人抑制素α亚基主动免疫对鸡卵泡发育和性腺激素及产蛋率的影响

用人工合成人抑制素α亚基（１－２６Ｇｌｙ．Ｔｙｒ）片段与ＫＬＨ连接作完全抗原免疫产蛋三黄母鸡,用放免法测定排卵周期外周血中雌二醇和孕酮的水平,观察产蛋率的变化。宰杀后卵巢称重,各期卵泡分类计数。结果免疫组产蛋率、大白泡、小白泡和小黄泡数比对照组高（Ｐ〈０．０５）,蛋重、卵巢上直径大于１０ｍｍ的卵泡数两组间无显著差异。经放免法测定,免疫组外周血雌二醇基础水平比对照组高,但孕酮没有显著性差异。     

抑制素基因免疫对南阳黄牛生殖激素的影响

选择40头南阳黄牛,用3.0 mg抑制素基因重组质粒(pCIS,免疫组,n=30)或同剂量的生理盐水(对照组,n=10)间隔21 d注射2次,分别在首次免疫当天、首次免疫后第10天和第21天、加强免疫后第10天和第45天收集血清,应用放射免疫法(RIA)测定处理后不同时期血清中激素水平.结果表明:在5个采血时间点内,加强免疫后第10天抗体阳性牛比率最高,为37.5%,与其他采血时间点有显著差异.免疫组促卵泡素(FSH)平均含量比对照组高,但差异不显著;17-β雌二醇(E2)和孕酮(P4)水平在加强免疫后2组有显著性差异.另外.抑制素抗体阳性牛的FSH、E2和P4比阴性牛高,但差异不显著.这些结果说明抑制素基因重组质粒可促进肉牛产生特异性抗体,且对FSH、E2和P4水平有影响.     

双拷贝抑制素基因免疫对肉牛卵泡和黄体的影响

 【目的】探讨不同剂量的双拷贝抑制素pcISI基因免疫对肉牛生殖能力的影响。【方法】将58头同期发情肉牛随机分为6组, 每组肉牛分别注射0.75（T1）、1.5（T2）、2.25（T3）、3.0 mg/头（T4）pcISI质粒、3.0 mg/头 pcMV-S空质粒（C1）和3 mL/头 生理盐水（Ｃ2）,初次免疫21d后进行加强免疫,以探讨抑制素pcISI基因疫苗对肉牛卵泡和黄体发育的影响。【结果】4个剂量组的大卵泡数均高于对照组,除了T1外,其它3个剂量组均与对照组差异显著（P＜0.05）;T3和T4的中卵泡数均高于对照组,且差异显著（P＜0.05）;T3和T4的小卵泡数均高于对照组,且差异显著（P＜0.05）。无论左侧还是右侧,各剂量组成熟卵泡直径均高于对照组,除了T1外,其它3组两侧成熟卵泡均与对照组差异显著（P＜0.05）。无论左侧还是右侧,4个剂量组黄体直径均高于对照组,且均与对照组差异显著（P＜0.05）;T3黄体最大,T1最小,且T3与T1差异显著（P＜0.05）。加强免疫后10 d（BM10）抑制素抗体与成熟卵泡大小相关显著（r＝0.629,P＜0.05）,与黄体大小相关极显著（r＝0.651,P＜0.01）。【结论】双拷贝抑制素pcISI基因免疫可促进肉牛卵泡和黄体发育,2.25mg为最佳免疫剂量,抑制素抗体水平与卵泡和黄体发育有一定的相关性。     

抑制素主动免疫对母牛卵泡发育的影响

本试验以猪精液抑制素粗提物主动免疫母牛,研究了对母牛卵泡发育和内分泌的影响。免疫,母牛的卵泡发育率为１４５．５％,排卵率为１１８．２％,分别比对照组提高４５．５％和１８．２％。通过放射免疫法对免疫牛血液中ＦＳＨ,ＬＨ,Ｅ２水平测定发现,发情时免疫组母牛ＦＳＨ水平高于对照组,免疫组中多卵发育牛ＦＳＨ水平高于单卵牛,免疫组与对照组中ＬＨ水平相差不大,多卵牛发情时Ｅ２水平较高。     

抑制素基因免疫黄牛的黄体发育与免疫纯度及剂量的关系

为探讨双拷贝抑制素pcISI基因疫苗纯度和剂量对肉牛黄体发育的影响,将150头同期发情的南阳黄牛随机分为8个试验组和2个对照组,试验组用pcISI按2种纯度、4种剂量(0.75、1.50、2.25、3.00 mg/头)进行免疫处理,2个对照组分别用空质粒和生理盐水进行处理;初次免疫21 d后进行加强免疫。结果表明:无论用高纯度还是低纯度疫苗免疫,2.25 mg/头剂量处理对黄体的作用效果最明显,且抗体水平与黄体发育密切相关,2.25 mg/头抑制素融合表达质粒组的黄体显著大于0.75 mg/头组(P<0.05),抗体阳性牛两侧黄体显著比抗体阴性牛的大(P<0.05)。     

抑制素基因免疫对母羊生殖内分泌的影响

用抑制素基因重组质粒（pCIS）免疫生产母羊,剂量分别为每只0．2mg、0．4mg和0．8mg,以生理盐水为对照。结果表明：免疫组抗抑制素抗体阳性率达46．7％。加强免疫后第45天,免疫组的促卵泡素（FSH）水平显著高于对照组（P〈0．05）。首次免疫后第20天与加强免疫后第45天抗体阳性羊的促卵泡素水平显著高于抗体阴性羊（P〈0．05）。与对照组相比,免疫组的雌激素（E2）与孕激素（P）水平无显著变化（P〉0．05）。抑制素基因免疫能调节绵羊的促卵泡素水平,但对雌激素与孕激素的水平无显著影响。     

抑制素基因免疫对母羊生殖内分泌的影响

用抑制素基因重组质粒(pCIS)免疫生产母羊,剂量分别为每只0.2 mg、0.4 mg和0.8 mg,以生理盐水为对照.结果表明:免疫组抗抑制素抗体阳性率达46.7%.加强免疫后第45天,免疫组的促卵泡素(FSH)水平显著高于对照组(P＜0.05).首次免疫后第20天与加强免疫后第45天抗体阳性羊的促卵泡素水平显著高于抗体阴性羊(P＜0.05).与对照组相比,免疫组的雌激素(E2)与孕激素(P)水平无显著变化(P＞0.05).抑制素基因免疫能调节绵羊的促卵泡素水平,但对雌激素与孕激素的水平无显著影响.     

抑制素免疫对崇明白山羊公羔羊生殖发育的影响

利用重组抑制素对崇明白山羊雄性断奶羔羊(n=6)在第0天、第21天、第42天、第63天共进行4次免疫,探讨抑制素免疫对其睾丸发育、激素水平及生殖相关基因表达量的影响。结果表明:试验期间,免疫组抑制素抗体水平均显著高于对照组;在试验的第84天阉割时,免疫组和对照组试验羊在体重[(21.87±2.19)kg vs(23.58±5.13)kg]、阴囊周长[(20.95±0.74) cm vs (21.57±1.65) cm]、睾丸质量[(56.88±4.96) g vs(62.99±4.17)g]方面无显著差异;睾丸组织石蜡切片分析表明,免疫组和对照组试验羊在睾丸组织学上没有显著差异;血清卵泡刺激素(FSH)及睾酮(T)水平在二免后7 d免疫组显著高于对照组,其余采样时间无显著差异;血清促黄体生成素(LH)水平免疫组和对照组无显著差异;qRT-PCR检测结果表明,免疫组睾丸组织染色体联会相关基因Dmrtc2表达量极显著高于对照组(3.04 vs 1.00),性腺发育相关基因SOX30基因表达量显著高于对照组(1.48 vs 1.00),雄激素受体基因AR表达量显著低于对照组(0.59 vs 1.00),而FSH受体基因FSHR、LH受体基因LHR、精子发生相关基因GPx4以及减数分裂相关基因DDX4基因表达量两组之间没有显著差异。综上所述,抑制素免疫能短暂提高崇明白山羊FSH及T水平,提高睾丸Dmrtc2、SOX30基因的相对表达量,但对体重、LH激素水平、睾丸质量、睾丸组织学形态、睾丸FSHR、LHR等基因水平无显著影响。     

抑制素基因免疫诱导单胎绵羊孪生的研究

应用抑制素基因免疫重组质粒 (PCIS)免疫绵羊 ,首次免疫后 ,绵羊能够产生抗抑制素抗体 ,加强免疫后抗体增加显著 (P <0 0 5 ) ,免疫羊的抗体阳性率可达 4 6 7%。免疫组与对照组促卵泡素 (folliclestimutatinghormone ,FSH)的含量在加强免疫第 4 5天时差异显著 (P <0 0 5 )。在首次免疫第 2 0天与加强免疫第 4 5天 ,抗体阳性羊的促卵泡素含量显著高于抗体阴性羊 (P <0 0 5 )。免疫羊的双羔率达 39 2 % ,显著高于对照组 (P <0 0 5 ) ,比对照组提高 2 9 2 %。     

细菌DNA和gm-csf基因对抑制素基因免疫的作用

40只小鼠分为4组,分别注射pC ISI(抑制素质粒)、pC ISI+细菌DNA、pC ISI+pGM-CSF和生理盐水(8.5 g.L-1)。pC ISI剂量为20μg,与佐剂等量混合,2周后加强免疫1次。试验结果表明,细菌DNA佐剂组诱导77.8%(7/9)的个体产生了抑制素阳性抗体,抗体以IgG2α型为主,gm-csf佐剂组产生的抗体以IgG1型为主;基因佐剂联合抑制素基因免疫激发的淋巴细胞增殖能力显著高于抑制素基因单独免疫组(P<0.05);细菌DNA佐剂组阳性鼠的动情期血浆雌二醇高于阴性鼠(P<0.05),免疫对动情期孕酮水平无显著影响(P>0.05)。上述结果表明,细菌DNA和gm-csf能增强抑制素基因的免疫效果。     

抑制素基因免疫技术的研究进展

抑制素(Inhibin,INH)是一种由雌性动物的卵泡颗粒细胞和雄性动物的睾丸支持细胞分泌的糖蛋白激素.抑制素免疫可以促进卵巢卵泡发育,提高动物的繁殖力.抑制素基因免疫是近几年发展起来的动物繁殖新技术.通过对基因免疫的优点、效果、影响免疫效果的因素以及基因免疫在养禽业中的应用前景和存在的问题加以阐述,提出了未来研究的方向.     

促卵泡素(FSH)对山羊卵巢卵泡群生长发育的影响

试验研究了促卵泡素对山羊卵巢卵泡群生长发育的影响。６只母羊在发情周期的１３～１６ｄ用激素处理,处理前摘取左卵巢,处理后３ｄ摘取右卵巢,组织切片,检测卵泡数。结果显示：当卵母细胞由２层卵泡细胞包围时,开始形成透明带;当达５层以上时,开始形成腔隙。超排和未超排（对照）卵巢上小卵泡数差异不显著（Ｐ＞０．０５）,分别为３７２１±１１２个和３６８５±１５６个;而带有５层以上卵泡细胞的卵泡数差异显著（Ｐ＜０．０５）,分别为１４０±２０．３个和１１０．０±９．１个;卵泡腔形成后的卵泡数差异非常显著（Ｐ＜０．０１）,分别为７５．０±２０．２个和３２．０±１０．１个。带有１～２层卵泡细胞时期的卵泡直径大约３１．６±１．７μｍ,带有３～４层卵泡细胞的卵泡直径大约为５２．３±５．０μｍ,带有５层以上卵泡细胞的卵泡直径为１５１．２±７２．１μｍ,卵泡腔形成后的卵泡直径为０．４～３ｍｍ。     

抑制素基因免疫对黄牛孪生的影响

为增强肉牛的繁殖力,应用本实验室构建的抑制素真核融合表达质粒pCISI,提纯后辅以不同的免疫佐剂注入96头母黄牛体内,采用AMI-900兽用B超对其中84头发情牛进行卵泡检测,并对其中78头妊娠牛进行早期胚胎数目检测。结果发现:抑制素质粒pCISI能促进双大卵泡发育(80.95%,68/84),诱发排双卵(60.71%,51/84),诱导黄牛孪生(41.03%,32/78);普鲁卡因佐剂(48.78%)比脂质体(32.43%)效果明显。研究表明,抑制素基因免疫能有效提高黄牛的繁殖率。     

溆浦鹅卵泡抑制素α亚基克隆载体构建

利用RT-PCR技术从敏浦鹅卵泡的颗粒细胞总RNA中扩增出了抑制素α亚基成熟区序列,经RCR扩增出354bp片段,该片段与pMD-18T载体连接,转化JM109感受态细胞,所得阳性克隆进行双酶切鉴定和PCR鉴定,并进行了测序分析,得到的克隆序列与设计的序列基本一致。表明已成功地获得了抑制素α亚基编码序列的克隆载体。     

不同因素对抑制素基因免疫肉牛反应性的影响

为探讨佐剂、质粒纯度和免疫次数3种因素对抗抑制素抗体效价的影响，以分析抑制索基因免疫是否使内牛产生免疫应答，利用已构建的抑制索真核融合表达质粒pCISI对内牛进行了免疫试验．结果表明，抑制素pCISI基因免疫内牛后佐剂处理组比无佐剂组免疫效果明显．对抗体P/N（待测血样的吸光值P与阴性血样吸光值N的比值）来说，普鲁卡因佐剂显著优于脂质体，但就抗体阳性率来说，普鲁卡因和脂质体差异不显著．无论是抗体P/N值还是抗体阳性率，高纯度组的效果略高于低纯度组，但差异不明显．随着免疫次数的增加抗体P/N值和抗体阳性率均升高，两者差异显著，说明了抑制素基因免疫内牛可诱导产生抗抑制素抗体，纯度对抗体的产生和抗体阳性牛比例没有影响，但免疫佐剂与免疫次数有影响．     

应用磁珠免疫亲和层析法从猪卵泡液中提纯抑制素

采集猪卵泡液 ,用 70 %饱和度硫酸铵溶液沉淀后 ,分别过SephadexG 2 0 0柱和SephadexG 10 0柱 ,最后用磁珠免疫亲和层析法进一步提纯 ,使抑制素纯度从 12 4 μg·mg-1升至 39 4 μg·mg-1。PAGE电泳分析证明 ,提纯物只出现一条相对分子质量为 32 0 0 0的带 ,SDS PAGE电泳分析发现有两条相对分子质量分别为 14 0 0 0～ 15 0 0 0和 170 0 0～ 180 0 0的带 ,即β、α亚基。     

非抗性筛选抑制素基因疫苗免疫对奶牛产后子宫复旧的影响

将24头产后7 d的荷斯坦奶牛随机分为4组,高、中、低剂量免疫组(记为T1、T2、T3)分别注射1010、109、108 CFU/mL无抗性基因的抑制素真核表达质粒基因疫苗(重组菌C500(pXAIS))各3 mL,对照组(CK)注射10%生理盐水3 mL。初次免疫28 d后进行加强免疫。用B超诊断仪检测产后奶牛子宫恢复情况。结果表明:加强免疫能提高抗抑制素抗体P/N值,各免疫组P/N值均高于对照组,其中T1和T2组均与对照组差异显著(P0.05),加强免疫7 d,后T1组抗体阳性率最高,达83.33%;抑制素基因疫苗免疫30 d内,前21 d子宫颈和子宫孕角恢复较快,后7 d恢复较慢,各免疫组奶牛产后子宫颈恢复时间短于对照组,但差异不显著(P0.05);各免疫组产后子宫孕角恢复时间比对照组短,且T1组的恢复时间(28.75±1.92)d)与对照组((33.75±1.09)d)差异显著(P0.05)。以上结果表明,在本试验条件下,非抗性筛选的抑制素真核表达质粒基因疫苗免疫产后奶牛,加强免疫后能引起较好的免疫应答,且能促进奶牛产后子宫复旧。     

黄牛对抑制素pCISI基因免疫的反应性

为分析抑制素基因免疫对黄牛的影响,优化免疫方法,将3.0 mg抑制素真核融合表达质粒pCISI以不同纯度并配以不同的免疫佐剂分2次导入72头母黄牛体内,采用ELISA法检测血样中抗抑制素抗体效价。结果表明:抗体阳性牛占59.72%(43/72);添加佐剂的重组质粒较空质粒组免疫效果明显(P<0.05),普鲁卡因佐剂显著优于脂质体(P<0.05);高纯度疫苗组阳性牛的比例略高于低纯度组,但差异不明显(P>0.05)。这说明应用抑制素质粒pCISI免疫黄牛后可产生抗抑制素抗体。     

抑制素基因免疫多克隆抗体制备

为制备成本低廉、效价高的抗抑制素抗体,将6只2．5—3kg的健康大白兔分为3组（n=2）,分别皮下多点注射100μg纯化的抑制素质粒pCISI（T1、T22组）或100μg生理盐水（S对照组）,T1组加强免疫1次,而T2组加强免疫2次,每隔10d采血1次,用辛酸-硫酸铵法纯化抗血清;用ELISA法检测血清中抗抑制素抗体水平,以P／N值〉2判为阳性。ELISA检测结果表明,T1、T2组血清中均检测到抗抑制素抗体,效价为1：6400。研究结果表明,抑制素质粒pCISI免疫大白兔可产生较高效价的抗抑制素抗体,且只须加强免疫1次。