大型溞胆碱酯酶间接非竞争酶联免疫吸附定量分析法的建立

用达到电泳纯的大型溞(Daphniamagna)胆碱酯酶(cholinesterase,ChE)免疫BALB/c小鼠,得到效价达1∶8000的鼠抗大型溞ChE多克隆抗血清;通过优化抗原抗体反应条件,建立定量分析大型溞ChE含量的间接非竞争酶联免疫吸附法(indirectandnon‐competitiveenzyme‐linkedimmunosorbentassay).结果表明:此方法检测灵敏度为24ng爛mL-1;经免疫交叉反应鉴定,所获抗血清与5、10μg爛mL-1标准蛋白质和其他生物如花翅摇蚊、尖额溞、斑马鱼(脑、脑除外的整体)、家蚕、意大利蜜蜂、赤子爱胜蚯蚓、非洲爪蟾(蝌蚪)等来源的ChE交叉反应率分别为:<0畅25%、<0畅25%、 2畅13%、 10畅19%、3畅88%、 3畅56%、 2畅81%、 3畅93%、 5畅00%和2畅75%,具较高的特异性.说明用本试验得到的抗血清建立的间接非竞争酶联免疫吸附法可用于大型溞体内ChE含量的测定,以利于在农药暴露环境下大型溞体内ChE活性的精确检测.     

奶牛孕酮间接竞争ELISA检测方法的建立

[目的]为孕酮检测试剂盒的研制奠定基础。[方法]采用二环己基碳化二亚胺法制备检测抗原,建立了检测奶牛孕酮含量的间接竞争ELISA方法。[结果]检测奶牛孕酮的间接竞争ELISA的最佳反应条件确定为:最佳包被浓度为100 ng/ml,碳酸盐缓冲液的包被效果较好,以4℃过夜+37℃2 h佳,最佳封闭液为2%山羊血清,酶标抗体的工作浓度为0.13μg/ml。建立的标准曲线方程为y=-1.844 4x-0.140 1(R2=0.981 7),检测范围为0~20 ng/ml,最低检测限为0.58 ng/ml。该标准曲线的批内变异系数和批间变异系数分别为2.22%和2.37%。[结论]该研究建立了定量检测奶牛孕酮的间接竞争ELISA方法。     

种间竞争对发头裸腹溞和大型溞种群动态和两性生殖的影响

在温度为20℃、食物浓度为5×105cells／ml的条件下,研究了发头裸腹溞（Monia irrasa）和大型溞（Daphnia magna）的不同组合两种浸之间的竞争力强弱,结果表明：在不同组合下,发头裸腹溞种群密度均明显高于大型溞,处于竞争优势。单种培养下发头裸腹溞种群密度最大值为1196ind．／（200ml）,大型溞最大值为324ind．／（200ml）。发头裸腹溞在单种培养和混合培养时均出现了雄体,其最大雄体密度（131ind．／（200ml））出现在单种培养组。大型溞在各培养组中产生的雄体数均较少或无。发头裸腹溞在各培养组中均产生卵鞍,而大型溞只在单种培养组中出现卵鞍。两种溞产生的卵鞍多数为空卵鞍。     

伏马菌素B1间接竞争ELISA检测方法的建立和应用

以人工合成的抗原OVA-FB1作为包被抗原,FB1(伏马菌素B1)为竞争抗原,两者与一定量的抗FB1单抗反应,建立检测FB1的间接竞争ELISA方法,对玉米样品进行初步检测应用。结果表明,间接竞争ELISA方法最佳抗原包被浓度为196 ng/ml,包被时间为4℃过夜,单抗最佳工作浓度为1∶4 000,酶标二抗最佳工作浓度为1∶2 500,最佳的抗原抗体竞争反应时间和温度为4℃过夜作用。可测最适范围为10~1 000 ng/ml,回归方程为y=1.113-0.313x,相关系数R2为-0.990,灵敏度为90.88 ng/nl,最低检测限为7.83 ng/ml,批内和批间变异系数分别为3.24%和2.45%,平均添加回收率为94.32%。     

应用间接竞争ELISA检测山羊痘抗体方法的建立

[目的]为山羊痘疫苗接种山羊后产生的抗体效价检测和山羊痘的诊断奠定基础。[方法]采用Vero-E6传代细胞分离山羊痘病毒抗原,建立检测山羊痘抗体的间接竞争ELISA方法。[结果]检测山羊痘抗体的间接竞争ELISA的最佳工作条件：最佳抗原包被浓度为1μg/ml,兔抗高免血清最佳稀释度为1∶16 000,待检血清的工作浓度为1∶400,阳性血清的临界值为45.19%,阴性血清的临界值为38.89%。用该试验建立的ELISA方法检测3 000份接种山羊痘疫苗的山羊血清,阳性检出率为83.33%,琼脂扩散试验检出率为77.33%,竞争抑制ELISA方法较琼脂扩散试验方法敏感。[结论]该方法具有特异性高、快速、敏感等特点,适合检测山羊痘抗体。     

山羊血清中CD58间接竞争ELISA检测方法的建立

【目的】制备抗CD58单克隆抗体,在此基础上建立可用于定量检测山羊血清中CD58含量的间接竞争ELISA方法。【方法】以纯化的CD58蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤细胞融合技术制备抗CD58单抗,并对其特异性进行鉴定;在此基础上,建立CD58间接竞争ELISA检测方法,对不同生理时期山羊血清中CD58的含量进行检测。【结果】筛选出1株稳定分泌抗CD58单克隆抗体的杂交瘤细胞株G6;玫瑰花环抑制试验和Western-blotting试验表明,制备的细胞株能分泌针对CD58的特异性单克隆抗体;对间接竞争ELISA方法的反应条件进行优化后,建立了检测CD58的间接竞争ELISA方法,该方法最适可测范围为10~1000000 ng/mL,理论最低检测限为3.087 ng/mL,批内和批间平均变异系数分别为3.50%和5.22%;用建立的方法检测未发情和发情山羊血清中CD58含量分别为(32.160±3.69)和(35.929±3.08)μg/mL,怀孕山羊血清中CD58含量为(61.564±5.10)μg/mL。【结论】建立了山羊血清中CD58间接竞争ELISA检测方法,该方法敏感、特异,具有良好的重复性;对不同生理时期山羊血清中CD58含量的检测表明,怀孕山羊血清中CD58含量显著高于未发情和发情山羊。     

抗氯吡脲单克隆抗体的制备及其间接竞争ELISA方法的建立

在获得高特异性抗CPPU单克隆抗体的基础上,采用活性酯法将CPPU-H1与BSA、CPPU-H2与OVA偶联制备得到免疫抗原CPPU-H1-BSA和包被抗原CPPU-H2-OVA;用CPPU-H1-BSA对小鼠进行免疫,通过杂交瘤技术筛选获得了1株抗CPPU单克隆抗体的杂交瘤细胞株B7B6 24。经过体内诱生腹水法制备抗体,测定抗体亚类为Ig G1,效价为1∶32 000。通过对试验条件的优化,建立了一种检测CPPU的方法 ,该方法 IC50值为3.89 ng/m L;该抗体与四螨嗪、赤霉素、噻苯隆几乎不存在交叉反应;利用所建立的间接竞争ELISA法对葡萄样品进行检测,平均加标回收率为91.4%~112.4%,变异系数为5.9%~14.4%。本研究所建立的间接竞争ELISA方法具有低成本、高准确性和高灵敏度的特点,可以用来对葡萄中的CPPU残留情况进行检测。     

伏马毒素B1单克隆抗体的制备及间接竞争ELISA方法的建立

采用戊二醛法将半抗原伏马毒素B1分别与载体蛋白钥孔血蓝蛋白（KLH）和蛋白卵清白蛋白（OVA）偶联成为完全抗原KLH-FB1和OVA-FB1。OVA-FB1作为包被抗原建立ELISA方法;KLH-FB1作为免疫原免疫8周龄Balb/c小鼠,应用杂交瘤细胞融合技术制备单克隆抗体。经三次亚克隆后,筛选出两株（6H3,6H11）能特异、稳定分泌抗FB1单克隆抗体的杂交瘤细胞株。选择其中一株杂交瘤细胞通过体内诱生腹水的方法制备单克隆抗体,经检测表明单克隆抗体的亚型为IgG1,轻链为κ型。采用间接ELISA测得腹水纯化后效价达l∶16 000,抗体对伏马毒素的半数阻断浓度（IC50）为8.26 ng/mL,对玉米赤霉烯酮、黄曲霉素B1等结构类似物几乎不存在交叉反应,与其他结构的氯丙嗪、链霉素等无交叉反应。利用获得的抗FB1单克隆抗体,建立了间接竞争ELISA检测方法,检测灵敏度为0.44 ng/mL,检测线性范围为0.93~73.06 ng/mL,加标回收率在线性范围内达到回收率可达78.4%~102%。     

猪副粘病毒间接ELISA方法的建立

以临床分离的猪副粘病毒作为抗原,通过SPF鸡胚进行病毒培养和增殖,再经过差速离心纯化后作为ELISA包被抗原,建立了猪副粘病毒全病毒间接ELISA诊断方法。试验表明:此方法具有敏感性高、特异性好的优点,为快速诊断新型猪传染病——猪副粘病毒(PPMV)感染提供了便利的途径。     

牛乳过敏原β-乳球蛋白间接竞争ELISA检测方法的建立

检测牛乳中的主要过敏原β-乳球蛋白,利用β-乳球蛋白纯品免疫新西兰白兔,制得兔抗牛β-乳球蛋白的多克隆抗体,以β-乳球蛋白包被抗原、自制抗体为一抗、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG为二抗、四甲基联苯胺(TMB)为底物,建立了牛乳中β-乳球蛋白的间接竞争酶联免疫检测法(ELISA).确定了包被抗原质量浓度为0.5 μg/mL,一抗最佳稀释度为1∶6 400,酶标二抗稀释度为1∶10 000.结果达到批内误差3.87%,批间误差6.51%;检测的线性范围为0.05～1.00 μg/mL,标准曲线回归方程y=-1.930 2x-0.124 1,相关系数为0.994 5,说明所建立的方法灵敏度高,具有良好的准确性和重复性.     

氯霉素对大型溞的急性和慢性毒性效应

[目的]评价氯霉素对水生生物的生态风险。[方法]以大型溞为研究对象,探讨不同浓度氯霉素对大型溞急性和慢性毒性。[结果]急性毒性试验结果表明,氯霉素对大型溞的48 h-EC50值为175.846 mg/L,属于低等毒性。21 d慢性毒性试验中各浓度处理对大型溞生长繁殖相关指标有不同程度的影响,且子代出现了不同程度的畸形现象。[结论]该研究结果为氯霉素水生生态毒性评价提供理论依据。     

大型溞对栅藻摄食行为及影响因素的研究

了解浮游动物与周围浮游植物的相互关系,对探讨富营养化的生态调控机制,促进水域生态环境的改善具有理论上的指导意义。为此,利用显微镜直接计数法研究了大型溞对栅藻的摄食率及一些影响因素?峁砻鳎?在全暗条件下,大型溞的摄食率要高于全光照条件。不同时刻,大型溞的摄食率也不同,在最初的4h内,大型溞对栅藻的摄食率和滤水速度明显较高,随后的时间内摄食率和滤水速度将显著降低并趋于稳定。随栅藻藻液密度增大,大型溞摄食率增大,但滤水速度减慢。盐度对大型溞的摄食率有一定的影响,在水体盐度为0.1%～0.2%时,大型溞摄食率增加,盐度进一步增大,则对大型溞的摄食产生抑制作用。     

盐度对大型溞摄食的影响

在2(?)℃条件下,用14℃测定了两个种群大型溞在1‰～7‰盐幅内的摄食速率,结果表明,山西种群的摄食速率明显地比吉林的高。盐度为3‰时,大型溞的摄食速率最高,吉林幼溞在盐度2‰时摄食速率最高。两个种群的大型溞具有明显的昼夜摄食节律,7(?)和15(?)时为高峰,盐度对摄食节律无影响。     

5种药剂对大型溞的急性活动抑制毒性研究

[目的]比较5种药剂对大型溞(Daphnia magna Straus)的急性活动抑制毒性。[方法]测定了5种药剂对大型溞的急性活动抑制中浓度EC50,并评价了5种药剂对大型溞的毒性。[结果]5种药剂对大型溞的毒性大小表现为:20%甲氰菊酯水乳剂(EC50=0.002 8a.i.mg/L)10%高效氯氟氰菊酯可湿性粉剂(EC50=0.008 9 a.i.mg/L)7.5%鱼藤酮乳油(EC50=0.189 9 a.i.mg/L)7.5%除虫菊素水乳剂(EC50=0.202 0 a.i.mg/L)0.5%大黄素甲醚水剂(EC50=0.640 1 a.i.mg/L)。[结论]为大型溞应用于环境污染监测研究提供了理论依据。     

温度、盐度对大型溞生长和生殖的影响

大型溲一般５个幼龄和１２￣１７个成龄,幼龄龄期各１ｄ左右,各成龄平均龄期在水温１５℃、１８℃、２１℃、２５℃下分别为３．５ｄ、２．６ｄ、２．５ｄ、２．１ｄ,龄期随温度降低和龄数增加而呈延长趋势。随温度升高大型溲生长加快,生长率在Ⅳ￣Ⅴ龄 达到高峰,随后Ⅴ￣Ⅵ龄的生长率显著下降了约６０％￣７０％。低温下生长率变化较高温相对平缓,后期低温下大型溲的生长与体长超过了高温。随温度升高,大型溲性成熟、产卵提前,生殖率加快,但生殖量显著下降。２１℃是大型溲繁殖的最适温度,其总生殖量最高,达５９１．９个,未经低盐度驯化的大型溲其２４ｈ、４８ｈ、７２ｈ的半致死盐度（ＬＳ５０）分别为９．６５、９．４５、８．９８,生殖上限盐度为９．３左右。经低盐度短期驯化至８．５ｄ,其ＬＳ５０分别提高到１２．５４、１２．０５、１１．３,生殖上限盐     

温度、盐度对大型溞生长和生殖的影响

大型溲一般５个幼龄和１２￣１７个成龄,幼龄龄期各１ｄ左右,各成龄平均龄期在水温１５℃、１８℃、２１℃、２５℃下分别为３．５ｄ、２．６ｄ、２．５ｄ、２．１ｄ,龄期随温度降低和龄数增加而呈延长趋势。随温度升高大型溲生长加快,生长率在Ⅳ￣Ⅴ龄 达到高峰,随后Ⅴ￣Ⅵ龄的生长率显著下降了约６０％￣７０％。低温下生长率变化较高温相对平缓,后期低温下大型溲的生长与体长超过了高温。随温度升高,大型溲性成熟、产卵提前,生殖率加快,但生殖量显著下降。２１℃是大型溲繁殖的最适温度,其总生殖量最高,达５９１．９个,未经低盐度驯化的大型溲其２４ｈ、４８ｈ、７２ｈ的半致死盐度（ＬＳ５０）分别为９．６５、９．４５、８．９８,生殖上限盐度为９．３左右。经低盐度短期驯化至８．５ｄ,其ＬＳ５０分别提高到１２．５４、１２．０５、１１．３,生殖上限盐     

丁氟螨酯及其代谢物对大型溞的毒性效应

为评价丁氟螨酯及其代谢物[A-2、AB-1 dimer、AB-1、AB-11、B-1、B-3、Target 1(B-2)、Met-1]对水生生物的生态风险,采用半静态法测定丁氟螨酯及其8种代谢物对大型溞48 h暴露的急性毒性效应,以及丁氟螨酯对大型溞的21 d慢性毒性效应.结果表明:丁氟螨酯、Target 1(B-2)...     

灭多威对日本青鳉和大型溞乙酰胆碱酯酶的效应研究

[目的]研究不同浓度的灭多威对大型溞和日本青鳉乙酰胆碱酯酶(AChE)活性的影响。[方法]通过测定灭多威对大型溞和日本青鳉的24 h LC50评价其毒性大小,并采用Ellman方法检测灭多威对生物体AChE活性的影响。[结果]灭多威对大型溞幼溞和日本青鳉的24 h LC50分别为9.83和185μg/L。随着灭多威暴露浓度的增加,对大型溞幼溞和日本青鳉AChE活性的抑制作用增强。在体内试验中,在灭多威连续暴露下乙酰胆碱酯酶的相对酶活总体呈下降趋势。在体外试验中,在一定的时间范围内灭多威对AChE活性的抑制率与暴露时间呈一定的线性关系,且随着暴露时间的延长而增大。[结论]体内和体外试验的结果表现出明显的差异性,因此在研究污染物对生物体酶活的影响时,应分别进行体内和体外试验。