沙市居民对湖南金洞生态旅游开发的意向等问题进行抽样调查．结果显示,生态旅游符合人们“回归自然”的旅游新时尚,有着极大的开发空间,指出生态旅游的开发要注重环境保护和可持续发展．开发的产品要以休闲度假类的大众产品为主,开发生态旅游都市客源市场还要多种渠道并用,尤其是要注重媒体的宣传．     

啤特果多糖提取工艺的研究

［目的］寻找开发啤特果产业的新途径,提高其附加值。［方法］采用水提醇沉法提取啤特果中的多糖,通过单因素试验和正交试验,以多糖的提取率为评价指标,对影响啤特果多糖提取工艺的因素进行研究。［结果］确定了提取啤特果多糖的最佳工艺参数为温度95℃,料液比1∶2,乙醇浓度67%。在该工艺条件下,啤特果多糖的得率为1.05%。［结论］该研究为开发利用啤特果提供理论依据。     

GEF7基因过表达拟南芥植株幼苗表型分析

利用已构建的过表达拟南芥(Arabidopsis)GEF7基因植株,在光照培养箱中进行培养,并与野生型植株进行对比分析,对GEF7基因过表达植株的幼苗表型进行了观察分析。结果表明,GEF7基因过表达植株幼苗的根长比野生型对照明显增加;其子叶形态、数目和幼苗形态等方面均有异常表型,表明GEF7基因的功能与根的发育有关,并参与调控植物的发育过程。     

《河北农业大学学报》创刊年代考

清光绪二十八年(1902)河北农业大学前身—直隶农务学堂诞生,经几易其名,于1958年更名为河北农业大学至今。清光绪三十一年(1905)直隶高等农业学堂时期创办了《北直农话报》,清光绪三十四年(1908)更名为《直隶农务官报》,中华民国七年(1918)改出《农学月刊》,中华民国十七年(1928)易名为《河大农刊》,中华民国二十三年(1934)更名为《河北通俗农刊》,中华民国二十四年(1935)易名为《河北农林学刊》,1948年更名为《河北农学院研究专刊》,1959年更名为《河北农业大学学报》至今。《河北农业大学学报》前身诸刊都与现时的《河北农业大学学报》有着一脉相承的历史渊源,各刊之间联系紧密,连续性、继承性强。因此,《河北农业大学学报》的创刊时间应追溯至1905年创办的《北直农话报》。     

姬松茸碳源利用规律的研究

试验采用麦秸培养基,系统研究了姬松茸在生长期间对碳源的利用规律。结果表明,姬松茸降解的有机物质绝大部分被菌体的呼吸过程消耗掉,绝对生物学效率较低;在菌丝生长阶段,木质素的降解速率大于纤维素和半纤维素,这对纤维素和半纤维素的降解十分有利;非木质纤维素组分在菌丝生长阶段被主要利用,而木质纤维素则是子实体生长阶段的主要碳源。且就整个栽培过程而言,姬松茸生长发育所需要的79.86%的碳源来自木质纤维素。     

水牛梭形住肉孢子虫包囊抗原的纯化技术

应用萄聚糖凝胶柱层析对水牛梭形住肉孢子虫包囊包溶性抗原进行了纯化。结果表明：纯化水牛梭形住肉孢子虫包囊抗原的最适条件为：选用萄聚糖凝胶Ｇ—１００柱层析系统；洗脱液为０３ＭＰＢＳ（ｐＨ７２），床体积为１０ｃｍ×１６５ｃｍ，上样体积为５００ＨＬ；流速为１２ｍＬ／ｈ。纯化抗原可使琼脂凝胶双扩散试验的阳性检出率提高３０％。