口蹄疫病毒抗原保护剂的研究

[目的]研究几种(海藻糖、蔗糖、山梨醇、聚乙烯吡咯烷酮、硫脲、明胶、L-精氨酸、抗坏血酸)保护剂,为口蹄疫抗原保护剂配方的形成提供参考。[方法]用三因素、三水平、双重复正交试验方法筛选出了对口蹄疫病毒(FMDV)抗原保护效果最好的I(4#)保护剂配方,以加保护剂A(已申请专利)的病毒为对照,比较其在不同条件下的TCID50和146s抗原的含量。[结果]通过方差分析4#保护剂保存病毒测得TCID50极显著的高于1、3、5、6、7、8号,显著高于2、9。将4#保护剂加入被保存的病毒抗原中,分别于4℃下保存90、120、150 d,其logTCID50分别为5.3、5.0和4.5,而加保护剂A(已申请专利)的对照病毒则为5.0、4.5和4.3;在37℃下保存40、50和60 h,其logT-CID50分别为4.5、2.5和1.0;而加保护剂A的对照病毒则为3.5、1.5和0.5,为了进一步验证保护剂对FMDV抗原的保护性能,进行了FMDV146s抗原含量的测定。分别于4℃下保存150 d,37℃下保存40 h,测得结果分别为0.796、0.462μg/ml,而加保护剂A的对照病毒则为0.602、0.307μg/ml。[结论]该复合配方保护剂I(4#)对FMDV有效抗原的保护作用优于保护剂A,尤其是病毒保护剂对提高FMDV的冷冻保存时间和耐热效能作用明显。     

比较大孔树脂与离子交换填料浓缩纯化FMDV抗原的效果

[目的]确定FMDV抗原的最佳纯化方法及纯化条件,为其在我国动物用疫苗行业中的大规模应用和推广奠定基础。[方法]选用大孔树脂和离子交换填料浓缩纯化FMDV抗原,通过对样品及缓冲液的pH、流速、离子强度、上样量等方面探讨各填料的最佳工作参数,并比较2种方法浓缩纯化同种FMDV抗原的效果。[结果]大孔树脂处理样品的抗原回收率为21%,离子交换填料的抗原回收率为11.7%,均不理想。大孔树脂的杂蛋白去除率为90%,离子交换填料的杂蛋白去除率仅为52%,说明大孔树脂在去除抗原中杂蛋白的效果方面可达到所需的要求。[结论]这2种方法浓缩纯化FMDV抗原的效果均不理想,但大孔树脂效果稍好。     

口蹄疫病毒抗原保护剂的筛选和优化

用三因素、三水平、双重复正交试验筛选出对口蹄疫病毒(FMDV)抗原保护效果较好的4号保护剂配方,该保护剂保存的病毒在37 ℃静置40 h和50 h后毒价TCID50分别为4.5和2.0,而对照组病毒则分别降至1.5和0.通过方差分析4号保护剂保存病毒测得TCID50极显著的高于1、3、5、6、7、8号,显著高于2、9号.保护剂配方优化试验结果表明,加该保护剂的病毒,分别于-20 ℃和4 ℃下保存90 d、120 d、150 d,其㏒TCID50分别为6.0、6.0、5.8和5.3、5.0、4.5,而未加保护剂的对照病毒则为5.8、5.3、5.0和5.0、4.5、4.3;FMDV 146 s抗原含量测定结果表明,分别于-20 ℃和4 ℃下保存150 d,37 ℃下保存40 h,测得结果分别为1.116 μg·mL-1、0.896 μg·mL-1、0.888 μg·mL-1,而未加保护剂的对照病毒则为0.846 μg·mL-1、0.802 μg·mL-1、0.307 μg·mL-1;反复冻融试验表明对照组冻融6次即为临界点, 病毒保护剂组达10次;通过对主要保护性抗原VP1基因,试验病毒株(O/NX/99/1)、对照病毒株(O/NX/99/2)测序比对,结果表明保护剂不会使病毒产生基因突变.试验结果说明该保护剂对FMDV有效抗原确实有较好的保护作用.     

病毒样颗粒作为口蹄疫病毒抗原表位载体的研究进展

病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)不含有病毒核酸,不具有自我复制的能力,但拥有与完整病毒粒子相似的空间结构和免疫原性,可以作为口蹄疫病毒(Foot and Mouth Disease Virus,FMDV)抗原表位的载体,将其展示在它的表面。主要介绍了作为FMDV抗原表位的VLPs载体:FMDV-VLPs、HBc-VLPs、PCV2-VLPs和PPV-VLPs,并阐述了VLPs在几种表达系统中的组装现状,以期为今后有关FMD的VLPs研究提供参考。     

病毒样颗粒作为口蹄疫病毒抗原表位载体的研究进展

病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)不含有病毒核酸,不具有自我复制的能力,但拥有与完整病毒粒子相似的空间结构和免疫原性,可以作为口蹄疫病毒(Foot and Mouth Disease Virus,FMDV)抗原表位的载体,将其展示在它的表面。主要介绍了作为FMDV抗原表位的VLPs载体:FMDV-VLPs、HBc-VLPs、PCV2-VLPs和PPV-VLPs,并阐述了VLPs在几种表达系统中的组装现状,以期为今后有关FMD的VLPs研究提供参考。     

人凝血酶原复合物纯化用离子交换树脂的筛选及吸附性能研究

研究了若干人工合成的大孔阴离子交换树脂对人血浆中凝血酶原复合物（PCC）的分离纯化性能；同时，将DEAE—Sephadex A50对PCC的分离纯化性能与该类人工合成的分离纯化材料进行了对比。结果表明，在各种人工合成大孔阴离子交换树脂中，CG-6对PCC具有较优的分离纯化性能；系统研究了CG-6树脂对PCC分离纯化性能。     

阴离子交换树脂纯化甘薯POD及其酶学性质研究

为得到高纯度的POD,采用阴离子交换树脂High-Q对红薯POD的粗酶结晶进行纯化并对其进行酶学性质初步研究.结果表明,粗酶结晶经过单步阴离子交换层析后达到电泳纯,SDS-PAGE检测结果为单条带,回收率为8.69％,纯化倍数为2.14;以愈创木酚为底物的Km值为0.62 mmol/L,最适pH值为4.0,最适温度为45℃;60℃保温25 min后残存活性为71.27％,0～4℃贮存15 d后残存活性为84.84％.该方法优于传统的亲和层析法纯化红薯POD.     

用弱碱性阴离子树脂分离纯化海带岩藻聚糖硫酸酯工艺的研究

对弱碱性阴离子交换树脂分离纯化海带岩藻聚糖硫酸酯的工艺条件进行了研究,并采用苯酚-硫酸法测定总糖浓度绘制解吸曲线,确定最佳样液的pH值和洗脱流速.结果表明:在上样液pH为7.0、洗脱流速为1.0 mL/min时,分别收集0.5 moL/L和1.0 moL/L的NaCl溶液的洗脱部分,得到F-1、F-2两个组分,其回收率分别为22.5%、10.6%,总糖的质量分数分别为30.5%、28.6%.其中F-1为低硫组分,硫酸根的质量分数为11.7%,F-2为高硫组分,硫酸根的质量分数为26.5%     

万古霉素分离纯化工艺研究

研究了从发酵液中纯化万古霉素的工艺.联合应用阳离子交换树脂法和大孔树脂吸附色谱法,通过比较各备选树脂的载样量、洗脱回收率、纯化倍数,优选树脂型号,确定了万古霉素纯化工艺:发酵液上PK206树脂柱,用0.1 mol/L的NH4OH溶液洗脱,收集第4,5部分(0.5 BV/部分)上CM650树脂柱,用0.3 mol/L的NH4Cl溶液洗脱,收集第6-10部分(0.5 BV/部分).收集液经纳滤脱盐、浓缩,最后产品的纯度达93.44%,总回收率为64.73%.     

利用多重RT-PCR对口蹄疫病毒分型

根据已经发表的口蹄疫病毒(FMDV)全基因序列,设计了一套引物,建立多重RT-PCR方法,区分A型、AsiaⅠ型、O型3种血清型的病毒。该方法对O型病毒的敏感性为101.00LD50,对AsiaⅠ型病毒的敏感性为101.25LD50,对A型病毒的敏感性为101.00LD50。该方法具有良好的特异性,能够区分保存适当的病料,可以用于病毒的分型。     

口蹄疫病毒全基因组序列特征分析

对口蹄疫病毒全基因组序列特征的分析有助于了解口蹄疫病毒复制、翻译等生命活动的相关机制.利用DNAStar和DNAMAN软件,对249株口蹄疫病毒全基因组序列进行了比对分析.结果表明,口蹄疫病毒ORF的长度为5 982～7 020 bp,平均长度为6 975 bp,编码1 994～2 340个氨基酸.各基因的核酸序列同源...     

口蹄疫病毒诱导PK-15细胞发生自噬的研究

[目的]探究Asia1型口蹄疫病毒感染PK-15细胞后能否诱导自噬的发生,分析细胞自噬对口蹄疫病毒复制的影响。[方法]用未经处理的PK-15细胞和自噬抑制剂3-MA处理的PK-15细胞分别感染口蹄疫病毒,通过蛋白免疫印迹和共聚焦激光显微镜检测自噬的诱导情况。[结果]自噬标志分子LC3-Ⅱ和LC3-Ⅰ蛋白水平的比值增加,并且LC3特异的绿色荧光聚集;自噬抑制剂3-MA处理细胞后口蹄疫病毒复制水平显著上调。[结论]Asia1型口蹄疫病毒感染PK-15细胞后能够诱导发生自噬,而自噬又促进口蹄疫病毒的复制。     

猪ESD真核表达质粒的构建及其抑制口蹄疫病毒复制的研究

[目的]探究猪ESD蛋白的抗病毒功能,通过构建猪ESD真核表达质粒,研究其是否能够抑制口蹄疫病毒在PK-15细胞中的复制。[方法]从PK-15细胞中提取总RNA,反转录为c DNA,PCR扩增出猪的ESD基因,构建到pc DNATM3.1/Myc-His A真核表达载体上。通过Western blotting和实时定量PCR检测ESD蛋白的表达情况及其抗病毒功能。[结果]获得了猪ESD真核表达载体,转染后能够正常表达。FMDV感染PK-15细胞后,ESD转录水平显著上调;过表达ESD蛋白显著抑制FMDV的复制;下调表达ESD蛋白显著促进FMDV的复制。[结论]猪ESD蛋白能够抑制FMDV在PK-15细胞中的复制。     

口蹄疫植物疫苗的研究进展

植物疫苗是利用植物表达重组抗原蛋白来生产疫苗。在植物中表达的抗原能够保持其自身的免疫原性。论文简要阐述了近10年来用植物表达系统生产口蹄疫疫苗的研究进展、优缺点及其应用前景。     

A型口蹄疫病毒VP1蛋白间接ELISA检测方法的建立

以原核表达经纯化复性制备的A型口蹄疫病毒(FMDV)VP1蛋白代替传统病毒抗原包被,建立快速、安全、有效的A型FMDV抗体ELISA检测方法。对前期制备的A型VP1蛋白进行Western-Blot检测,结果表明,VP1蛋白能够特异性识别A型FMDV阳性牛血清,可作为检测抗原建立检测A型FMDV抗体的方法。以最佳质量浓度1mg/L VP1蛋白为检测抗原,方阵滴定法确定最佳检测血清稀释度为1∶50[V(血清)∶V(封闭液)],最佳的酶标二抗稀释度为1∶2 000[V(酶标二抗)∶V(封闭液)],建立A型FMDV抗体ELISA检测方法。该方法的敏感性为94.32%,特异性为99.09%,批内与批间重复试验变异系数均小于8%。采用该方法检测201份临床血清,与液相阻断ELISA试剂盒的符合率达92.54%。研制的VP1-ELISA试剂盒特异、敏感、稳定、操作简便,可用来监控A型口蹄疫抗体水平。     

嵌合型口蹄疫病毒样颗粒组装研究

[目的]为研究和制备多联或多价口蹄疫病毒样颗粒疫苗奠定基础.[方法]将FLAG序列通过融合PCR技术插入口蹄疫结构蛋白VP1GH-loop可变区,并通过大肠杆菌原核表达技术表达口蹄疫病毒衣壳蛋白VP0、VP3和嵌合型VP1,在体外组装出嵌合FLAG外源多肽的口蹄疫病毒样颗粒.[结果]大肠杆菌表达的口蹄疫衣壳蛋白主要以可溶性存在,在缓冲体系中融合标签被切除衣壳蛋白VP0、VP3和FLAGVP1组装成病毒样颗粒,其大小约25 nm左右.FLAG序列成功插入GH-loop可变区第150-151氨基酸位点之间,外源多肽的插入没有影响衣壳蛋白VP1的空间结构.[结论]口蹄疫loop可变区引入外源抗原是可行的,但外源多肽的大小及理化性质会影响病毒样颗粒的组装效率.     

A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1的表达纯化及活性检测

为获得具有活性的A型FMDV VP1蛋白,以A型vp1重组质粒pMD19T A vp1为模板,利用PCR扩增得到A型FMDV vp1基因片段,将此基因片段与原核表达载体pET28a连接,构建重组质粒pET A vp1。经IPTG诱导表达含重组质粒pET A vp1的E. coli BL21 (DE3) 菌后,SDS PAGE显示VP1蛋白以包涵体形式获得高效表达,蛋白分子质量约为29 ku。通过对IPTG浓度及诱导时间进行优化,结果表明,在37 ℃条件下,IPTG终浓度为0.3 mmol/L,诱导表达6 h后,VP1蛋白的表达量最大。Western Blot分析表明,VP1重组蛋白能够被A型口蹄疫阳性血清特异性识别。ELISA检测结果显示,VP1包涵体蛋白经洗涤纯化,尿素浓度梯度透析复性后具有较高的活性。     

口蹄疫病毒O型病毒VP1蛋白表达及鉴定

利用大肠杆菌p ET-30a表达系统表达口蹄疫病毒(FMD)O型野毒株完整的VP1蛋白,并以Western blot试验进行鉴定。结果表明:VP1蛋白以可溶性表达,大小约为25 ku,可与标准O型口蹄疫病毒阳性血清特异结合。由此说明,口蹄疫病毒VP1原核表达蛋白有良好的反应原性,为构建口蹄疫病毒病毒样颗粒(Virus-like particles,VLPs)和快速特异诊断试剂研制奠定基础。     

口蹄疫病的预防控制

介绍了口蹄疫病的病原,分析了其致病特点和临床表现,最后详细研究了其预防和控制的措施。     

口蹄疫的流行与防制

口蹄疫(FMD)是一种危害严重的偶蹄动物传染病,本文从流行病学、临床病理变化以及消毒技术、治疗措施和疫病控制等方面对口蹄疫的流行与防制的研究作以综述.