中低产红泥田双季晚稻氮磷钾效应模型研究

采用"3414"二次回归D—最优设计,对影响水稻产量的氮、磷、钾三要素进行试验,建立融安县中低产红泥田双季晚稻施肥函数模型:y=3811.92+24.48N+6.3P+6.86K-0.10N2-0.43P2-0.09K2+0.13NP+0.01NK+0.23PK。通过该模型推算最高和最佳产量施肥量,并进行仿真模拟寻优,探索出产量大于5 700kg/hm2的施肥方案:N 135.8～195.8kg/hm2、P2O549.5～74.8kg/hm2、K2O 94.6～145.4kg/hm2,N∶P2O5∶K2O=1∶0.36～0.38∶0.70～0.74。     

平衡施肥对麻竹产量及品质的影响初报

设置3因素3水平正交设计L9(33)的麻竹肥料试验。其结果表明:(1)施肥对麻竹产量有极显著的增产效应,氮、磷、钾增产的主次顺序为N>P>K。麻竹产量与施肥量回归方程y=84.30X1-86.44X2 152.15X3-0.229X12 0.947X1X2-0.769X22-0.736x1x3 0.953x32 17744(X1:施N量kg/hm2,X2:施P2O5量kg/hm2,X3:施K2O量kg/hm2,Y:产量kg/hm2),且差异达极显著;(2)最佳施肥配比N:P2O5:K=1:0.51:0.58,最大产量为44491.86kg/hm2,对应的年最大产量施肥量为N:228.71kg/hm2,P2O5:115.58kg/hm2,K2O:132.88kg/hm2;(3)施肥对笋中含N、P、K含量有显著影响;(4)施肥对笋中粗蛋白含量影响极显著主次顺序N>P>K     

施肥对蒺藜药材产量的影响

在沙地生境中,施肥是提高规范化种植蒺藜药材产量的重要农艺措施.研究结果表明:不同氮、磷、钾施用量对蒺藜药材产量影响显著,氮肥是产量的第一限制因子,其次是磷肥和钾肥.将N、P2O5和K2O换算N、P、K肥料施用量为N不低于230 kg/hm2,尿素约450 kg/hm2;P2O5不低干250 kg/hm2,过磷酸钙约500 kg/hm.;K2O不低于125 kg/hm2,硫酸钾约270 ks/hm2.以此施肥水平,蒺藜药材产量可达3 000～3 500 k/hm2,较不施肥增产5～6倍.     

黔苦2号苦荞新品种春播高产综合农艺措施研究

运用二次回归正交旋转组合设计,在春播条件下研究黔苦2号苦荞籽粒产量与其播种量及N、P、K肥施用量间的关系.通过试验,建立了黔苦2号籽粒产量与主要农艺措施的数学模型,通过对模型的解析和模拟寻优分析.结果表明:黔苦2号籽粒产量高于2800kg/hm2的优化栽培技术方案:播种量67.14～74.93 kg/hm2,施N量28.88～40.12 kg/hm2,施P2O5量179.11～210.89 kg/hm2,施K2O量43.94～61.06kg/hm2;试验4因子对籽粒产量影响的程度大小为播种量>施K2O量>施P2O5量>施N量.     

施肥对两个紫花苜蓿品种生产性能及营养品质的影响

在甘肃省兰州市永登县中川镇,以‘甘农3号’紫花苜蓿(Medicago sativa L.vc.Gannong No.3)和‘陇东苜蓿’(Medicago sativa L.cv.Longdong)为材料,采用完全随机区组设计的大田试验,研究不同施肥水平CK(不施肥)、N0P(P2O5105.00kg/hm2)、N1P(N 51.75kg/hm2+P2O5105.00kg/hm2)和N2P(N 103.50kg/hm2+P2O5105.00kg/hm2)下2种苜蓿产量、株高及营养品质的变化,以探讨施肥对紫花苜蓿的影响.结果表明:施肥对紫花苜蓿影响明显,施肥能显著提高紫花苜蓿产量,提高株高,改善营养品质.随施肥水平的增加,紫花苜蓿总产量增加.在N2P(N 103.50kg/hm2+P2O5105.00kg/hm2)水平下紫花苜蓿总产量达最高,‘甘农3号’的最高鲜草产量为19 078kg/hm2,干草产量为5 254kg/hm2,‘陇东苜蓿’鲜草产量为17 398kg/hm2,干草产量为5 040kg/hm2.施肥能显著促进紫花苜蓿的植株高度,且株高随施肥水平的增加而增加.与对照比较,施肥后的‘甘农3号’和‘陇东苜蓿’粗蛋白、粗脂肪和粗灰分含量显著增加,酸性洗涤纤维和中性洗涤纤维含量显著降低,各营养成分单位面积产量均有所增加.     

平衡施肥对桑叶品质及其活性成分含量的影响

以四川丘陵蚕区夏伐式养成的春秋两季桑树为研究对象,采用现代肥料二次回归“3414”设计方案,研究氮(N,X1)、磷(P,X2)、钾(K,X3)肥不同施用量对桑叶粗蛋白、可溶性糖、总黄酮、1-DNJ含量的影响.结果表明:随着桑树的生长发育,春秋两季桑叶品质及其活性成分含量均呈现先升高后降低的趋势,粗蛋白和可溶性糖在秋季8月20日含量最高,总黄酮和1-DNJ在春季5月15日含量最高;N、P、K不同施肥处理对桑叶品质及其活性成分含量均有显著影响,随着施肥水平的提高,其含量均随之显著增加,在2水平(X12X22X32)时达到最大.通过建立目标产量的肥料效应函数,分别获得了桑叶粗蛋白、可溶性糖、总黄酮、1-DNJ的推荐施肥量及最高产量为:718.46 kg/hm2 N、220.11 kg/hm2 P2O5 、305.23 kg/hm2 K2O,桑叶粗蛋白最高产量为1816.83 kg/hm2;666.54 kg/hm2 N、204.41 kg/hm2 P2O5、243.18 kg/hm2 K2O,桑叶可溶性糖最高产量为1042.65 kg/hm2;675.96 kg/hm2 N、326.49kg/hm2 P2O5、462.90 kg/hm2 K2O,桑叶黄酮最高产量为147.90 kg/hm2;720.93 kg/hm2 N、225.11 kg/hm2 P2O5、323.63 kg/hm2K2O,桑叶DNJ最高产量为13.55 kg/hm2.     

施肥水平对蒌蒿生长与挥发油化学成分的影响

以蒌蒿安徽种群为试验对象,进行了5个施肥水平处理,结果表明:在N 360 kg/hm2、P2O5120 kg/hm2、K2O 150 kg/hm2施肥水平下,蒌蒿植株生长势强,生物产量、经济产量、经济效益均高于其它处理,单萜及其衍生物含量高;在N 270 kg/hm2、P2O5 120 kg/hm2、K2O 150 kg/hm2施肥水平下,蒌蒿植株产量性状较好,倍半萜及其衍生物含量高.     

“3414”肥效试验对慈姑产量及经济效益的影响

[目的]筛选最佳施肥配方,为慈姑生产专用肥的研究奠定基础.[方法]采用”3414”方案设计,测定每个施肥处理的慈姑产量;研究N、P、K不同施肥处理对慈姑产量和经济效益的影响;采用一元二次肥料效应模型得出慈姑最佳施肥量配比.[结果]N、P、K对慈姑产量有较大影响,N2P2K3处理的肥料配施比例最佳,产量为18 397.80 kg/hm2,增产率104.77％,净增收入80 317.35元/hm2.氮肥对慈姑产量的影响最大,钾肥其次,磷肥最小.[结论]慈姑最高产量的施肥量为:N 446.70 kg/hm2、P2O5 68.10kg/hm2、K2O5 34.90 kg,/hm2,慈姑最高产量为18612.75 kg/hm2.最佳经济产量的施肥量为:N420.60 kg/hm2、P2O5 70.50 kg/hm2、K2O4 92.15kg/hm2,最佳产量为18 579.00 kg/hm2.     

糯玉米优化施肥研究

采用 3因子 5水平最优回归设计 ,建立了N、P、K肥与糯玉米产量的数学模型。由模型得知 :① 3个因子对产量的影响顺序为N >P >K ;②产量 >14 2 5 0 .0kg/hm2 ,利润 >15 0 0 0 .0 0元 /hm2 的优化施肥方案为施N 10 4.7～ 15 5 .3kg/hm2 ,P2 O55 5 .4～ 74.3kg/hm2 ,K2 O 87.2～ 12 3 .3kg/hm2 。     

氮磷钾配比对云烟100生长发育及产质量的影响

应用D-饱和最优回归设计,通过氮、磷、钾配比田间试验,建立烤烟施用氮、磷、钾对烤烟产量、产值及施肥利润的效应函数。试验结果表明:产量极大值氮、磷、钾优化施肥组合为N=-0.2858,P2O5=-0.0710,K2O=0.0906,此时的产量为3080.14 kg/hm2。产值极大值氮、磷、钾优化施肥组合为N=-0.9552,P2O5=-0.0149,K2O=0.3683,此时的产值为39513.59元/hm2。最佳施肥利润的氮、磷、钾优化施肥组合为N=-1,P2O5=-0.0248,K2O=0.2840,此时烤烟的产量为2956.48 kg/hm2,产值为38174.43元/hm2,施肥利润为36710.92元/hm2。综合分析得出最佳的施肥组合范围为N64.28 kg/hm2、P2O5144.3¹48.95 kg/hm2、K2O 235.2148.95 kg/hm2、K2O 235.2²66.4 kg/hm2,即N∶P2O5∶K2O=1∶(2.2266.4 kg/hm2,即N∶P2O5∶K2O=1∶(2.2².3)∶(3.62.3)∶(3.6⁴.1)。     

多重富集定量PCR(ME-qPCR)同时检测4种食源性病原弧菌

【目的】溶藻弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、霍乱弧菌是4种重要的食源性病原弧菌,能够造成人类多种疾病,建立同时检测这4种食源性病原弧菌的检测方法是保障食品安全的基础。本研究旨在建立同时检测溶藻弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、霍乱弧菌的多重富集定量PCR(multiplex enrichment quantitative PCR,ME-q PCR)方法,并含扩增内标用于指示PCR反应的假阴性,创新一种高通量、高灵敏度、具备定量能力的检测方法,为这4种食源性病原弧菌的检测提供新方法。【方法】以细菌16S r RNA为扩增内标靶序列设计引物,并针对副溶血弧菌的collagenase、溶藻弧菌的gyr B、霍乱弧菌的omp W、创伤弧菌的vvh A,分别设计内、外2对特异性引物,首先将所有内、外引物混合,进行一个循环数较少(10—20 cycles)的高通量多重富集PCR将靶基因富集出来,由于循环数较少,各个基因得到均匀的扩增,每个基因均有4种可能的产物,每1种产物均能作为第二轮巢氏荧光定量PCR的模板,这增加了靶基因从模板中被富集出来的概率,然后将产物稀释后作为模板,利用内引物分别进行巢式荧光定量PCR检测各个基因,最后根据扩增曲线和熔融曲线分析结果。通过设置不同的第一轮多重富集PCR循环数(10、15和20个循环),优化ME-q PCR第一轮循环数。采用14株标准菌株的基因组DNA作为模板,评价ME-q PCR的特异性。并以4种弧菌基因组DNA混合物梯度稀释的样品(100、10、1、0.1、0.01和0.001 ng·μL-1)作为模板,对建立的ME-q PCR进行灵敏度和定量能力的评价。并将该方法应用于已分离到的69株疑似弧菌菌落的鉴定中,与传统生理生化鉴定结果进行对比。【结果】优化后,ME-q PCR的第一轮循环数确定为15,特异性评价结果显示该方法特异性强,灵敏度达0.001 ng,高于普通荧光定量PCR约1个数量级,并能有效指示PCR反应的假阴性,且拥有与普通荧光定量PCR相同的定量能力,扩增效率和R2符合定量的要求;将建立的ME-q PCR方法应用于69株疑似弧菌菌株的鉴定,24个绿色菌落为副溶血弧菌,22个黄色菌落为溶藻弧菌,1个黄色菌落为创伤弧菌,没有检出霍乱弧菌,其结果与生理生化鉴定结果一致。【结论】该方法能够定量、快速准确地检测副溶血弧菌、溶藻弧菌、霍乱弧菌和创伤弧菌这4种食源性病原弧菌,灵敏度高,并能有效指示PCR反应的假阴性,结果无需凝胶电泳,适用于食品中4种常见病原弧菌的快速筛检。     

家蚕glial cell missing (BmGcm)基因鉴定、表达、亚细胞定位和功能

【目的】鉴定、克隆家蚕（Bombyx mori）glial cell missing (BmGcm)基因,分析其mRNA表达及亚细胞定位特征。制备多克隆抗体,同时在细胞水平进行过表达,检测Gcm对细胞增殖和周期的影响,为探究BmGcm功能打下基础。【方法】利用RACE方法克隆获得BmGcm全长cDNA序列,利用ORF Finder和SMART等在线工具对BmGcm基本序列特征和结构信息进行分析,运用Clustalx 和MEGA 6.0等软件对多物种Gcm蛋白进行同源序列比对和进化分析。采用RT-PCR和qRT-PCR方法检测BmGcm的表达情况。利用原核表达系统获得重组蛋白,通过蛋白纯化和免疫小鼠制备多克隆抗体,运用Western blot对抗体进行检测。构建BmGcm表达载体,转染家蚕胚胎细胞系,分析其亚细胞定位情况,同时利用EDU细胞增殖标记和流式细胞仪对其功能进行探索。【结果】BmGcm（BGIBMGA006182）定位于4号染色体的nscaf2847上,其基因全长 4 046 bp,包含4个外显子和3个内含子。其cDNA全长1 734 bp,包含166 bp的5′ UTR、227 bp的3′ UTR和1 341 bp的完整开放阅读框(ORF)。该基因编码446个氨基酸残基,预测蛋白分子量为50.61 kD,等电点5.557,含有典型的GCM结构域。多重比对结果显示GCM结构域在不同物种间具有高度的保守性,进化分析显示昆虫Gcm蛋白单独聚为一支,其中BmGcm蛋白与帝王蝶同源蛋白亲缘关系最为接近。表达分析结果显示BmGcm在胚胎发育第4天表达达到峰值,随后表达水平逐渐下调,而在幼虫阶段,BmGcm主要表达于中肠、精巢和卵巢。将BmGcm完整的开放阅读框序列构建至原核表达系统,经IPTG诱导和亲和层析纯化获得高纯度重组蛋白,通过免疫小鼠获得了多克隆抗体,Western blot检测该抗体可以特异性识别重组蛋白。在家蚕细胞系中过表达BmGcm蛋白,结果显示其定位于细胞核。在细胞水平,过表达BmGcm会明显抑制细胞增殖,将细胞周期阻滞于G1/S期。【结论】克隆鉴定得到Bmgcm全长序列,获得其表达和亚细胞定位信息。通过原核表达、蛋白纯化和免疫小鼠制备了可用的多克隆抗体。细胞实验发现BmGcm可以显著抑制增殖和影响正常的细胞周期进程。     

家蚕组织蛋白酶L(BmCathepsin L)基因鉴定、表达及其功能分析

【目的】鉴定克隆家蚕组织蛋白酶L基因BmCathepsin L(BmCat L),分析其序列和表达特征。分析家蚕组织蛋白酶L在大肠杆菌诱导下m RNA表达量的变化趋势,为进一步研究家蚕组织蛋白酶L的功能打下基础。【方法】基于家蚕基因组数据库(Silk DB)中序列BGIBMGA006893设计引物,利用RACE技术克隆家蚕组织蛋白酶L基因的cDNA全长序列,通过在线工具对基因结构和蛋白质分子量及等电点进行预测;在NCBI数据库下载其他物种组织蛋白酶L同源序列,利用Clustalx(1.83)和MEGA 6.0软件进行同源比对并构建进化树。运用RT-PCR和qRT-PCR对其时空表达特征进行分析。选取该基因的特异性片段,经PCR扩增,测序验证后将其连接至pET-28载体,转化至Rosseta感受态表达菌株,经IPTG在适宜温度条件下诱导,获得组织蛋白酶L重组蛋白。然后再利用镍离子亲和层析法对该蛋白进行纯化,获得纯度较高的重组蛋白。最后利用大肠杆菌对家蚕血液系统进行攻毒,检测家蚕组织蛋白酶L基因的表达水平。【结果】通过查询家蚕基因组数据库和生物信息学分析得出,家蚕组织蛋白酶L基因定位于家蚕第10号染色体上,基因编号为BGIBMGA006893,nscaf2860。基因开放阅读框全长687 bp,编码228个氨基酸,含有保守的Pept_C1结构域。通过在线网站预测,得出该蛋白酶的分子量为26.132 k D,等电点为4.57。进化分析表明该基因与同为鳞翅目昆虫的草地贪夜蛾和黑脉金斑蝶亲缘关系最为接近。RT-PCR显示该基因集中表达于血细胞,在血液不同龄期也较高表达。用His抗体检测经纯化后的蛋白,最终成功孵育出纯化后的蛋白条带;大肠杆菌个体攻毒免疫试验检测显示,其mRNA表达水平随攻毒时间呈现抛物线式的显著性变化规律,从而揭示出BmCat L与家蚕免疫系统的关联性。【结论】克隆获得家蚕组织蛋白酶L基因的cDNA序列,发现其特异性高表达于血细胞。通过原核表达和蛋白纯化成功获得了该基因的重组蛋白。大肠杆菌的刺激能够显著上调其表达,推测组织蛋白酶L可能参与家蚕免疫反应。     

三重PCR检测黄瓜靶斑病菌、炭疽病菌和细菌性角斑病菌

【目的】开发一种可同时检测黄瓜靶斑病菌(Corynespora cassiicola)、黄瓜炭疽病菌(Colletotrichum orbiculare)和黄瓜细菌性角斑病菌(Pseudomonas syringae pv.lachrymans)的三重PCR快速检测方法。【方法】根据ITS或16S r DNA序列分别设计黄瓜靶斑病原菌、黄瓜炭疽病菌和黄瓜细菌性角斑病菌特异性检测引物;通过鉴定引物的特异性,筛选可在目标菌株中扩增出特异片段的特异引物;选择可以组合的3种病原菌特异性引物进行三重PCR,对引物浓度、退火温度、延伸时间和循环数分别进行优化,优化三重PCR体系。【结果】针对黄瓜靶斑病菌、黄瓜炭疽病菌和黄瓜细菌性角斑病菌分别设计出5对、7对和6对特异性引物,其中引物CC4F/CC4R和CC5F/CC5R可特异扩增黄瓜靶斑病菌ITS,引物CL1F/CL1R、CL2F/CL2R、CL3F/CL3R、CL3F/CL4R、CL3F/CL5R、CL3F/CL6R和CL3F/CL7R可特异扩增黄瓜炭疽病菌ITS,引物PS3F/PS4R和PS4F/PS4R可特异扩增黄瓜细菌性角斑病菌16S rDNA。引物CC5F/CC5R、CL3F/5R和PS3F/4R扩增片段长度分别为370、275和698 bp,其混合扩增产物可在3%琼脂糖凝胶上得到充分分离,这3对引物选择作为三重PCR引物。在三重PCR反应体系中,当引物CC5F/CC5R、CL3F/5R和PS3F/4R的终浓度分别为0.16、0.4和0.16μmol·L~(-1)时,3个目的片段能同时得到有效扩增;当退火温度大于65℃时,部分目的片段不能有效扩增。最终建立并验证了适合上述3种黄瓜主要病原菌的三重PCR检测体系,即25μL PCR反应体系中含有12.5μL 2×Hiff~(TM) PCR Master Mix(With Dye)、0.16μmol·L~(-1) CC5F/CC5R、0.4μmol·L~(-1) CL3F/CL5R、0.16μmol·L~(-1) PS3F/PS4R。反应程序:95℃预变性3 min;95℃变性30 s,65℃退火30s,72℃延伸2 min,35个循环;最后72℃延伸10 min。【结论】建立的三重PCR方法能够快速检测田间采集的黄瓜发病叶片中的黄瓜靶斑病菌、黄瓜炭疽病菌和黄瓜细菌性角斑病菌,灵敏度均可达到0.4 pg·μL~(-1)。     

日本血吸虫SjELAV-like 1的克隆、表达及功能分析

【目的】克隆和表达日本血吸虫胚胎致死异常视觉基因1（SjELAV-like 1）,分析其在日本血吸虫体内的表达情况及定位,探究该基因对日本血吸虫形态和生殖发育的影响。【方法】利用RACE技术扩增5′/3′末端,获得SjELAV-like 1基因序列提交至NCBI,Gene Bank登录号：MG515727,构建该序列的重组表达质粒 pET28-SjELAV-like 1,并在大肠杆菌BL21中利用IPTG诱导表达,收集不同诱导时间的菌体,SDS-PAGE法进行蛋白电泳。利用His镍柱亲和层析法纯化大量表达所得重组蛋白,用纯化重组蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体,用于Western blotting 分析虫体内该天然蛋白的免疫原性,以及间接免疫荧光检测该蛋白在虫体内的分布情况。小鼠腹部贴片法感染日本血虫尾蚴,收集虫体不同发育阶段混合和合抱分开的雌、雄虫体,以单钉螺逸出的尾蚴感染小鼠获得25 d单性雌、雄虫体,通过实时定量 PCR分析该基因的表达情况。通过尾静脉注射小干扰RNA（siRNA）于感染小鼠体内,使该基因表达沉默,筛选最佳干扰效果的siRNA,用于长期RNA干扰（RNAi）试验,分析其对日本血吸虫雌虫产卵及卵胚孵化的影响。利用扫描电镜和透射电镜观察RNAi对虫体体被结构及雌、雄虫生殖器官的影响。【结果】获得的1 797 bp的SjELAV-like 1基因序列含有poly A尾,其中编码序列为1 533 bp,编码510个氨基酸。重组质粒pET28-SjELAV-like 1在诱导4 h时表达量最高,主要以包涵体的形式存在,利用纯化蛋白获得了优质多抗,获得的重组蛋白具有良好的免疫原性,经分析发现SjELAV-like 1蛋白主要分布在虫体体被。RT-qPCR 发现SjELAV-like 1在不同时期雌、雄虫体内均有表达,在雄虫体内表达稳定,但在雌虫体内随着发育成熟其表达水平呈下降趋势;在不同感染状态的雌、雄虫体内,与正常发育雌虫相比,该基因在发育阻遏雌虫体内高表达,而在雄虫体内无明显差异。RNAi试验中,与NC组相比,长期干扰组小鼠肝减卵率、雌虫对肝卵贡献减少率和卵胚减孵化率分别为58.27%（P＜0.05）、40.59%（P＜0.01）和74.58%（P＜0.01）;电镜观察发现,干扰组虫体体被结构改变,雄虫体表粘附的泡状物消失,立体的褶脊结构塌陷,整齐排列的条索状皮脊变的疏松,网状结构消失,雌虫体壁表面组织间隙增宽,分布于其上的体棘减少、变钝,雄虫精母细胞数目减少,其内的染色质减少,细胞肿大,细胞间质增宽,雌虫卵黄细胞中卵黄球减少,其中包含的卵黄滴也减少,内质网肿大,皮质颗粒排列散乱。【结论】成功克隆和表达了在日本血吸虫发育阻遏雌虫中高表达的部分SjELAV-like 1基因序列,且发现该基因主要在虫体体被表达。该基因沉默使肝脏荷卵数、雌虫对肝卵贡献率和卵胚孵化率均显著降低,并改变虫体体被结构,抑制生殖腺的正常发育,提示该基因对日本血吸虫的生殖发育有重要的作用。     

家蚕碱性磷酸酶原核表达纯化、结构与活性分析

【目的】碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)是生物体内磷酸代谢的关键调控酶。不同物种ALP的性质与其生理功能密切相关。研究家蚕(Bombyx mori)ALP(BmALP)的性质和结构,为揭示ALP在昆虫体内的生理功能和调控机制提供依据。【方法】取5龄3 d家蚕中肠组织,利用Trizol法提取总RNA,然后以其为模板反转录合成cDNA。以家蚕中肠cDNA为模板,利用Primer Premier 6.0软件分别设计上下游引物,通过PCR克隆BmALP。将BmALP与不同的表达载体分别进行双酶切,然后连接并转化表达菌株,利用大肠杆菌表达重组蛋白。比较不同表达载体在上清中的表达情况,选择可溶性重组蛋白表达最好的载体,利用Origami B(DE3)细胞大量表达重组蛋白,借助Ni-NTA亲和层析纯化重组的His-Trx-BmALP蛋白,然后加入Prescission蛋白酶在4℃酶切20 h,再次利用Ni-NTA亲和层析去除融合标签His-Trx。利用凝胶过滤层析分析BmALP分子量及其在溶液中的状态,利用圆二色光谱研究BmALP的二级结构及其随温度的变化。通过酶活分析研究BmALP的最适pH、最适温度、Km、结构稳定性及金属离子对其酶学活性的影响。【结果】从家蚕中肠组织提取了总RNA,反转录合成了cDNA,并以该cDNA为模板成功克隆了BmALP。分别构建了BmALP的pSKB2、ppSUMO和pET32M.3C 3种表达载体。表达分析发现,pET32M.3C载体有助于重组的融合蛋白His-Trx-BmALP以可溶性蛋白的形式在细胞裂解后的上清液中表达,然后利用pET32M.3C载体大量表达重组蛋白,并通过Ni-NTA亲和层析纯化获得了可溶性的His-Trx-BmALP。加入Prescission蛋白酶酶切,再次通过Ni-NTA亲和层析去除了融合标签His-Trx。凝胶过滤分析显示BmALP在溶液中形成稳定的二聚体结构。圆二色光谱研究表明BmALP包含有α-螺旋结构,其含量随温度的升高逐渐减少。酶活分析揭示BmALP的最适pH和最适温度分别为11.0和45℃。测定BmALP的Km值为1.40 mmol·L~(-1)。在10℃处理2 h后,BmALP的残余活性最高;35℃处理2 h后,其活性完全丧失。Mg2+和Zn2+促进了BmALP催化反应的进行,其最适浓度分别为40和5 mmol·L~(-1)。在20 mmol·L~(-1)浓度范围内,Cu2+激活了BmALP活性,其中10 mmol·L~(-1)时激活效果最好,浓度超过20 mmol·L~(-1)时,Cu2+则抑制了BmALP活性。【结论】克隆了家蚕碱性磷酸酶基因BmALP,表达纯化了BmALP蛋白并分析了其结构和性质,为深入研究其结构和功能打下了基础。     

番茄抗性相关基因SlHin1的克隆、表达与抗病毒功能

【目的】克隆番茄抗性相关基因Sl Hin1(harpin-induced gene 1),分析其生物信息学特征、组织表达和亚细胞定位情况,研究其在抗烟草花叶病毒侵染、移动中的作用,为番茄抗性育种提供理论依据。【方法】通过RT-PCR及基因克隆方法,从番茄总RNA中克隆得到基因SlHin1;应用生物信息学方法分析其DNA序列及其编码的蛋白序列特性,使用MEGA6.0对SlHIN1氨基酸序列及其同源序列进行多序列比对,并构建同源物种间系统进化树;将该基因片段通过Sal Ⅰ和Bam HI双酶切连接至荧光表达载体pCV-m GFP-C1,采用GFP标记的方法进行亚细胞定位检测,分析编码蛋白表达位置;利用实时荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)分析该基因在番茄不同组织的表达量水平;将该基因片段通过Nco Ⅰ和Bam HI通过双酶切连接至植物表达载体pFGC5941,用土壤农杆菌EHA105瞬时过表达该基因并接种标记有绿色荧光的烟草花叶病毒侵染性克隆,以检测植株对病毒的抗性变化,间接ELISA法检测病毒的含量,探究该基因的抗病毒功能。Western blot验证SlHIN1蛋白在本氏烟内的表达情况。【结果】利用RT-PCR方法从番茄材料(Solanum lycopersicon cv.Ailsa Craig)的叶片组织中克隆得到全长为675 bp的番茄抗性相关基因Sl Hin1,将序列分别提交至Gen Bank,得到序列号KU195820。序列比对及生物信息学分析表明,其基因预测编码225个氨基酸,分子量为26.1 k D,理论等电点为9.35,结构上具有LEA-14保守结构域,不具有跨膜区段,并且位于番茄基因组10号染色体上(Solyc10g081980);多序列比对及进化树分析表明,该基因编码的蛋白与茄科植物HIN1氨基酸同源性80.0%以上而与水稻、高粱单子叶植物的亲缘关系较远;亚细胞定位显示定位在细胞膜上与PSORT Prediction预测的亚细胞定位最高概率一致;qRT-PCR结果分析表明该基因具有组织特异性,表达量在根、叶、茎间依次降低;在本氏烟中瞬时过表达SlHIN1并在表达部位接种标记有绿色荧光的烟草花叶病毒侵染性克隆,处理组本氏烟在接种病毒4 d后没有任何荧光出现,而对照组出现绿色荧光。随着接种时间推移,接种7 d后处理组叶片上零星荧光有略微的扩大,而对照组的绿色荧光已经扩散至心叶。间接ELISA检测病毒含量较对照组少,处理组的病毒扩散受到抑制。Western blot分析结果表明,显色后的硝酸纤维素膜上约在26 k D处有一特异条带,而空载体的对照无相应条带,说明SlHIN1蛋白在注射部位成功表达。【结论】Hin1在供试科植物中均存在,其中SlHin1定位在细胞膜,过表达该基因可抑制病毒扩散,推测其可能参与茄科植物对烟草花叶病毒的抗性反应,使植株获得抗性。     

植物病原菌拮抗性野生艾蒿内生菌的分离、筛选和鉴定

从野生艾蒿的根茎叶部位分离出内生细菌共68株,以棉花枯萎病、稻瘟病、烟草赤星为供试病原菌,采用对峙法对内生菌分别进行抑菌试验,对筛选出的菌株进行了16S rDNA序列测定和系统发育分析.结果表明:从野生艾蒿分离到的内生菌经初筛、复筛,获得抑制病原菌效果最明显的3株菌,结合生理生化特性、菌落特征、细胞形态特征和16S rDNA测序分析结果,菌株L8、Sll和R6分别鉴定为Bacillus subtilis,Bacillus cereus,Paenibacillus polymyxa.拮抗实验表明,棉花枯萎病原菌菌丝发生弯曲、打结,烟草赤星的受作用菌丝生长端分枝明显增多,生长端边缘呈珊瑚状分枝,并且出现明显的畸形和萎缩现象.分析表明,可能是由于在培养过程中内生菌产生了化感物质,对病原菌的菌丝产生抑制作用的结果.     

玉米大斑病菌MAPK基因St IME2的基因组定位、蛋白质结构预测及表达分析

【目的】确定玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)MAPK基因St IME2在基因组中的位置;系统解析目的蛋白质St Ime2的结构特征;分析玉米大斑病菌St IME2在不同发育时期及不同胁迫条件下(温度、氧胁迫、高渗胁迫)的表达,为深入研究该基因的功能奠定基础。【方法】通过本地Blast搜索玉米大斑病菌基因组数据库,确定St IME2在基因组的精确位置;利用Prot Param在线分析St Ime2蛋白的理化性质,利用SOMPA在线软件预测St Ime2蛋白的二级结构。通过PHYRE2在线服务器对St Ime2蛋白的三维结构进行预测。利用半定量RT-PCR方法分析不同发育时期及不同胁迫条件下St IME2的表达。【结果】玉米大斑病菌St IME2为一类与酿酒酵母中Sc IME2具有较高同源性的基因,为在植物病原真菌中鲜有报道的MAPK基因。该基因的ID为98 105,位于scaffold_7正链的1 560 184—1 562 574位置,St Ime2蛋白具有MAPK类蛋白激酶的特征性保守结构域,其二级结构主要以α-螺旋和无规则卷曲为主,β-折叠较少且主要存在于N端,其三级结构具有1个较小的N端域和1个较大的C端域;该基因在病菌分生孢子时期表达量最高,附着胞发育时期表达量最低。将病菌置于不同温度条件下处理,发现培养温度为28℃时St IME2表达量达到最高。在高渗胁迫条件下,随Na Cl浓度的增加,St IME2的表达量逐渐增加,但在较高胁迫条件下(0.8 mol·L-1 Na Cl),该基因表达几乎被完全抑制。经H2O2胁迫处理后,St IME2的表达量随H2O2的浓度增加而增强,在10 mmol·L-1 H2O2的处理下表达量最高。【结论】玉米大斑病菌St IME2位于scaffold_7正链的1 560 184—1 562 574位置。St Ime2蛋白具有MAPK激酶的所有特征性保守结构域,为一类功能鲜有报道的MAPK蛋白激酶。该基因在玉米大斑病菌分生孢子时期表达量最高,推测可能在调控病菌分生孢子发育过程中起重要作用。该基因的表达水平可随培养温度的变化而变化,28℃表达量最高。该基因可能参与病菌的高渗胁迫及氧胁迫反应。     

千岛湖细鳞鲴与黄尾鲴年龄、生长和繁殖的比较研究

2010年9月至2012年8月在千岛湖采集了709尾细鳞鲴及295尾黄尾鲴,对这两个相近种进行年龄、生长及繁殖的研究,旨在了解千岛湖细鳞鲴与黄尾鲴种群的生长规律。结果表明:细鳞鲴与黄尾鲴所获样本的年龄范围为1~5龄,优势年龄均为2~3龄,分别占整个样本的84%和76%;其中细鳞鲴体长与体重的生长关系式为W=0.0223L2.8785(R2=0.9439);Von Bertalanffy体长、体重生长方程分别为L t=38.82×[1-e-0.2450(t+1.2636)]、W t=836.21×[1-e-0.2450(t+1.2636)]2.8785,拐点年龄为3.05龄,对应体长为25.33 cm,体重244.78 g;雌雄比例为0.9568∶1,其个体绝对繁殖力为24 893~132 521粒,平均71 283粒。黄尾鲴体长与体重的生长关系式为W=0.0381L2.7172(R2=0.9439),Von Bertalanffy体长、体重生长方程分别为L t=41.99×[1-e-0.2264(t+0.9746)]、W t=980.22×[1-e-0.2264(t+0.9746)]2.7172,拐点年龄为3.45龄,对应体长为26.54 cm,体重281.88 g;雌雄比例为1.4513∶1,其个体绝对繁殖力为39 813~228 541粒,平均109 141粒。