布鲁氏菌环介导等温扩增（LAMP）可视化检测方法的建立

应用环介导等温扩增(LAMP)技术建立了布鲁氏菌可视化快速检测方法。针对布鲁氏菌外膜蛋白OMP25基因保守区设计6条特异引物,反应前加入染料羟基萘芬蓝(HNB)作为LAMP扩增的指示剂,63℃恒温反应60min,根据HNB的颜色变化进行结果判定。分别评价所建立LAMP方法的特异性和灵敏性,并对60份牛布鲁氏菌病虎红平板凝集试验(RBT)阳性血清样本,经LAMP和B4/B5-PCR方法进行平行检测。结果显示,本方法最低检出限约为17fg布鲁氏菌基因组DNA。本方法特异性良好,布鲁氏菌反应管均出现特异性LAMP扩增反应,而猪大肠杆菌K99、巴氏杆菌C48-1、猪链球菌ST171、绿脓杆菌等对照组均未出现扩增。针对60份RBT阳性血清的平行检测结果显示,LAMP和B4/B5-PCR这两种方法间的结果符合率为85.0%。B4/B5-PCR检测为阳性的43份样品,经本方法检测全部为阳性;B4/B5-PCR检测为阴性的17份样品,经本方法检测,9份为阳性,8份为阴性。LAMP的敏感性高于B4/B5-PCR方法。实验表明,本文所建立的基于颜色判定的布鲁氏菌LAMP检测方法具有特异、灵敏、设备要求简单等特点,适用于基层兽医部门进行布鲁氏菌的快速检测。     

环介导等温扩增(LAMP)检测禽脑脊髓炎病毒方法的建立

根据已发表的禽脑脊髓炎病毒的VP2基因序列,设计并合成了6对特异扩增禽脑脊髓炎病毒VP2基因片段的引物,通过条件优化,成功建立了针对禽脑脊髓炎病毒的环介导等温扩增(LAMP)检测法,并测定其特异性和敏感性,对采集的禽临床样品的核酸分别进行了检测.结果表明,该法只检出禽脑脊髓炎病毒.敏感性扩增结果表明,Lamp检测禽脑脊髓炎病毒为100fg的RNA模板.该LAMP方法有简便、快速和特异性高的优点,可用于临床上对禽脑脊髓炎病毒的快速检测.     

犬瘟热病毒N基因环介导等温扩增检测方法的建立

为建立犬瘟热病毒(CDV)环介导等温扩增(LAMP)检测方法,本研究根据GenBank中CDVN基因保守序列设计合成了2对LAMP引物,内引物FIP、BIP和外引物F3、B3。以CDVN基因重组质粒(pMD-CDV-N)为模板,经反应条件优化、特异性试验、敏感性试验及临床样品检测。检测结果显示,该方法于61℃水浴60min即可完成反应,最低检出量为70个拷贝,比RT-PCR灵敏10倍。该检测方法仅对CDV产生阳性扩增,而对狂犬病毒,犬细小病毒,犬腺病毒Ⅱ型扩增结果均为阴性。用建立的LAMP方法检测临床样品,检测结果与RT-PCR检测结果一致。本方法简便,特异,有利于CDV的临床检测。     

猪伪狂犬病病毒LAMP可视化检测方法的建立

根据Gen Bank中猪伪狂犬病病毒(PRV)g B基因的保守序列,设计一套特异性引物,在对反应条件进行优化后,建立了PRV环介导等温扩增(LAMP)可视化检测方法。结果显示:该方法能在常规65℃水浴锅中30 min内实现对目的片段的特异性扩增,并且可通过肉眼观察颜色直接判定检测结果 ;该方法具有很高的特异性,与猪瘟病毒、猪圆环病毒2型等均无交叉反应;该方法的敏感性可达1 fg;将该方法应用于临床样品检测,结果与普通PCR方法一致。研究表明,本研究建立的LAMP方法简便、快速、灵敏、特异,适合基层PRV感染的快速检测。     

猪巨细胞病毒环介导等温扩增方法的建立

根据GenBank已登录的猪巨细胞病毒(Porcine cytomegalovirus,PCMV)gB基因的DNA序列设计合成4对特异性引物,通过优化反应条件,以及敏感性、特异性检测,建立了猪巨细胞病毒的环介导等温扩增检测方法(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP);用建立的检测方法对2013年来自四川省雅安、成都、绵阳、眉山、乐山、德阳、遂宁、资阳等市的136份病料进行猪巨细胞病毒检测,将检测结果与常规PCR方法检测结果进行比对。结果显示,本试验建立的方法检测灵敏度可达10拷贝/μL,是常规PCR的10倍;136份病料用LAMP检测,其中有89份样品为猪巨细胞病毒阳性,其阳性率与常规PCR方法检测的阳性相符率为100%。结果表明,本试验成功建立了PCMV的LAMP检测方法,可用于临床上PCMV感染猪的确诊,对PCMV的快速诊断、综合防控等具有重要意义。     

猪细环病毒2型环介导等温扩增检测方法的建立

为了能快速、特异的检测猪细环病毒2型(TTSuV2),本研究针对TTSuV2全基因序列的非编码区域和第1个开放性阅读框前端设计了2对引物,建立了TTSuV2的环介导等温扩增(LAMP)检测方法并对反应成分和条件进行了梯度摸索。试验结果显示,该LAMP检测方法最佳反应条件为64 ℃恒温90 min,可特异性检测TTSuV2,与猪细环病毒1型、猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪博卡病毒无交叉反应,病毒最低检出限为100拷贝/μL。结果表明,建立的LAMP方法具有快速、特异且灵敏的特点,可在TTSuV2快速检测方面提供一定的技术支持。     

猪圆环病毒2型环介导等温扩增(LAMP)检测方法的研究

本研究介绍了一种便捷、灵敏而又特异的环介导逆转录等温扩增(LAMP)基因检测技术,该技术分别使用特异对应于靶序列中2对特殊引物,并在Bst DNA聚合酶的作用下对靶序列进行等温核酸扩增反应.本研究对LAMP反应体系和反应条件的优化,结果表明PCV-2 LAMP在63℃1 h内能够成功的检测猪圆环病毒2型基因;敏感性和特异性试验表明,本研究能够特异的检测PCV-2并且其敏感度可以达到10个拷贝的DNA分子,初步研究LAMP的阳性检出率与PCR的阳性检出率比较结果为94%符合.以上结果证明,LAMP扩增技术是一种检测程序简便、灵敏度和特异性较高的基因检测手段,在猪圆环病毒2型的快速检测方面具有一定的开发潜力.     

非洲猪瘟病毒环介导等温扩增快速检测方法的建立

本试验利用环介导等温扩增技术（LAMP）建立了一种快速高效检测非洲猪瘟病毒的方法。整个反应在水浴锅中恒温进行,不需要其他昂贵仪器,30 min即可得到阳性结果,灵敏度是OIE标准PCR方法的100倍,并且与其他常见猪DNA病毒无交叉反应。该方法非常适合在野外现场或缺乏试验条件的边远地区检测非洲猪瘟病毒。     

环介导等温扩增技术快速检测犬细小病毒方法的建立

旨在建立一种利用环介导等温扩增技术(LAMP)检测犬细小病毒感染的新方法。根据Gen-Bank中犬细小病毒(CPV)VP2基因序列,设计4条LAMP特异性引物,对反应条件、特异性、敏感性、可视化效果和应用效果进行研究。结果显示,在65℃等温条件下、1h内可完成LAMP扩增过程;病毒的最低检出限量为10-2个TCID50/mL;特异性和可视效果良好;对36份临床标本进行检测,阳性检出率为80.5%(29/36),检出率高于普通PCR 72.2%(26/36)。建立的LAMP检测方法,显示了较高的特异性和敏感性,而且兼具高效、快捷、可视化的优势,为临床检测犬细小病毒感染提供了一种快速简便的新方法。     

肺炎克雷伯菌环介导等温扩增技术检测方法的建立

本研究旨在建立一种环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）检测食品中的肺炎克雷伯菌。选取肺炎克雷伯菌特有的毒力基因区域,设计2对引物（1对内引物、1对外引物）,进行体外恒温扩增反应。对反应体系内的甜菜碱、核酸原料（dNTPs）、内外引物比例、Mg²⁺浓度、反应时间和温度进行优化和选择,并进行特异性和灵敏性试验检测。应用建立的LAMP方法对灭菌鸡肉人工污染加标样品进行检测。结果表明,通过优化试验,筛选到最优反应体系和反应条件;应用优化后的LAMP反应体系对包括肺炎克雷伯菌在内的18种常见微生物进行特异性检测试验,特异性良好。肺炎克雷伯菌LAMP反应体系对基因组的最低检测限是0.875 pg/μL,比传统PCR方法灵敏性高100倍。对人工鸡肉阳性样品进行检测,检测限为30 CFU/mL。本试验成功建立了一种能检测食物中致病肺炎克雷伯菌的LAMP检测方法,该方法利用2对引物针对肺炎克雷伯菌目的基因6个区域进行体外恒温核酸阶梯性扩增,灵敏性更高,反应时间更短,检测成本更低。     

环介导等温扩增法(LAMP)在水生动物病害检测中的应用

近年来我国的水产养殖发展迅速,养殖面积和产量都位居世界第一。但是疾病频发一直是困扰水产养殖的一个问题,而病原的快速检测是水产动物疾病防控的前提和关键。随着水产病害基础研究的不断深入,病原的检测技术也得到快速发展。本文介绍了一种新型的核酸扩增技术——环介导等温扩增(l oop-medi at ed i sot hermalampl i f i cat i on,LAMP),综述了近年来LAMP方法在水生动物病害检测领域的具体应用实例和研究进展,并对该方法的应用前景做了展望。     

猪圆环病毒2型环介导等温扩增检测方法的建立与应用

以猪圆环病毒2型为材料,设计了3对引物,构建了猪圆环病毒2型环介导等温扩增（LAMP）检测方法,并进行敏感性和特异性确定。建立的猪圆环病毒2型的LAMP检测方法,可以采用琼脂糖凝胶电泳、颜色变化、生成的沉淀等现象判定反应结果,为猪圆环病毒2型的现场快速检测提供了一种更加简便快速的方法,可以满足现场检疫的需要。     

新城疫病毒环介导等温扩增快速检测方法的建立

根据GenBank中新城疫病毒(NDV)La Sota毒株保守蛋白F蛋白的编码序列,设计2对环介导等温扩增(LAMP)特异性引物,对甜菜碱浓度、Mg2+浓度、反应温度等LAMP反应体系的最佳反应条件,以及特异性、敏感性等进行研究,建立了一种特异性检测NDV的LAMP方法。结果显示,该方法最低能检测到10个拷贝数的病毒核酸,与其他禽类病毒无交叉反应,且向反应产物中加入SYBR GreenⅠ可直接观察样品是否含有NDV,表明建立的LAMP检测方法具有较强的特异性、较高的敏感性和较好的易操作性,且成本较低,为出入境检验检疫系统进一步搭建NDV快速高通量检测平台奠定基础。     

鹦鹉热衣原体荧光环介导等温扩增（LAMP）检测方法的建立

鹦鹉热衣原体(Chlamydia psittaci)是一种人兽共患病原体,能引起自然疫源性衣原体病,目前广泛分布于世界各地。本研究应用环介导等温扩增技术(LAMP),针对鹦鹉热衣原体23S RNA基因序列设计引物,并进行筛选以及敏感性和特异性试验,建立了鹦鹉热衣原体恒温荧光扩增方法。该方法在63℃恒温条件下1 h内即可显示结果,操作简单、快速,特异性强,灵敏度可达100拷贝/μL,且与流产衣原体、动物布鲁氏菌、牛结核分枝杆菌、沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌无交叉反应;用国产仪器可直接通过检测荧光信号判读结果,既增强了准确性,也避免了开盖污染产生假阳性;应用建立的LAMP方法对实验室保存的临床DNA样品进行检测,发现检测结果与QPCR相同。该方法的建立弥补了传统检测技术的不足,为实现鹦鹉热衣原体的现场快速诊断提供了技术支持。     

猪圆环2型病毒环介导等温扩增实时检测方法的建立与评价

以猪圆环2型病毒为材料,设计了2对引物,构建了猪圆环2型病毒实时环介导等温扩增（LAMP）检测方法,并进行敏感性和特异性确定。建立的猪圆环2型病毒实时LAMP检测方法,通过应用实时浊度仪可以对猪圆环2型病毒进行快速检测。     

环介导等温扩增技术（LAMP）在肉源性检测中的应用及前景展望

近年来,肉类掺假事件时有发生,给消费者和相关食品安全监督部门造成一定的困扰,同时威胁着消费者的身体健康。传统意义上的检测方法如酶联检测法及PCR法均存在一定的局限性,限制其在市场上进行快速的肉类鉴别。环介导等温扩增(LAMP)是一种新型核酸扩增技术,其灵敏度高、特异性强,不依赖专业仪器设备,操作简单,已开始被广泛应用于食源性微生物的检验。本文从LAMP原理出发,阐述了LAMP技术在肉源性检测中的应用,对LAMP技术的发展前景进行了展望。     

鲑鱼甲病毒逆转录环介导等温扩增（RT-LAMP）检测方法研究

鲑鱼甲病毒(Salmonid alphavirus,SAV)是鲑鱼胰脏病(Salmon pancreas disease,PD)病原,主要感染鲑科鱼类,目前在我国尚未分离到。为提高出入境鱼类中的SAV检测效率,根据SAV nsP1基因片段,设计3对特异性引物,建立了检测SAV的逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法。该方法使用25μL反应体系,经优化后的反应温度为65℃,反应时间为1 h,检测限可达10个拷贝数的病毒核酸,且不与传染性鲑鱼贫血病毒、病毒性出血性败血症病毒、传染性造血器官坏死病毒、病毒性神经坏死病病毒、草鱼呼肠孤病毒和鲤春病毒血症病毒的RNA产生交叉反应。在反应体系中加入染料后,反应结果肉眼直接可见。本研究建立的RTLAMP方法是一种特异性强、方便快捷的SAV检测方法,适合SAV的现场初筛和核酸检测。     

猪细环病毒LAMP检测方法的建立

为建立一种特异和快速的猪细环病毒(TTSuV)检测方法,本研究通过比对TTSuV的全基因序列,选择其保守区域,设计了针对TTSuV检测的LAMP引物,利用LAMP Real Time Turbidimeter LA-320仪对反应体系及条件进行了优化,建立TTSuV环介导等温扩增的检测方法.结果表明:该方法最佳反应条件为64℃恒温50 min,病毒的最低检出限为5.5拷贝/μL,并且与其他相关传染病无交叉反应.临床样品检测结果显示,猪繁殖与呼吸综合征病毒-(PRRSV)和2型猪圆环病毒(PCV2)阳性的样品中TTSuV呈高阳性率,分别为92％和87.3％,显著高于非PRRSV和PCV2阳性的猪群.该方法的建立为快速及特异性的检测猪TTSuV提供了有效的方法.     

鸭瘟病毒环介导等温扩增(LAMP)快速检测方法的建立与应用

为建立一种简便、快速、灵敏、特异的鸭瘟病毒(DPV)检测方法,本研究根据GenBank中登录的DPV基因组序列,设计3对特异性的环介导等温扩增(LAMP)引物,经优化反应体系,建立了LAMP快速检测方法.结果表明,LAMP方法能够在63℃恒温下,1h内实现目的核酸的大量扩增.结果判定时只需要在扩增产物中加入SYBRGreen Ⅰ染料,就可以直接在可见光或紫外光下观察颜色变化.该方法敏感性可达0.245 μg/L,比普通PCR灵敏性高10倍;对鸭病毒性肝炎病毒、H9N2亚型禽流感病毒、鸭副黏病毒、鸭源偏肺病毒等的核酸无交叉反应;利用建立的LAMP检测方法对40份临床样品的阳性检出率为30％.该方法简便快捷,省时省力,是一种适用于基层实验室快速、准确检测DPV的方法.     

猪流行性腹泻病毒环介导等温扩增检测方法的建立及应用

试验旨在建立一种快速检测猪流行性腹泻病毒（PEDV）的环介导等温扩增方法（LAMP）,为诊断PEDV提供简便、敏感、准确可靠的工具。参考GenBank中PEDV基因序列（登录号：KT799997）,针对PEDVN基因设计了6条引物,对所建立的LAMP反应体系、反应温度进行优化,建立可特异性扩增PEDV的LAMP方法。结果显示,本试验成功建立了PEDV LAMP检测方法,在60℃恒温下反应60 min,能特异性地检测PEDV,检测限量为91拷贝/μL,比常规PCR方法的敏感性高100倍。对比75份临床样本的LAMP和常规RT-PCR法检测结果,显示两种方法符合率为97.3%。综上所述,本试验建立的LAMP方法具有特异性强、敏感性高,操作简单,设备要求低的特点,适用于PEDV临床样本的快速检测。