非洲猪瘟病毒p54蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

p54蛋白是非洲猪瘟病毒(ASFV)进入宿主细胞的重要结构蛋白,参与病毒的早期感染,具有较强的免疫原性,常作为研制非洲猪瘟(ASF)疫苗和检测方法的重要靶点。为制备ASFV p54蛋白的单克隆抗体(MAb),本研究通过构建重组质粒p ET28a-p54并经原核表达重组p54蛋白(rp54),采用镍柱亲和层析方法对rp54纯化后经SDS-PAGE鉴定。结果显示,rp54主要在沉淀中出现17 ku的目的条带,经纯化效果较好。采用纯化的rp54免疫BALB/c小鼠,三免后采用间接ELISA方法测定小鼠血清的抗体效价。选择抗体效价最高的小鼠冲击免疫,3 d后取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,通过间接ELISA筛选稳定分泌p54蛋白MAb的杂交瘤细胞。结果显示,三免后小鼠血清抗体效价最高达1∶256 000,表明该蛋白的免疫原性很好。间接ELISA筛选结果显示,获得了3株稳定分泌p54蛋白MAb的杂交瘤细胞株。分别采用western blot、间接免疫荧光试验(IFA)检测该3株MAb的反应原性,采用间接ELISA检测3株MAb的特异性。Western blot结果显示,3株MAb均在...     

非洲猪瘟病毒p54蛋白的表达及单抗制备

为制备非洲猪瘟病毒p54蛋白的单克隆抗体,本研究扩增p54蛋白的胞外区编码基因,分别克隆到p ET30a和p GEX-6p-1中,构建了p54-p ET30a和p54-p GEX-6p-1重组质粒;将质粒分别转化到大肠杆菌BL21中,表达C末端带6个His、N端带有GST的p54重组蛋白;利用亲和层析的方法,富集和纯化带His标签的p54蛋白;以带His标签的p54蛋白为抗原,免疫BALB/C小鼠,制备单克隆抗体;以带有GST标签的p54蛋白为抗原,对制备的单抗进行特异性验证。结果显示:大肠杆菌能高效表达带His标签和GST标签的非洲猪瘟p54蛋白;His标签的p54蛋白免疫BALB/C小鼠后,得到了3株单克隆抗体;Western blot结果表明,3株单克隆抗体能与带有GST标签的p54蛋白相互反应。本研究成功制备了p54的单克隆抗体,为进一步开展非洲猪瘟ELISA、Western blot和细胞免疫荧光检测技术的开发研究奠定了基础。     

非洲猪瘟病毒结构蛋白p54的原核表达与反应原性鉴定

p54蛋白为非洲猪瘟病毒(ASFV)的主要结构蛋白之一,参与病毒对靶细胞的吸附与进入。为深入研究p54结构蛋白的抗原性,根据GenBank序列号(MK128995)对应的E183L基因序列,设计1对特异性引物扩增其整个CDS区,并克隆至pET-30a(+)载体,构建了表达p54蛋白的重组质粒pET-30a(+)-p54。用BL21(DE3)转化该质粒,经IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE电泳,可见重组质粒表达出1条分子量约为20 kDa的特异性条带,且重组表达蛋白以融合表达蛋白形式存在于上清。进一步通过His亲和层析法纯化目的蛋白,用ASFV阳性血清进行蛋白质免疫印迹反应,发现表达的重组p54蛋白能与ASFV阳性血清产生特异性反应,表明p54蛋白表达成功。本研究为ASFV抗体ELISA检测方法的建立奠定了基础。     

非洲猪瘟病毒p54蛋白单克隆抗体制备及其抗原表位鉴定

旨在制备非洲猪瘟病毒(ASFV)p54蛋白的特异性单克隆抗体。本研究利用大肠杆菌表达系统表达p54蛋白,免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0细胞进行细胞融合。利用纯化的p54蛋白作为包被抗原,采用间接ELISA方法筛选获得阳性杂交瘤细胞。经4次亚克隆后,取杂交瘤细胞上清进行单克隆抗体亚型鉴定,利用体内诱生法制备单克隆抗体并进行纯化。间接ELISA方法检测单克隆抗体的效价,利用交叉反应性试验、间接免疫荧光试验和蛋白印迹对所获单克隆抗体的特异性进行鉴定。根据预测的p54蛋白二级结构,采用逐步截短法分析鉴定单克隆抗体识别的抗原表位区域,并在p54的三级结构中进行标注。结果显示：成功筛选了6株分泌p54单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别命名为28G12-1、31G7-1、31G7-2、35F10-1、35F10-2、38D3-1。其中28G12-1、31G7-1、31G7-2重链为IgG2a型,35F10-1、35F10-2、38D3-1重链为IgG1型;轻链均为κ链。单克隆抗体的最低效价为1∶25 600,与猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪流行性腹泻病毒、猪细小病毒、猪急性腹泻综...     

非洲猪瘟病毒截短p54蛋白的原核表达与纯化

旨在高效表达可溶性的非洲猪瘟病毒(ASFV) p54蛋白。去除可能影响p54蛋白可溶性表达的前50个氨基酸(aa),根据GenBank收录的ASFV p54基因序列设计引物,从第51个aa对应的基因序列起用PCR扩增截短的p54基因,并用分子克隆方法插入到带有TF及His标签的冷休克表达载体pCold TF上,构建pCold TF-p54重组质粒。经菌液PCR及测序验证后将重组质粒转化到BL21感受态细胞中,IPTG诱导表达p54重组截短蛋白,对IPTG诱导浓度、诱导时间进行优化,并对纯化重组蛋白时所用洗脱液的咪唑浓度进行探索。Western blot鉴定p54重组截短蛋白的反应原性,并探究TF标签对于该蛋白反应原性的影响。结果表明,成功构建了pCold TF-p54重组质粒,经终浓度为1 mmol/L的IPTG于16℃诱导9 h时,p54重组截短蛋白的表达量最高,分子质量约为76 ku。经50 mmol/L咪唑洗脱液洗脱可得到较纯的p54重组截短蛋白,经人鼻病毒(Human rhinovirus, HRV)3C Protease切除TF及His标签后,再次纯化可得到无标签且高纯度的p...     

表达非洲猪瘟病毒p54蛋白重组伪狂犬病病毒的构建及鉴定

试验旨在构建能高效表达非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV） p54蛋白的重组伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus,PRV）。通过无缝克隆构建含有PRV TK基因同源臂和绿色荧光蛋白（GFP）报告基因的PRV通用转移载体pCAGIG-TK_（l+r）,参考China/2018/AnhuiXCGQ株基因序列,优化合成E183L基因,并连入通用转移载体,构建重组中间转移质粒pCAGIG-TK_（l+r）-p54;重组质粒ScaⅠ酶切线性化后经脂质体介导转染BHK-21细胞,6 h后感染0.1个感染复数（MOI） PRV变异株,出现病变后通过空斑挑选和PCR鉴定纯化重组PRV,进一步通过Western blotting和间接免疫荧光试验（IFA）检测外源蛋白表达,并对重组病毒的遗传稳定性和增殖特性进行研究。结果显示,转染重组质粒pCAGIG-TK_（l+r）-p54的BHK-21细胞24 h后可观察到绿色荧光,说明重组质粒成功转入BHK-21细胞;纯化后的重组病毒表达绿色荧光蛋白且含有ASFV E183L基因,Western blotting和IFA结果证实重组PRV在BHK-21细胞中能表达p54外源蛋白,在26 ku处呈现特异性条带,且能与ASFV阳性血清发生特异性反应,免疫原性较好;重组病毒在BHK-21细胞上连续传代20次均能检测到ASFV E183L基因,遗传稳定性较好;一步生长曲线显示,重组病毒与亲本病毒的增殖特性差异不大,且二者的最高病毒滴度分别为10^7.34/0.1 mL和10^7.61/0.1 mL,外源片段的插入不影响重组病毒在细胞上的增殖能力。本研究成功获得了表达ASFV p54蛋白的重组病毒rPRV-p54,为进一步研究p54蛋白的免疫原性及开发非洲猪瘟多基因重组PRV载体疫苗奠定了基础。     

非洲猪瘟病毒p54抗原蛋白卵黄抗体的制备及生物活性检测

为研究非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)p54抗原蛋白及其相应卵黄抗体的生物学特性,特制备ASFV p54蛋白及相应鸡卵黄抗体。可溶性表达制备高纯度ASFVp54抗原蛋白,并制定合理的免疫程序,免疫产蛋母鸡,定时采血并收集鸡蛋。卵黄液经粗提取后二次盐析,制备特异性卵黄抗体。酶联免疫吸附试验(ELISA)结果显示,在首次免疫后7d后的血清中即可检测出相应抗体,14d后在卵黄中提取到相应抗体,35d后IgY效价达到峰值。经SDS-PAGE检测,制备所得纯度达到90%,得率在8.8g/L以上。Western-blot检测结果显示,纯化的IgY具有高度的特异性。     

非洲猪瘟病毒衣壳蛋白p72结构与功能的研究进展

非洲猪瘟是家猪和野猪被非洲猪瘟病毒(African swine fevervirus, ASFV)感染,引起的高度传染性和致死性的动物疫病,是养殖业重点防控的动物疫病,目前无有效的疫苗和治疗药物。ASFV的结构蛋白p72是ASFV的主要衣壳蛋白和重要抗原蛋白,占病毒颗粒总重33%左右,参与ASFV的形态发生、多聚蛋白组装和病毒复制等生理生化过程。p72结构构象稳定,含多种识别表位,是ASFV疫苗和抗病毒药物分子的重要靶蛋白。探究p72在ASFV感染中的作用机理对于病毒致病机制分析、疫苗开发具有重要意义。本文对p72的结构和生理功能方面的研究进行了综述,对p72的应用研究进行分析和展望,以期为阐明ASFV的致病机理和药物及疫苗研发等提供重要参考和帮助。     

非洲猪瘟病毒p54蛋白在昆虫细胞中的表达及其免疫原性分析

非洲猪瘟病毒（ASFV）p54蛋白由晚期基因E183L编码,是主要的结构蛋白之一。为了获得免疫原性强的p54蛋白,本研究将E183L基因克隆至pFastBac1载体中,取1μg重组质粒转座DH10Bac感受态细菌,经三轮蓝白斑筛选后,获得重组Bacmid-p54。将提取的Bacmid-p54质粒DNA转染Sf9细胞,出现明显病变后,收获细胞培养上清,在正常Sf9细胞中传三代,获得的杆状病毒命名为rBac-P54。利用SDS-PAGE检测rBac-P54感染后昆虫细胞的蛋白表达情况,并通过间接免疫荧光（IFA）和Western-blot鉴定p54蛋白的免疫原性。结果显示,在感染的Sf9细胞中,p54蛋白能获得高效表达,并可被ASFV阳性血清特异性识别。这表明杆状病毒系统表达的p54蛋白具有良好的免疫原性,为后续开展非洲猪瘟血清学诊断和p54功能研究奠定基础。     

非洲猪瘟病毒p54蛋白单抗制备及B细胞线性抗原表位鉴定

以原核系统表达的非洲猪瘟病毒p54重组蛋白为免疫原接种BALB/c小鼠,经过细胞融合、间接ELISA筛选和多次亚克隆获得了3株能够稳定分泌抗p54蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞系,分别命名为2A4、5F6和RH15。3株单克隆抗体的重链均属于IgG1亚类,轻链均为Kappa型。Western blot和免疫荧光试验(IFA)证明3株单克隆抗体具有良好的反应性,可以用于靶抗原的特异性检测。通过噬菌体展示肽库筛选,确定了单克隆抗体2A4、5F6识别的抗原表位为¹⁵⁷NTASQ¹⁶¹,RH15识别的抗原表位为¹⁷⁰RQRNTYTHKDL¹⁸⁰,进一步完善了靶抗原的B细胞线性抗原表位信息。     

非洲猪瘟病毒结构蛋白p54的优化表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

为了实现非洲猪瘟病毒(Africanswinefevervirus,ASFV)p54基因在大肠杆菌中的高效表达,同时建立以ASFV-p54重组蛋白为抗原的间接ELISA抗体检测方法,本试验根据Gen Bank(序列号：NC＿044943.1)公布的ASFV p54的基因序列,设计一对特异性引物,扩增构建p GEX-6P-1-p54原核表达质粒,在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中进行复制,经IPTG诱导表达,对重组蛋白利用SDS-PAGE分析和免疫印迹鉴定正确后,进行表达条件优化,并纯化重组蛋白。随后用ASFV-p54重组蛋白为包被抗原,通过条件优化、特异性试验、敏感性试验和重复性试验,建立一种稳定的血清ASFV抗体检测方法。结果显示,ASFV p54基因成功克隆到p GEX-6P-1原核表达载体中,得到p GEX-6P-1-p54原核表达质粒;转化E. coli菌株BL21(DE3)中,经诱导表达得到重组蛋白,大小为46k Da;成功建立测定ASFV抗体的间接ELISA方法,优化后确定最佳包被浓度为1.2μg/mL,待检血清最佳稀释倍数1∶100,最佳封闭液为1%BSA,酶标抗体最佳稀...     

非洲猪瘟病毒p54蛋白单克隆抗体的制备及阻断ELISA方法的建立

旨在建立检测非洲猪瘟病毒(ASFV)血清抗体的阻断ELISA方法.采用原核表达的ASFVp54蛋白作为包被抗原,并制备了针对p54蛋白的单克隆抗体,采用方阵滴定法确定了阻断ELISA方法的最佳反应条件,并对建立的方法进行了敏感性、特异性、重复性和符合性评价.结果显示,抗原最佳包被浓度为2.0 μg·mL-1,抗原包被温...     

非洲猪瘟病毒结构蛋白p54的优化表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

为了实现非洲猪瘟病毒(Africanswinefevervirus,ASFV)p54基因在大肠杆菌中的高效表达,同时建立以ASFV-p54重组蛋白为抗原的间接ELISA抗体检测方法,本试验根据Gen Bank(序列号：NC＿044943.1)公布的ASFV p54的基因序列,设计一对特异性引物,扩增构建p GEX-6P-1-p54原核表达质粒,在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中进行复制,经IPTG诱导表达,对重组蛋白利用SDS-PAGE分析和免疫印迹鉴定正确后,进行表达条件优化,并纯化重组蛋白。随后用ASFV-p54重组蛋白为包被抗原,通过条件优化、特异性试验、敏感性试验和重复性试验,建立一种稳定的血清ASFV抗体检测方法。结果显示,ASFV p54基因成功克隆到p GEX-6P-1原核表达载体中,得到p GEX-6P-1-p54原核表达质粒;转化E. coli菌株BL21(DE3)中,经诱导表达得到重组蛋白,大小为46k Da;成功建立测定ASFV抗体的间接ELISA方法,优化后确定最佳包被浓度为1.2μg/mL,待检血清最佳稀释倍数1∶100,最佳封闭液为1%BSA,酶标抗体最佳稀...     

非洲猪瘟病毒主要蛋白研究概述

摘要：非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒引起的、在家猪和野猪之间传播的一种高热、高致死性的烈性传染病。由于ASFV的基因组结构庞大、免疫逃逸机制复杂,至今尚未研发出安全有效的疫苗,但是人们对ASFV的认识和研究却在近百年的防控历程中不断前进。本文对ASFV的研究进展进行综述,希望能为及时发现和防控疫情提供理论参考。     

非洲猪瘟病毒p30蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

为制备非洲猪瘟病毒(ASFV) p30蛋白的单克隆抗体,以原核表达的重组p30蛋白为免疫原免疫6～8周龄雌性BALB/c小鼠,3次免疫后分离小鼠脾细胞并将其与SP2/0细胞进行融合,通过间接ELISA方法筛选,获得2株能稳定分泌抗ASFV p30蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株.2株杂交瘤细胞从第10代开始均能稳定分泌抗体...     

猪肉产品中非洲猪瘟病毒(ASFV)的存活性

猪肉及其副产品可导致传染病的再次传播,其中ASFV的存在有很大的危险性。 当一些动物处在疾病的某一时期(如潜伏期,隐性带毒期和慢性期),也许会逃脱屠宰场的肉尸检验,这些动物的肉可能会作为商品出售,如果其残羹用来喂猪,则会造成疾病的传播。鉴于这种情况迫使我们去认识ASFV对热以及在不同猪组织产品中的     

非洲猪瘟病毒p11.5蛋白的表达及其单克隆抗体的制备

为了制备非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)p11.5蛋白的特异性单克隆抗体,利用大肠杆菌表达系统,将密码子优化后的ASFV p11.5基因序列连接表达载体pET28a-SUMO,构建pET28a-SUMO-p11.5原核表达质粒,获得了可溶性的ASFV p11.5蛋白。经Western blot鉴定,重组ASFV p11.5蛋白可被ASFV标准阳性血清特异性识别,表明其具有良好的反应原性。将纯化后的p11.5蛋白免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤细胞法,制备了4株可稳定分泌抗ASFV p11.5蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。3株单克隆抗体重链亚类为IgG1,1株重链亚类为IgG2a,轻链亚类均为κ。采用p11.5蛋白为包被抗原的间接ELISA方法检测单克隆抗体的效价均不低于1∶102.4×10~4。经间接免疫荧光试验(IFA)鉴定,4株单克隆抗体,均不与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型、猪流行性腹泻病毒发生交叉反应,但均能与ASFV反应,表明单克隆抗体具有良好的特异性和反应性。本试验为p11.5蛋白结构功能、免疫学特性及ASFV诊断试剂产品的研究提供了重要的生物材料。     

非洲猪瘟病毒p62蛋白单克隆抗体的制备及初步应用

为制备非洲猪瘟病毒(ASFV)p62蛋白的特异性单克隆抗体,并初步应用于感染组织样品中ASFV抗原的免疫组化(IHC)检测,本研究以杆状病毒表达的非洲猪瘟病毒重组p62蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合获得杂交瘤细胞。结果显示:基于纯化的p62蛋白建立的间接ELISA方法对杂交瘤细胞进行筛选和亚克隆,获得了18株可稳定分泌抗非洲猪瘟病毒p62蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。经IFA检测,制备的单克隆抗体均与非洲猪瘟病毒反应,且不与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型等猪源常见病毒反应,特异性良好。抗体识别蛋白的鉴定结果显示,3株MAbs识别p35蛋白,15株MAbs识别p15蛋白。14株MAbs重链亚类为IgG1型,4株MAbs重链亚类为IgG2a,轻链均为κ链。利用18株MAbs对ASFV感染猪的肺、扁桃体、淋巴结等组织进行IHC检测,结果显示5株MAbs均能够与感染ASFV的组织发生特异性的免疫反应。本研究获得的非洲猪瘟病毒p62蛋白单克隆抗体可为非洲猪瘟病毒免疫学检测方法的建立及p62蛋白的结构功能等基础研究提供重要的生物材料。