葡萄炭疽病菌T-DNA插入突变体的表型及致病性变异分析

胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)引起的葡萄炭疽病是葡萄生产中的一种重要病害。本研究对从2100个T-DNA插入突变体库中挑选的11株PDA培养特征变异较大的突变体进行表型和致病性分析,旨在为葡萄炭疽病菌产孢与致病基因网络调控研究奠定基础。结果表明：突变体M112、M247、M1288、M1325、M1386和M1430不能产生分生孢子,其余的5株突变体产孢量降低;突变体M247、M1288和M1325丧失了致病性;突变体M112、C1094、M1386和M2013突变体致病力增强。此外,突变体C1094孢子萌发率明显降低,其余4株产孢突变体的孢子萌发率与野生型菌株WS15无明显差异。     

柱花草SgPAL3基因启动子的克隆及上游转录因子的筛选

柱花草(Stylosanthes spp.)是热带地区广泛种植的重要草种,炭疽病是危害柱花草的严重病害,柱花草SgPAL3基因具有抗炭疽菌的功能。本研究对启动子区域-2 000～0 bp,-1 500～0 bp序列分别构建诱饵载体并检测自激活,结果表明500 ng·mL^-1金担子素(Aureobasidin A,AbA)可以抑制两种诱饵载体的自激活。利用Gateway技术构建了柱花草响应炭疽菌的酵母cDNA文库,其容量为1.20×10⁷,插入片段主要分布在750～2 000 bp,重组率为100%;利用酵母单杂交技术,筛选与SgPAL3基因启动子互作的转录因子,并验证了3个转录因子(SgASIL2,SgHAT5和SgZHD8)与SgPAL3启动子的互作关系;qRT-PCR分析表明,SgASIL2,SgHAT5和SgZHD8均响应炭疽菌的侵染,说明它们可能调控柱花草对炭疽病的抗性。本研究为进一步解析SgPAL3响应炭疽菌侵染的转录调控机制奠定了基础。     

紫花苜蓿尖孢镰刀菌ATMT遗传转化体系的建立

为研究紫花苜蓿尖孢镰刀菌致病的分子机理,将带有潮霉素抗性标记和绿色荧光蛋白报告基因的双元载体,采用根癌农杆菌转化法(ATMT法)转入紫花苜蓿尖孢镰刀菌Ms210分生孢子中,共获得137株阳性转化子。随机挑选15株阳性转化子研究其菌落形态、菌丝生长速率、产孢量、粗毒素分泌量和致病力,结果表明15株转化子中有3株的生长速率比对照显著降低(P<0.05),其中转化子Ms210-04生长速率降低最显著,仅为11.08 mm/d,其余转化子与野生型菌株Ms210差异不显著;15株转化子中有3株的产孢量显著低于菌株Ms210,其中转化子Ms210-14产孢量最低,为7.05×10⁶个/mL,其余转化子与野生型菌株Ms210差异不显著;15株转化子中仅有2株的粗毒素分泌量与菌株Ms210无显著差异,有1株(1.41 mg/mL)显著升高,其余均较菌株Ms210显著降低,转化子Ms210-01粗毒素分泌量最低,仅为0.81 mg/mL;15株转化子中只有4株转化子的致病力较菌株Ms210显著降低,其余均与菌株Ms210无显著差异;说明转化子的生长速率、产孢量、粗毒素分泌量和...     

产单核细胞李氏杆菌突变株的感染动力学研究

以BALB/c小鼠为实验动物模型,对actA基因和plcB基因双缺失的产单核细胞李氏杆菌（LM）yzuLM1-2菌株进行感染动力学研究。分别用减毒突变株yzuLM1-2和野生型菌株yzuLM4给BALB/c小鼠静脉注射或灌服,并对脏器中LM的分布动态进行测定。结果显示,在显著高于野生型菌株感染剂量的条件下注射或灌服接种后,减毒突变株组小鼠肝和脾中的LM数量迅速下降,被清除的速度显著快于野生型菌株组。溶血素（LLO）抗体的测定结果显示,减毒突变株菌能和野生型菌同样激发较高水平的抗体。小鼠免疫保护试验结果显示,减毒突变株免疫组对同种血清型LM的攻击具有较好的免疫保护力,可达100%。结果表明,yzuLM1-2突变株侵袭力下降,致病力降低,能激发较高水平的抗体产生,可以作为预防动物李氏杆菌病的候选疫苗菌株,并为用作运送外源保护性抗原的载体提供了材料。     

8个小麦条锈菌生理小种产孢相关基因PsCon1克隆及表达分析

为研究基因Pscon1在不同小种中核苷酸序列及相对表达量差异,以小麦条锈菌(Puccinia strii formis f.sp.tritici)基因组DNA为模板,在小麦条锈菌8个生理小种中分别克隆产孢相关基因Pscon1,并对其核苷酸和氨基酸序列进行比对及相对表达量分析.结果表明:在8个小种中分别克隆到条锈菌产孢相关基因Pscon1,基因大小为531 bp,由3个外显子和2个内含子构成,开放阅读框长252 bp,不同小种基因Pscon1核苷酸序列只在44,65,331,465,495和510 bp位点处发生突变,均未引起氨基酸序列变化,且不同生理小种Pscon1在接种‘铭贤169' 12 h后相对表达量有差异,水源11-3最高,最低的是Hybrid46-8.推测基因Pscon1在小麦条锈菌不同生理小种产孢过程中相对表达量有差异,这将为进一步研究产孢量差异因素提供参考.     

单增李斯特标准菌NrdD基因插入突变株的构建

利用同源重组的原理构建了单增李斯特氏菌NrdD基因插入突变株,从大肠杆菌基因组中分别扩增出NrdD基因上下游同源臂,与pKSV7质粒相连,构建成功重组突变载体pKSV7-D1D2,将其电转入单增李斯特菌后,用氯霉素抗性平板筛选得到NrdD基因插入突变株,并对突变菌株序列测定,证明回复突变株构建成功。该突变株可在严格无氧环境中生存,为进一步研究NrdD基因功能、单增李斯特的致病机制和疫苗载体的研发奠定了基础。     

甘肃省嘉峪关市洋葱鳞茎软腐病病原鉴定

结合形态学与分子生物学特征对甘肃省嘉峪关市洋葱鳞茎软腐病病原种类进行了鉴定,在KB培养基上对两株典型菌株的菌落形态和培养特征进行了观察和描述,16S rDNA序列测定和同源性比对结果表明两菌株的16S rDNA序列分别与GenBank数据库已知胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种和格氏沙雷氏菌的序列同源性均达99%,其片段大小分别为1 386 bp和1 379 bp。致病性测定结果表明,2种菌均能引起洋葱鳞茎软腐病,且洋葱基部的发病程度高于顶部,其中胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种的致病力强于格氏沙雷氏菌。按柯赫氏法则初步确定甘肃省嘉峪关市洋葱鳞茎软腐病病原种类为胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种和格氏沙雷氏菌2种,由格氏沙雷氏菌引起的洋葱鳞茎软腐病属首次报道。本研究将为洋葱软腐病的防治提供理论依据。     

猪GnRH受体基因多态性分析及相关基因组织表达谱的构建

促性腺激素释放激素(GnRH)受体基因与猪的繁殖性状密切相关,本试验对不同猪种的GnRH受体基因的编码区进行了SSCP分析,未发现多态性。在GnRH受体基因5′侧翼序列上设计引物扩增了该基因大约2000 bp的侧翼序列,通过比对设计引物,对其中的一段含有GAGABox的插入突变序列和一段由于点突变而形成转录调控蛋白结合序列IRF-1的区域运用SSCP的方法进行了多态性分析。结果表明在插入突变处,基因频率在不同的猪种间存在着很大的差异性,其中民猪与其他猪种的差异性最大。IRF突变只存在于民猪中,并且只存在AA型和AB型。构建了3头大白猪母猪GnRH基因、GnRH受体基因、卵泡抑素(FST)基因、促卵泡素(FSH)基因、FSH受体基因、促黄体素(LH)基因、抑制素(inhibin)β(a)基因、inhibinβ(b)基因的组织表达谱,根据表达谱可以推测在下丘脑-脑垂体-性腺轴外不存在这些基因表达产物的相互作用系统。     

禽多杀性巴氏杆菌C48-3株hexABC基因缺失株的构建及其生物学特性分析

为研究荚膜在禽多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)致病过程中的作用,本研究利用同源重组基因敲除技术构建禽P.multocida C48-3株荚膜多糖输出蛋白基因hexABC的缺失突变株,并以小鼠为动物模型检测荚膜缺陷对细菌毒力的影响。PCR、RT-PCR和DNA测序结果均表明253 bp的hexC基因下游序列、798 bp的hexB基因全序列和290 bp的hexA基因上游序列完全被四环素抗性基因替代,表明构建了基因敲除突变株C48-3ΔhexABC。电镜观察结果表明突变株荚膜合成能力缺失,对小鼠的致病性试验结果显示突变株毒力基本丧失。本研究获得的无荚膜突变株为进一步研究禽P.multocida的致病机理奠定基础。     

沙打旺黄矮根腐病菌钙调素基因的克隆

沙打旺埃里砖格孢(Embellisia astragali)引起的黄矮根腐病是造成沙打旺(Astragalus adsurgens)草地退化最严重的病害之一。钙调素是Ca2+介导的信号通路中重要的分子。本研究旨在从沙打旺埃里砖格孢中克隆钙调素编码基因序列。以基因组DNA为模板,采用简并引物CAL-228F和CAL-737R扩增得539bp的同源片段;采用Hi-TAIL PCR分别获得344bp的5′侧翼序列和729bp的3′侧翼序列,拼接获得基因的1 290bp的全长DNA序列;利用全长引物CaMF和CaMR,得到840bp的DNA全长序列和450bp的cDNA全长序列,DNA全长序列中有4个内含子,均具有典型的AT-AG特征,cDNA全长序列翻译出149氨基酸多肽。     

猪霍乱沙门菌抗噬菌体菌株筛选及受体基因突变位点分析

【目的】筛选抗噬菌体菌株并分析其受体基因突变位点,为解析猪霍乱沙门菌噬菌体抗性突变的产生机制提供理论依据。【方法】以猪霍乱沙门菌CICC 21501及其裂解性噬菌体vB＿SenS＿S528(噬菌体S528)为研究对象,通过波动实验筛选自发突变的抗噬菌体菌株,观察菌落形态,并测定其对噬菌体的敏感性、吸附特性、生长曲线及对温度和pH的敏感性。通过全基因组重测序结合PCR验证定位耐受基因突变位点。【结果】成功筛选出1株抗噬菌体S528的突变菌株,命名为B6-2。B6-2菌落边缘粗糙,与野生菌相比,生长曲线无显著差异,对pH表现出敏感性,在40、50℃时表现出温度耐受性。噬菌体S528对抗噬菌体菌株B6-2的吸附率减少60%(对野生菌吸附率为93%)。通过全基因组重测序及比对分析得知,B6-2菌株有3个位点发生了突变,分别为PROKKA＿04510基因中2个位点和rfbC基因中的1个位点发生突变。突变基因片段的PCR产物电泳及测序结果均表明,PROKKA＿04510基因上的2个位点并未发生突变,而真正发生突变的位点位于rfbC基因的350 bp处,碱基由C突变为T。【结论】筛选到1株与受体改变...     

鸡传染性支气管炎病毒KIBVXJ株S1基因的克隆及序列分析

根据已发表的鸡传染性支气管炎病毒S1基因,设计并合成了一对引物,经RT-PCR扩增后获得全长约为1700bp的核苷酸序列。序列分析表明,S1基因的最大开放阅读框位于12位～1685位碱基之间,编码557个氨基酸;KIBVXJ株S1基因序列在19位～292位点的氨基酸区域内有较多的氨基酸置换、插入和与缺失现象;S1的裂解位点的序列为HRRRR,具有我国地方流行株的特征。KIBVXJ株的S1基因与国内外疫苗株的同源性分析表明,核苷酸同源率为73.8%～74.2%,氨基酸同源率为74.9%～76.0%。遗传进化分析表明,KIBVXJ株与国内外的主要疫苗株亲缘关系最远,与国内近年来分离的A2株、LX4株和QXIBV株的亲缘关系最近。     

An avian pathogenic Escherichia coli strain produces a hemolysin, the expression of which is dependent on cyclic AMP receptor protein gene function

An avian pathogenic Escherichia coli strain M1000 showed a clear zone of erythrocyte lysis on sheep blood agar plates. The hemolytic activity was not detected in the culture supernatant nor was any DNA sequence homologous to the E. coli -hemolysin gene detected in the chromosome or plasmid DNA of the strain, indicating that the observed hemolysis was different from -type. To identify the genetic determinant responsible for the hemolysis, we performed random Tn5 insertional mutagenesis and obtained one mutant, named M5005, that totally lacked the hemolytic activity. Cloning and nucleotide sequencing of the region flanking the transposon insertion site in the M5005 chromosome revealed that the transposon was inserted within an open reading frame of the cyclic AMP receptor protein (CRP) gene, which is involved in one of the global regulatory networks of gene expression in E. coli. Nucleotide sequence analysis of the intact crp gene of the strain M1000 showed that the CRP protein of M1000 is 99% identical to that of K-12. Introduction of the intact crp gene on a low copy plasmid into the mutant M5005 restored the hemolytic phenotype, confirming that the mutation site in M5005 was in the crp gene. CRP plays a central role in catabolite repression, the phenomenon by which the synthesis of many enzymes required to metabolize various sugars is repressed in the presence of glucose. When the hemolytic activity of E. coli M1000 grown in the presence of glucose was examined, the hemolysis was totally impaired. These results indicate that the avian pathogenic E. coli strain M1000 produces a hemolysin the expression of which is dependent on crp gene function.     

猪源肠球菌中氟苯尼考耐药性调查及fexA基因环境研究

本研究旨在调查猪场中肠球菌对氟苯尼考的耐药性,检测氟苯尼考耐药基因,并测定肠球菌中氟苯尼考耐药基因fexA的基因环境,从而分析其可能的传播机理。以四川某猪场分离鉴定的50株肠球菌为研究材料,开展分离株对氟苯尼考的药物敏感性试验。运用PCR技术检测分离株中氟苯尼考耐药基因cfr、fexB、fexA、floR和estDL136。运用热不对称性PCR（TAIL-PCR）技术获得fexA基因周围序列信息,分析其基因环境。运用反向PCR技术验证序列中环化结构的存在,同时运用交叉PCR技术检测20株猪源肠球菌fexA基因的基因环境。结果显示,在分离出的50株肠球菌中,有34株对氟苯尼考耐药（MIC ≥ 16 mg/L）,耐药率为68%。PCR结果显示,20株含有fexA基因,28株含有fexB基因,14株同时含有这两种基因。TAIL-PCR和测序结果显示,分离株DKC5中fexA基因存在于12 945 bp的Tn554转座子中。Tn554转座子可形成环化结构,其中的重复序列可形成含有2 395 bp的环化结构。本试验结果表明,猪源肠球菌对氟苯尼考耐药率较高,主要由fexA和fexB基因介导,fexA基因存在于Tn554结构中。预测fexA基因是经两次插入整合后进入DKC5分离株基因组序列的,这为fexA基因的水平传播提供了遗传依据。     

Use of polymerase chain reaction to identify Brucella abortus strain RB51 among Brucella field isolates from cattle in Italy

Brucella abortus strain RB51, a rough mutant of the B. abortus 2308 virulent strain, was recently approved in the United States as the official vaccine for brucellosis in cattle. Following recent evidence of unauthorized use of RB51 vaccine in Italy, where the use of vaccines for brucellosis is no longer allowed, the suitability of an RB51-specific polymerase chain reaction assay for identifying the RB51 strain among Brucella field isolates from cattle in Italy was investigated. The oligonucleotide primers used in this study, belonging to a six-primer cocktail for Brucella species previously described by other authors, allowed the amplification of a 364-base pair (bp) fragment specific for RB51 and its parent strain 2308, and a 498-bp product specific for B. abortus. In addition, unresolved bands ranging from 600 to 700 bp were observed from RB51 strain. Brucella abortus biovars 1, 2 and 4 have only one specific sensitive 498-bp band. The B. abortus biovars 3, 5 and 6 did not give any signal. The 498-bp product from a reference Brucella strain was sequenced and submitted to EMBL with the accession number AJ271969 while the 364-bp fragment from RB51 strain was submitted to EMBL database with accession number AJ271968. The sequence studies confirmed the specificity of the detected fragments. No amplification was obtained by testing DNA from strains antigenically related to Brucella, such as Yersinia enterocolitica O:9, Escherichia coli O:157, Salmonella urbana and Pasteurella multocida. The results of this study indicate that this technique, in combination with specific serological tests, could be a useful diagnostic method to verify the use of RB51 vaccine and can contribute to the creation of a databank of circulating strains.     

山羊MyoG基因启动子区序列分析与结构预测

为探明山羊MyoG基因的启动子序列与结构及转录调控机制,本研究设计了1对引物,采用PCR扩增、测序以及序列比对分析,从波尔山羊基因组中扩增出一段长度为969bp的山羊MyoG基因的5′侧翼序列,其GC含量为50.6%。经过生物信息学分析,确定了其转录起始位点及活性区域;发现在转录起始位点上游-24bp处存在1个TATA-box,另外还发现了1个GC-box、2个CAAT-box、2个E-box和1个富含A-T碱基的模体结构;该序列还包含HSF、ADR1和cap等转录因子结合位点。通过比对分析,所得山羊MyoG基因5′侧翼序列与牛、马鹿、人、小鼠和鸡同源序列的相似性在37.22%～96.85%之间,说明不同物种间该序列具有一定的保守性。本研究为进一步探讨山羊MyoG基因的表达和调控机制奠定了理论基础。     

猪轮状病毒GD株VP6基因的克隆及序列分析

参考GenBank中发表的PRV OSU毒株VP6基因核苷酸序列ORF两端保守区序列,设计1对特异引物,以PRV GD株反转录cDNA为模板,通过PCR方法扩增出长约1.4 kb的基因片段,并克隆到pMD18-T载体中进行序列测定。测序结果表明:VP6基因全长1320 bp,含有一个1194bp的开放阅读框,编码397个氨基酸。与国内外已知的11个毒株VP6基因的核苷酸及其推导的氨基酸序列比较,同源性分别为76.5%-95.6%和88.7%-99.2%;核苷酸系统发育进化树结果表明,GD毒株与轮状病毒JL94,CN86,OSU毒株亲缘关系较近,为一个进化群。     

蓝狐MITF-M基因序列扩增及生物信息学分析

试验旨在研究蓝狐MITF-M基因核心启动子活性区、转录因子结合位点、基因编码蛋白结构及功能,为探究该基因的表达调控机制提供理论依据。从成年蓝狐背部皮肤组织中采集1 cm×1 cm样品,采用RT-PCR扩增及测序技术首次获得MITF-M基因序列3 880 bp（包括5'侧翼区2 262 bp、CDS区1 260 bp、3'侧翼区358 bp）,编码419个氨基酸残基。生物信息学分析结果显示,蓝狐MITF-M基因5'侧翼区存在潜在的启动子区域（-86~-336 bp）,且发现TATA框、CAAT框、GC框和CRE等调控元件及CREB、LSF和Sp1等多种转录因子。MITF-M基因编码的蛋白是定位于细胞核和细胞质的不稳定、可溶性亲水蛋白质。亚细胞定位结果提示该蛋白在细胞核、细胞质和线粒体的概率较高,分别为65.2%、17.4%和8.7%。DNAMAN软件对MITF-M基因编码蛋白的二级结构预测发现,该蛋白由α螺旋（33.66%）、β折叠（16.66%）和无规卷曲（49.68%）组成,且不存在跨膜区域和信号肽。蓝狐与其他物种MITF-M基因编码的氨基酸序列同源性对比和系统进化树分析均提示蓝狐与犬的遗传亲缘关系最近,与哺乳动物和禽类均具有较高的同源性（>89.1%）,说明MITF-M基因编码区在物种进化过程中较为保守。本研究为深入研究MITF-M基因调控狐狸被毛颜色的分子遗传机制奠定了理论基础。     

猪流行性腹泻病毒CH/GX/2015/750A株的分离鉴定及全基因组序列分析

本研究旨在获得可在细胞培养中稳定、有效生长增殖的猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）分离毒株,并对其全基因组序列进行测定分析。应用Vero细胞从广西腹泻仔猪肠道内容物中进行病毒分离,通过细胞病变和RT-PCR对细胞培养物进行鉴定,应用下一代测序技术对分离毒株全基因组序列进行测定。结果显示,成功分离到1株PEDV,命名为CH/GX/2015/750A。该毒株可稳定有效地在Vero细胞生长增殖,并引起典型的细胞病变;已在Vero细胞连续传代25代,病毒滴度随着传代次数的增加逐渐提高并稳定在10^7.50TCID₅₀/mL。该毒株全基因组序列长28 038 bp;与22个参考毒株的全基因序列比对显示,核苷酸同源性为96.8%~99.8%,其中与YC2014株同源性最高,为99.8%。全基因组和S基因系统进化分析显示,PEDV CH/GX/2015/750A分离毒株属于Ⅱa亚群,与YC2014、PEDV-WS等变异毒株亲缘关系密切。结果表明,本研究分离获得的CH/GX/2015/750A毒株是PEDV地方流行变异毒株。     

两株鸡传染性支气管炎病毒的分离鉴定及S1基因序列分析

为调查广东地区鸡传染性支气管炎病毒(IBV)的流行及其遗传变异情况,本研究通过病料SPF鸡胚接种和鸡胚尿囊液的RT-PCR鉴定,于2013年从广东湛江地区不同发病鸡场分离到两株IBV,分别命名为CK/CH/GD/ZJ10/2013和CK/CH/GD/ZJ11/2013,并对这两株IBV的S1基因进行序列分析。结果显示,CK/CH/GD/ZJ10/2013株S1基因全长1 626 bp,编码542个氨基酸,其裂解位点为NRFRR,属于基因型Ⅲ,并推测其为基因型Ⅲ毒株(CK/CH/GX/NN11-3)与基因型Ⅰ毒株(GX-NN-6)在S1基因处发生重组而产生的新毒株;CK/CH/GD/ZJ11/2013株S1基因全长1620 bp,编码540个氨基酸,其裂解位点为HRRRR,属于基因型Ⅰ(类QX型);两株IBV的S1基因间核苷酸序列及其推导的氨基酸序列同源性较低,与位于同一基因型的参考毒株间同源性较高,而与中国使用的Mass型常规疫苗H120和H52之间的同源性最低,仅为75.7%~76.3%和77.1%~77.9%。本研究可为广东省IBV的流行病学调查和分子生物学研究提供参考。