实时荧光定量PCR法检测转基因猪外源基因整合拷贝数

以GFP转基因猪为研究对象,以转铁蛋白受体基因为内参基因,通过SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR建立针对外源基因GFP和内参基因的双标准曲线和方程。对转基因猪基因组DNA中外源基因和内参基因的拷贝数同时定量检测,外源基因与内参基因起始模板拷贝数的比值即为外源基因在转基因猪中的整合拷贝数。同时,利用Southern-blot进行验证分析。结果显示:实时荧光定量PCR法检测2头转基因阳性猪外源基因拷贝数分别为3和2,2头转基因阴性猪外源基因拷贝数均为0,结果同Southern-blot检测一致。结果表明:实时荧光定量PCR法高通量、灵敏、方便,可以更好的用于转基因猪外源基因整合拷贝数的检测。     

利用荧光定量PCR法检测转基因绒山羊外源基因整合拷贝数

外源基因拷贝数是转基因动物检测中的重要内容。本实验室使用PiggyBac(PB)转座子系统获得Tβ4-GFP、FGF5s-GFP、VEGF164-GFP 3种转基因类型陕北白绒山羊,为研究其外源基因整合情况,利用荧光定量PCR方法对其外源基因copGFP的整合拷贝数进行检测。以Gluc为内参基因,建立外源基因和内参基因的标准曲线方程,对转基因陕北白绒山羊DNA进行荧光定量PCR,将copGFP/Gluc的比率作为外源基因的拷贝数。同时,选取Tβ4-GFP转基因绒山羊对其整合位点进行检测,以验证拷贝数结果。结果显示:copGFP与Gluc的标准曲线方程分别为,y=-3.230 6x+39.216(R~2=0.998 8)、y=-3.564 8x+38.440(R~2=0.996 0);成功得到9只转基因绒山羊的整合拷贝数;Tβ4-GFP转基因绒山羊整合位点数目和拷贝数检测结果一致。结果表明,利用荧光定量PCR检测转基因绒山羊外源基因整合拷贝数,操作简单、灵敏方便,是一种切实可行的检测方法。     

利用实时荧光定量PCR检测外源基因拷贝数体系的建立

黑素皮质素受体4(Melanocortin receptor 4,MC4R)基因是影响猪生长肥育性能的主效基因之一,是参与调控体重、采食和能量平衡的关键信号物质。动物转基因技术目前主要应用于生产珍贵蛋白、基因治疗、器官移植、动物品种改良和建立疾病模型等方面。目前人们已经获得了如羊、牛、小鼠、猪等多种转基因克隆动物。确定外源基因的拷贝数和整合位点是对后续外源基因功能探讨和表型研究的前提条件。本研究将MC4R基因转入猪PK15细胞中,挑单克隆,通过3对特异性引物对转染细胞做PCR扩增检测出阳性细胞,实时荧光定量PCR检测外源基因拷贝数,初步建立了检测外源基因拷贝数的实验体系。     

转PRL基因小鼠遗传性状分析

本研究以原核注射法生产的乳腺特异性表达PRL基因小鼠为模型,从外源基因遗传完整性、拷贝数和插入位点3方面对其进行遗传性状分析,为今后大型转基因动物的选育提供基础。采用基因组DNA PCR方法筛选发生外源基因片段部分缺失的小鼠,并进行Southern blot验证,以检测外源基因的遗传完整性;用绝对荧光定量PCR方法测定外源基因拷贝数,用Genome walking方法分析外源基因整合位点。结果显示,外源基因片段部分缺失率为1.91%;整合十几个拷贝外源基因的小鼠在便携UV灯下可见绿色荧光,整合2个拷贝的小鼠无绿色荧光;在NW_001073945.1序列的2 025~2 026bp和NW_001030574.1序列的10 760 020~10 760 021bp处插入的外源基因可正常表达。以上结果说明,外源PRL基因在原核注射法生产的转基因小鼠中可稳定遗传;在一定范围内,外源基因的表达量与拷贝数呈正相关;附近无其他基因的外源基因插入位点有利于外源基因的表达。     

SYBR Green实时定量PCR检测转Fat-1基因水牛体细胞方法的建立

荧光定量PCR是近些年发展起来的一项新技术,可用于检测外源基因的整合拷贝数、临床诊断、食品安全和动物疾病检测等领域,具有广阔的应用前景。本文构建了携带Fat-1基因的标准品质粒,以SYBR Green为荧光染料,进行实时荧光定量PCR反应,建立标准曲线,并结合绝对定量法检测Fat-1基因在水牛耳缘和肾脏成纤维细胞基因组中的整合拷贝数。结果表明,转Fat-1基因的水牛体细胞的Ct值与起始拷贝数对数的回归方程为:y=-3.43x+31.01,R2为0.998 7,反应效率为99.5%,具有良好的重复性。本文建立的这种高效检测水牛体细胞基因组中外源基因拷贝数的方法,为后期转Fat-1基因水牛的表达分析和检测等研究奠定基础。     

人转铁蛋白转基因克隆牛整合位点检测

为检测外源基因整合在转基因克隆牛染色体上的定位情况,通过优化染色体荧光原位杂交技术,成功对4头人转铁蛋白转基因克隆牛的整合位点进行定位。每头牛分析中期分裂相40个以上,杂交率在53.1%~86.8%之间,且杂交信号分别位于转基因克隆牛的11号、15号和19号染色体的相应位置;另外采用定量PCR方法对杂交信号强弱不同的转基因克隆牛个体进行整合位点拷贝数的检测,结果显示拷贝数的多少与杂交信号强弱直接有关。     

TaqMan实时荧光定量PCR检测毕赤酵母基因组中外源基因拷贝数

以3-磷酸甘油醛脱氢酶为内参基因,建立一种快速检测毕赤酵母基因组中外源基因拷贝数的TaqMan荧光定量PCR方法.通过对反应参数进行优化,建立针对目的基因和内参基因的双标准曲线,并对重组酵母基因组中外源基因和内参基因的拷贝数进行同时定量检测,外源基因与内参基因起始模板拷贝数的比值即为外源基因在重组酵母菌株基因组中的拷贝数.结果表明,2条标准曲线在101～108拷贝·μL-1具有良好的线性关系,以及良好的敏感性和重复性.利用该方法对60株重组酵母菌株进行荧光定量PCR检测,结果筛选到38株单拷贝插入菌株和22株多拷贝插入菌株.本研究所建立的TaqMan探针荧光定量PCR方法方便、高效,可用于重组毕赤酵母基因组中外源基因拷贝数的检测.     

转FABP基因克隆牛外源基因的稳定性及其粪便对蚯蚓的影响

正(上接第15期)第三部分外源基因的稳定性检测本试验通过每隔1至2个月定期采样两头转基因牛、受体母牛、同饲养环境健康普通秦川牛的粪便、土壤、口腔拭子,提取DNA,PCR检测源基因是否发生基因漂移,进而证明转基因牛外源基因是否稳定。1试验材料1.1试验动物转基因牛1号、转基因牛2号、同饲养环境健康普通秦川牛、受体母牛     

人α-乳清蛋白转基因克隆牛外源基因拷贝数的分析

为了探讨转基因克隆动物外源基因拷贝数及拷贝数在传代过程中的变化,本研究应用实时荧光定量PCR检测人α-乳清蛋白(human alpha-lactalbumin,HLA)转基因克隆牛及其子代共5头牛中外源基因的拷贝数,其中K060923为亲代,172、081、189、隆娃为子代。HLA基因在亲代转基因克隆牛K060923中的拷贝数为1.145,在子代转基因克隆牛172、081、189和隆娃中分别为0.998、1.107、0.891和0.842。结果表明,5头牛中外源基因拷贝数都在1左右,说明人α-乳清蛋白基本以单拷贝形式整合到宿主基因组中,且稳定遗传。     

黄牛GBP4基因拷贝数变异检测及其对5个生长性状的影响

[目的]研究黄牛GBP4基因拷贝数变异检测及其对5个生长性状的影响。[方法]本实验以200头秦川牛和100头夏南牛为研究对象,通过实时荧光定量PCR技术检测GBP4基因拷贝数变异。[结果]分析发现,GBP4基因拷贝数变异的分布在2个品种之间存在显著差异(P0.05)。秦川牛群体存在Gain和Normal两种类型;夏南牛群体存在Gain,Normal和Loss三种类型;其中Gain为拷贝数增加型,Normal为拷贝数不变型,Loss为拷贝数减少型。该基因拷贝数变异类型与秦川牛和夏南牛5个生长性状关联分析显示,GBP4基因拷贝数变异与秦川牛体高显著相关(NormalGain P=0.046)。[结论]本研究结果表明,GBP4基因拷贝数变异可以作为秦川牛选育的候选分子标记。