中国杏自交不亲和花粉特异SFB基因的鉴定与序列分析

利用花粉SFB基因的同源扩增结合内切酶酶切的方法,在9个中国杏品种中首次克隆了6个花粉SFB基因,对应花柱S-RNase基因序号将其分别命名为Par-SFB8、Par-SFB9、Par-SFB11、Par-SFB17、Par-SFB23和Par-SFB26,在GenBank上的登录号分别为EU652883、EU935588、EU652884、EU652885、EU652886和EU652887。序列分析表明杏的花粉SFB基因具有蔷薇科李属植物SFB基因的典型结构特征;其内含子位于5′端非翻译区,长度90 ~ 108 bp,核苷酸序列的同源性为63.9% ~ 93.3%。氨基酸序列的同源性比较表明,杏花粉SFB基因的种内同源性为73.7% ~ 85.3%;与李属其他植物花粉SFB基因的种间同源性为75.2% ~ 97.7%。利用特异PCR扩增进一步确定了杏的S9、S11、S17和S26单元型花柱S-RNase与花粉SFB基因间距离,表明花柱S-RNase与花粉SFB基因紧密连锁;同时组织特异性表达分析确定SFB基因在花粉组织中特异表达。以上结果说明获得的SFB基因为杏的花粉候选S基因。     

梨20个品种S基因型的鉴定及新S-RNases基因克隆

 为了鉴定我国梨品种和一些野生类型个体的S基因型,应用S-RNase特异PCR扩增、克隆和测序,对其S-RNases基因核苷酸序列进行分析,鉴定了20个梨品种和野生类型个体的S基因型。起源于我国的'奥连'(S_pS₃₂)、'吊蛋'(S_dS_e)、'沙疙瘩'（S₃₆S_d）品种和杏叶梨的一个类型（S₂₂S_c）个体中存在西洋梨的S-RNase基因,证明S-RNase基因分化是在东方梨种群和西方梨种群的各个种形成之前。在秋子梨的'麦梨'、'内蒙古山梨'中发现了2个新S-RNases基因,命名为S₄₀-、S₄₁-RNase（DQ903313、DQ988687）。S₄₀-和S₄₁-RNase基因推导的部分氨基酸序列分别与苹果属S₁₁-和S₆-RNase的同源性为100%和94.4%,这表明S-RNase的存在可能在梨属和苹果属形成之前。     

欧李自交不亲和S-RNase基因型鉴定及序列分析

以欧李4个品种为试验材料,采用同源克隆的试验方法,克隆S-RNase基因并分析其序列特征,确定不同品种基因型,以期为欧李杂交育种亲本选择提供参考依据。结果表明:克隆鉴定得到5个新的S-RNase基因,编码氨基酸168～172个,相对分子质量为19.87～20.34 kDa,等电点(PI)为9.60～9.73,以丝氨酸磷酸化为主;二级结构主要以α-螺旋和不规则卷曲为主;同源性比对和结构分析表明,5个新的S-RNase均属于RNase T2基因家族,推导的氨基酸序列包含5个保守区(C1、C2、C3、RC4和C5)和1个高变区(HV),具有与李属、梨属、苹果属S-RNase相似的保守结构;进化分析显示欧李S-RNase与李属果树S-RNase聚类在一起,亲缘关系较近。     

新疆野生樱桃李S-RNase基因分离与鉴定的初步研究

 从4对已报道的李属树种S-RNase基因引物组合中筛选出扩增效果较好的PruC2和PruC4R组合,首次对新疆野生樱桃李（Prunus cerasifera Ehrh.）的45个株系的基因组DNA进行S-RNase基因特异性PCR扩增,并对其PCR产物进行克隆测序。这些核酸序列及其相应的氨基酸序列在GenBank中进行比对, 皆与李属的S-RNase基因有最大同源性,为新疆野生樱桃李的4种S-RNase基因,分别命名为S₁ （511 bp）,S₂ （787 bp）,S₃ （1859 bp）和S₄ （464 bp）,在GenBank的登录号分别为EF638726、EF641276、EF661873和EF661874。45个株系中,43个株系的S基因型分别为S₁S₂、S₁S₃、S₂S₃、S₂S₄和S₃S₄,而10号和15号株系分别只鉴定了一种S-RNase基因,其S基因型组成有待于进一步研究。     

中国樱桃泰山干樱S-RNase基因的克隆及序列分析

以中国樱桃品种泰山干樱为试材,利用李属植物C2、C5保守区引物,扩增花柱S-RNase基因,获得4个S等位基因,测序结果表明序列大小分别为:1608、950、796、504bp。根据同源比较发现大小为796bp的等位基因与基因库中登录的S1-RNase为同一基因,其它3个S-RNase基因为首次报道,依序列大小分别命名为S2(1608bp,登陆号EF541168)、S4(950bp,登陆号EF541173)和S6(504bp,登陆号EF541172)。序列分析表明S2-RNase在C3区存在终止密码子,导致翻译提早终止;S4-RNase的C5区前有插入片断;S6-RNase在高变区比其它S等位基因少一个氨基酸残基。氨基酸序列同源性比较分析表明,中国樱桃S-RNase与樱花、扁桃的相似性高。在系统进化树中中国樱桃的4个S-RNase基因的氨基酸序列和樱花、扁桃、甜樱桃、酸樱桃等一起归于李亚科。     

20个中国李品种自交不亲和S-RNase基因型的鉴定

利用蔷薇科S-RNase通用引物Pru-C2/PruCE-R以及12对特异性引物,对贵州省栽培的20个中国李(Prunus salicina Lindl.)品种叶片DNA进行PCR扩增,鉴定其S基因型。结果表明：采用S-RNase通用引物,仅11个李品种扩增出2个条带;采用12对S-RNase特异性引物,既扩增出与通用引物一样的结果,又鉴定出2个品种的S基因型。共鉴定了13个中国李品种完整的S基因型：红心李S_hS₁₀,姜黄李S₁₀S₂₀,南方李S_iS₉,柰李S_hS_f,槜李S_hS₇,幸运S_bS_c,芙蓉李S_bS_i,大红袍S_dS₂₀,前卫红S_eS_h,玫瑰皇后、澳得罗达、黑宝石和秋姬李S_b     

潍坊萝卜中芜菁花叶病毒分离物的分子特性及CP基因的表达

 从表现红心病的潍坊萝卜块根上得到一芜菁花叶病毒( Turnip m osaic virus, TuMV) 分离物(TuMV-Ra) , 通过RT-PCR获得了该分离物的外壳蛋白(CP) 基因, 对其进行了序列测定, 并将其核苷酸序列及推导出的氨基酸序列与GenBank中登录的其它20个TuMV萝卜分离物的相应序列进行比较和分析。结果表明, TuMV-Ra与这20个分离物CP基因核苷酸序列的同源性为89.9% ～99.0% , CP氨基酸序列同源性为94.8%～99.7%; 其中与中国浙江杭州萝卜的两个分离物HZLB1、HZLB2同源性最高, 核苷酸序列的同源性为98.7%和99.0% , 氨基酸序列同源性为99.0%和99.7%。TuMV-Ra与1999年从表现相同症状的潍坊萝卜得到的分离物CHINA-WF CP基因核苷酸同源性为93.66% , 氨基酸同源性为96.53% , 说明病毒发生了比较大的变异, 而且变异的位点主要在CP的N末端。将TuMV-Ra CP基因克隆到原核表达载体pET-22b ( + ) , 在大肠杆菌BL21 (DE3) 中表达出分子量为38 kD的融合蛋白。Western blotting分析证明TuMV-Ra CP在大肠杆菌中得到了正确表达。     

8个中国梨品种S基因型的分子鉴定

为鉴定8个中国梨品种的S基因型,使用梨自交不亲和基因(S-RNase)特异引物"FTQQYQ"和"anti-ⅡWP-NV",对8个梨品种的基因组DNA进行特异扩增,并对扩增片段进行回收、克隆、测序。使用生物信息学软件对各序列分析和经同源性搜索分析后,确定了各品种的S基因型。结果分别是:兰州花长把为S19S22,青面为S1S18,黄面为S1S12,早蜜为S19S29,大面黄为S1S19,无子黄为S28S16,大青皮为S34S19及金锤子为S16S19。     

枇杷属植物3个新S基因鉴定及大渡河枇杷分类地位的新证据

【目的】鉴定枇杷属普通枇杷野生种、栎叶枇杷和大渡河枇杷3个种的S-RNase基因型,为利用其优良性状开展种质创新,以及大渡河枇杷分类地位的探讨提供科学依据。【方法】以苹果S-RNase基因高度保守区设计兼并引物对3个种的基因组DNA进行PCR扩增,片段回收、克隆及测序,分别采用BLASTn、BLASTx、DNAMAN和CLUSTALW软件进行同源性检索、序列比对和结构分析。【结果】从参试的3个种中共分离了4个S等位基因,分别为S2-RNase、S26-RNase、S32-RNase和S34-RNase,其中S26-RNase、S32-RNase和S34-RNase为新分离的枇杷S-RNase基因,GenBank登录号分别为:MG765271、MG846012和MG812504。所克隆获得的4个枇杷S-RNase基因与苹果S-RNase基因的氨基酸序列结构相同,具有5个保守区(C1、C2、C3、RC4和C5)和1个高变区(HV)。此外,所获得的4个枇杷S-RNase基因电泳图谱及同源性和进化分析结果表明,大渡河枇杷可能为普通枇杷和栎叶枇杷的杂交后代。【结论】确定了普通枇杷野生种、栎叶枇杷和大渡河枇杷的S-RNase基因型分别为S2S26、S32S34和S26S32。大渡河枇杷S-RNase基因型及S-RNase的同源性和系统进化分析结果支持其可能为普通枇杷和栎叶枇杷杂交后代的结论。     

李属坏死环斑病毒(PNRSV)新疆巴旦木分离物外壳蛋白基因(CP)片断的克隆与序列分析

【目的】为了查明新疆巴旦木果树病原病毒的种类,为病毒的分子检测提供基础。【方法】采用双抗体夹心酶联免疫吸附法(DAS-ELISA),从巴旦木果树叶片中检测到李属坏死环斑病毒(PNRSV)。以阳性样品的总RNA为模板进行PNRSV外壳蛋白基因(CP)RT-PCR扩增,对预期430 bp大小的4个扩增产物进行克隆、测序和序列分析。【结果】结果表明,PNRSV新疆巴旦木分离物CP基因的核苷酸和氨基酸序列与世界各地已报道的分离物具有较高的同源性,分别为80.0%～97.2%和80.1%～94.1%,其中与阿根廷分离物AY217的同源性最高;而与同属03亚组的苹果花叶病毒(ApMV)同源性较低,仅为52.9%～55.4%和45.6%～48.6%。新疆PNRSV各分离物之间CP基因高度同源。序列比对与系统发生树的分析显示,PNRSV新疆巴旦木分离物的株系属于GroupⅠ组。【结论】确定了PNRSV为侵染新疆巴旦木果树的病原病毒。这是PNRSV在新疆发现的首次报道。     

扁桃自交不亲和基因的多态性分析

 根据蔷薇科树种S基因的保守序列设计引物, 利用PCR技术对8个新疆扁桃品种S基因进行扩增, 获得了10个大小不同的S基因片段。测序结果表明, 这些DNA片段的核苷酸序列中都具有编码蔷薇科S-RNAase 5个高度保守区域: C1、C2、C3、RC4、C5的序列、编码高变区(RHV) 的序列以及变异度很大的内含子序列, 并且其高变区和内含子序列具有扁桃S基因特异性。同源性分析表明, 获得的10个氨基酸序列与蔷薇科中李亚科S2RNase的氨基酸序列同源性达67% ～96% , 扁桃与樱桃、杏应同属于李亚科。     

京白梨等品种S 基因型鉴定及新基因S28 和S30 的核苷酸序列分析

 根据梨S基因高度保守区C1和C3区, 设计1对引物P1和P2, 对梨品种的基因组DNA进行S基因特异扩增、克隆、测序, 并在GenBank中BLAST比较, 确定S 基因特异性片段, 对京白梨等6个供试自交不亲和品种的S基因型比对结果为: 白梨中的‘库尔勒香梨’为S₂₁ S₂₈ , ‘苹果梨’为S₁₇S₁₉ ; 砂梨中的‘台湾蜜梨’为S₁₁ S₂₂ ; 西洋梨中的‘葫芦梨’为S_a S_b; 秋子梨中的‘京白’为S₁₆ S₃₀ , ‘早梨18’为S₄ S₂₈。其中S₂₈和S₃₀为首次登录的新S 基因, 在GenBank的登录号分别为AY562394 (库尔勒香梨) 和AY876945 (京白) 。     

白梨新S基因的克隆

 采用PCR - RFLP检测、DNA序列分析和田间杂交试验, 从白梨中分离鉴定了1个新的S-RNase基因。该S-RNase基因PCR扩增产物大小与S-RNase基因PCR产物相似, 为450 bp左右。但PCR -RFLP和DNA序列分析均表明, 它与S₈-RNase基因存在较大差异, 该基因内含子为252 bp, 而S₈-RNase的内含子为234 bp, 并在高变区中具有10个氨基酸出现替换, 有两个氨基酸出现缺失。而该S-RNase基因却与S₁₂-RNase基因具有较高的相似性, 在HV区中只有1处碱基被替换, 周边区中有10处出现碱基替换或缺失。因此, 继梨S18-RNase基因, 将它命名为S₁₉-RNase基因(AY250987) 。与S 基因型已确定的梨品种的杂交坐果率也说明了该基因是一个新的S-RNase基因。     

梨自交不亲和新基因S35-RNase的克隆与表达分析

  通过RACE技术, 从早酥梨花柱中分离到一个长度为681 bp的自交不亲和基因, DNA序列分析表明, 其开放读码框由227个氨基酸组成, 具有S2RN ase基因特有的保守组氨酸和半胱氨酸残基、高变区和保守区等特征序列, 与己登录的S₄-RNase基因DNA序列同源性最高, 达94% , 登录为一个新基因:S₃₅-RNase, GenBank接收号为DQ224344。通过Northern杂交, 发现该基因只在花柱中特异性表达, 并且在大铃铛期的表达量比花前和花后3 d的表达量都高。     

扁桃SLF基因和S-RNase基因的克隆及表达分析

 以扁桃‘Pioneer’品种为材料, 利用RT-PCR及RACE技术, 克隆了1个新的SLF ( S LocusF-box ) 基因(PdSLF1) 和两个新的S-RNase基因( PdSm 和PdSn) 的cDNA。PdSLF1全长1 331 bp, 编码376个氨基酸; PdSm 全长826 bp, 编码228个氨基酸; PdSn基因全长878 bp, 编码227个氨基酸。与公共数据库中的序列进行相似性比较, 发现这3个基因所编码的氨基酸序列与其它蔷薇科植物相应基因的氨基酸序列均具有较高的一致性, PdSLF1为70.2% ～84.8% , S-RNase为59% ～83.9%。PdSLF1基因在花药中专一性表达, 而PdSm 和PdSn基因在雌蕊中专一性表达。