玻璃化冷冻对绵羊卵母细胞中母源基因mRNA表达量的影响

为详细了解玻璃化冷冻对绵羊卵母细胞中母源基因mRNA表达量的影响,分别玻璃化冷冻GV期和IVM 期(18、24 h)绵羊卵母细胞,解冻后进行体外培养.GV期和IVM期卵母细胞经过冷冻-解冻后,卵裂率(10.37％、23.17％、33.07％)均极显著低于对照组(82.96％,P＜0.01),且冷冻-解冻后的GV期卵母细胞卵裂率极显著低于冷冻-解冻后的IVM期卵母细胞(P＜0.01).本试验利用荧光实时定量PCR技术检测4种母源基因:Gdf9(生长分化因子-9)、Zar1(合子阻泄因子)、Mater(胚胎必要的母体抗原)、Dnmt1(DNA甲基化转移酶1)在不同处理后的绵羊卵母细胞中的mRNA含量.结果表明,4个基因的mRNA在GV期的表达量均高于IVM期的卵母细胞(P＜0.01);经玻璃化冷冻处理后,4个基因的mRNA表达量升高,其中GV期含量最高(P＜0.01).结果提示,绵羊GV或IVM期卵母细胞玻璃化冷冻导致母源基因mRNA表达量升高,可能会对胚胎发育产生负面影响.     

母源基因Gdf9、Zar1、Mater和Dnmt1mRNA在绵羊卵母细胞和早期胚胎中的表达

为探讨母源基因在绵羊卵母细胞和胚胎发育过程中的表达模式,运用Real-time PCR技术研究4种母源基因:Gdf9(生长分化因子9)、Zar1(合子阻泄因子)、Mater(胚胎必要的母体抗原)及Dnmt1(DNA甲基化转移酶1)的mRNAs在绵羊GV期卵母细胞,24h成熟卵母细胞,2-细胞、4-细胞、8-细胞、16-细胞胚胎以及囊胚中的含量变化情况。结果表明:在GV期卵中Zar1、Mater、Gdf9以及Dnmt1m RNA相对含量最高(P<0.05);从2-细胞胚胎开始,4种基因的mRNA相对含量显著降低(P<0.05),各基因mRNA的含量在不同发育阶段的卵母细胞和胚胎中存在动态变化,这对卵子生长和胚胎发育有重要意义。     

草原红牛CAPN1基因mRNA表达特性分析

为了进一步揭示CAPN1的功能,本研究采用实时荧光定量PCR技术对草原红牛初生牛与成年牛心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、瘤胃、十二指肠、背最长肌8种组织中的CAPN1mRNA表达水平进行了分析。结果表明：CAPN1基因在组织中普遍表达,但表达量存在差异。且成年牛的CAPN1基因在肺脏和瘤胃组织中的表达显著高于初生牛（P〈0.05）,成年牛在肝脏、脾脏、肾脏和背最长肌组织中CAPN1基因的表达水平极显著高于初生牛（P〈0.01）。     

绵羊基因表达定量分析内参基因的筛选

内参基因在基因表达定量分析中常用于修正基因的表达量,但不同条件下内参基因的表达并不稳定.本实验旨在选出在绵羊不同组织稳定表达的内参基因.选取6月龄广灵大尾羊的皮肤、肾周脂肪、肝脏、背部最长肌组织为实验样本,用实时荧光定量PCR方法分别测定内参基因GAPDH、18S rRNA、B2M、ACTβ、RPLPO、YWHAZ在绵...     

实时荧光定量PCR检测多重耐药大肠杆菌AcrA基因mRNA表达水平

体外单一药物诱导标准大肠杆菌ATCC25922,获得了耐氯霉素（CHL,MIC≥256 mg/L）、耐环丙沙星（CIP,MIC≥256 mg/L）、耐水杨酸钠（SAL,MIC≥275 mg/L）、耐四环素（T,MIC≥512 mg/L）的菌株。选取ATCC25922株,4株中度耐药菌SAL（175）、CHL（64）、T（64）、CIP（128）,4株高度耐药菌SAL（275）、CHL（256）、T（512）、CIP（256）,和临床分离的3株耐药大肠杆菌H1、H9、H10,通过实时荧光定量RT-PCR方法检测外输泵AcrA基因的mRNA表达水平。系统自动分析软件显示,Ct值与标准质粒浓度的对数之间存在良好的线性关系,回归系数为0.992。检测结果表明：H10、CHL（256）、CIP（256）拷贝数最高,达1015拷贝/μL;T（512）、H9、T（128）、SAL（275）、H1为1014拷贝/μL;CHL（128）、T（64）、CHL（64）为1013拷贝/μL;ATCC25922为1012拷贝/μL。不同程度耐药株AcrA基因的表达量不同,临床分离株和诱导的各高耐药菌株均比ATCC25922株表达量高,且差异极显著（P≤0.01）。这说明不同耐药程度的11株菌cDNA的量存在差异,AcrA基因转录水平与耐药水平成正相关。     

荧光定量PCR检测小鼠卵母细胞中Mad2 mRNA的表达

目的:应用SYBR G reen I染料法建立检测Mad2 mRNA表达的实时荧光定量PCR的方法,并探讨小鼠卵母细胞减数分裂成熟中Mad2 mRNA的表达。方法:采用实时荧光定量PCR的方法,以SYBR G reen I为荧光染料,梯度稀释的重组质粒为模板制作标准曲线,并以此方法分析了小鼠卵母细胞减数分裂成熟过程中Mad2 mRNA表达的动态变化。结果:建立了实时荧光定量检测方法分析小鼠卵母细胞中Mad2 mRNA的表达,该方法灵敏、特异,扩增效率接近100%。进行了标准曲线的制作,以及对目的基因Mad2转录水平的绝对定量。结论:实时荧光定量PCR是检测基因表达水平的理想选择,在小鼠卵母细胞减数分裂成熟过程中Mad2 mRNA表达存在动态变化。     

兔卵母细胞体外成熟过程中生长分化因子9基因的表达

本研究参考人、小鼠、羊等物种的GDF9基因序列设计引物,利用RT-PCR法扩增兔GDF9部分cDNA序列,实时荧光定量PCR法检测该基因在兔卵细胞体外成熟过程中的表达变化。结果获得兔GDF9基因289bp的部分cDNA序列,与人、猪、山羊相对应序列的同源性分别为81%、79%、76%。在兔卵母细胞体外成熟过程中,GDF9的表达是呈动态变化的,以0h为对照,8h表达量急剧下降,为0h的0.0124倍,16h和24h表达量分别为0h的1.4559倍和1.9096倍。     

草地早熟禾荧光定量PCR分析中内参基因的筛选

为筛选出草地早熟禾实时荧光定量中的最适内参基因,利用实时荧光定量PCR技术,分析检测6个传统内参基因ACT、GAPDH、UBQ、EF-1α、18s rRNA和β-tublin在草地早熟禾不同组织器官、叶片不同发育期、非生物胁迫和不同激素诱导下mRNA的表达差异情况。利用geNorm、NormFinder和BestKeeper软件综合评价6个候选内参基因的表达稳定性。结果表明,在不同组织、叶片不同发育期、激素诱导和非生物胁迫下,候选内参基因的表达稳定性存在差异。GAPDH在草地早熟禾不同组织器官中表达最为稳定;EF-1α在非生物胁迫下表达最为稳定;不同激素下首选β-tublin;在叶片不同发育期ACT表达最为稳定。综上所述,通过筛选出不同条件下适宜的内参基因不仅有助于提高草地早熟禾基因表达分析的准确性,也为早熟禾属植物其他内参基因的开发提供了理论参考。     

催乳素受体基因mRNA在绒山羊皮肤中表达水平的研究

本实验旨在探明绒山羊从绒毛生长前到绒毛生长旺盛期总的催乳素受体(T-PRLR)基因和短型催乳素受体(S-PRLR)基因mRNA在皮肤中表达量的变化,为进一步探明山羊绒毛生长机理奠定基础。实验选用18只年龄、体重相近的内蒙古白绒山羊,随机分为2组,每组9只,其中一组皮下埋植褪黑激素(M T)刺激山羊绒毛提前萌发和降低血液中催乳素(PR L)浓度。mRNA的表达量利用实时荧光定量聚合酶链式反应技术检测。结果表明:在内蒙古白绒山羊皮肤当中T-PRLR基因mRNA表达量从6—11月呈现逐渐降低的规律,但S-PRLR mRNA相对T-PRLR mRNA表达水平呈现上升趋势。本实验结果显示,伴随着绒毛生长速度的改变PRLR基因的可变剪接率也发生了改变,在绒山羊绒毛生长过程中S-PRLR起了主要作用。     

Calpain 1．5 mRNA表达量与鸭肉嫩度关系的研究

选择60只70日龄左右、体重相似高邮鸭、樱桃谷鸭和番鸭,屠宰后取左半膛测定剪切力,用荧光实时定量PCR法,以β-actin基因为内标,检测calpain 1.5基因的表达量与嫩度的关系,并进行品种间比较.通过对3个品种鸭剪切力的测定.高邮鸭>樱桃谷鸭>番鸭,差异均不显著(P>0.05);3个品种都是胸肉<腿肉,即胸肉嫩度大于腿肉,差异显著(P<0.05).说明3个品种鸭肉嫩度由高到低依次为番鸭>樱桃谷鸭>高邮鸭.鸭胸肉与腿肉calpain 1.5基因mRNA表达量差异显著(P<0.05).肉的剪切力和calpain 1.5基因mRNA相对表达量呈对数关系(0.5相似文献   

亮甲酚蓝染色对牛卵母细胞体外成熟和凋亡的影响

为了探讨亮甲酚蓝(brilliant cresyl blue,BCB)对牛未成熟卵母细胞染色选择后对其体外成熟(IVM)和凋亡的影响,本研究在牛卵母细胞成熟培养前用26 μmol/L BCB染色90 min作为处理组,以未染色卵母细胞作为对照组;将处理组依照胞质的颜色分为蓝色组(BCB⁺)和无色组(BCB^-),成熟培养后检测卵子的发育能力。结果表明:①经BCB染色卵母细胞在成熟后,BCB⁺组卵母细胞成熟率(80.92%)较对照组(60.00%)和BCB^-组(51.61%)差异显著(P<0.05);②BCB⁺组的凋亡率(6.50%)较对照组(28.21%)、BCB^-组(39.06%)差异显著(P <0.05),随着卵母细胞发育潜能的升高其凋亡率逐渐降低。由此可见,以亮甲酚蓝染色为基础的牛卵丘-卵母细胞复合体的区分可以用来有效的选择更具发育活力的牛卵母细胞。     

亮甲酚蓝染色对牛卵母细胞体外成熟的影响

为了探讨不同浓度亮甲酚蓝对牛卵母细胞染色选择后对其体外成熟（IVM）的影响,本研究在牛卵母细胞成熟培养前直接用不同浓度梯度的亮甲酚蓝进行不同时间的染色。结果表明：①经过不同浓度的亮甲酚蓝染色后,所选择卵母细胞染色后着色的百分率及其成熟率是不同的。用26、39、52 μmol/L的亮甲酚蓝染色后所得到的胞质蓝色组（27.7%、27.6%、31.9%）较13 μmol/L的亮甲酚蓝染色后所得到的胞质蓝色组（2.1%）差异显著（P＜0.05）;②经过不同浓度的亮甲酚蓝染色后,胞质蓝色组（77.4%）较胞质无色组（51.3%）和对照组（60.2%）成熟率差异显著（P＜0.05）;③不同浓度亮甲酚蓝染色的胞质蓝色组间成熟率差异不显著（P＞0.05）;④不同浓度亮甲酚蓝染色组与对照组卵母细胞的成熟率差异不显著（P＞0.05）;⑤经过不同时间的亮甲酚蓝染色后,所选择卵母细胞着色的百分率是不同的。用26 μmol/L的亮甲酚蓝染色90 min后所得到的胞质蓝色组（75%）较亮甲酚蓝染色60、30 min后所得到的胞质蓝色组（57.14%,40%）差异显著（P＜0.05）。以亮甲酚蓝染色为基础的牛卵丘卵母细胞复合体的区分可以用来有效的选择更具发育活力的牛卵母细胞。     

利用亮甲酚蓝染色法预测牛卵母细胞发育潜能的研究

利用亮甲酚蓝(Brilliant cresyl blue,BCB)对牛未成熟卵母细胞进行染色,根据染色结果的不同对牛未成熟卵母细胞进行分组培养,观察不同组间卵母细胞发育潜能与细胞凋亡的差异,探讨以BCB着色判定牛卵质量的可行性.本试验在牛卵母细胞成熟培养前用26μmol·L-1BCB染色90 min作为处理组(BCB+和BCB-),以未染色卵母细胞作为对照组;以卵内谷胱甘肽的浓度作为胞质成熟的判定指标,以卵母细胞体外受精后囊胚率作为卵子发育能力的判定指标,同时参照卵母细胞的凋亡检测,综合评定卵子的质量.结果表明:(1)着色组(BCB+)卵母细胞成熟率与对照组和无色组(BCB-)间差异显著(P＜0.05);(2)成熟卵母细胞中谷胱甘肽的浓度较培养前差异显著(P＜0.05);(3)经BCB染色,卵母细胞在成熟后,BCB+组的成熟率、凋亡率较对照组、BCB-组差异显著(P＜0.05);(4)体外受精后,BCB+组的囊胚率和囊胚细胞数较对照组和BCB-组差异显著(P＜0.05).由此可见,牛卵母细胞经BCB的染色选择可以作为判断卵母细胞未来发育潜能的一个标记.     

维生素D3对丝毛乌骨鸡组织中β-防御素基因的表达调控

本试验旨在研究不同水平维生素D3对丝毛乌骨鸡组织中β-防御素(AVBDs)基因表达的调控.采用实时荧光定量PCR方法检测饲喂不同水平(800、1 600、3 200和6 400 IU/kg)维生素D3对丝毛乌骨鸡胸腺、十二指肠、空肠、回肠、盲肠和法氏囊中3个β-防御素(AVBD-1、AVBD-5和GAL-1)基因表达水平的影响.结果表明:3个β-防御素基因在6个组织中均有表达,其中乌骨鸡AVBD-1和GAL-1基因的最高表达水平都在采食了3 200 IU/kg维生素D3时的空肠;AVBD-5基因的最高表达水平在采食了1 600 IU/kg维生素D3时的十二指肠;在依次采食维生素D3800、1 600、3 200和6 400 IU/kg的乌骨鸡组织中,3个β-防御素基因都存在先升后降的表达趋势.结果表明,β-防御素基因在同一组织的表达水平与维生素D3饲喂水平存在剂量关系,适宜的维生素D3饲喂水平能上调这3个β-防御素基因在乌骨鸡组织中的表达量.     

Different Months of MSTN Gene mRNA Expression Levels and their Correlation with Growth Traits in Five Xinjiang Local Sheep

To explore the different varieties of five Xinjiang local sheep myostatin (MSTN) expression levels and their correlation with growth traits (body weight,body height,body length,heart girth and cannon circumference).The MSTN mRNA expression level in different month(Birth,1 months,2 months,3 months,4 months,5 months) of muscle and fat in Altay sheep,Turpan Black sheep,Emil White sheep,Kazakh sheep,Bashbay sheep by quantitative Real-time PCR method,using SPSS 19.0 software to analyze the correlation with growth traits.The MSTN mRNA expression levels in muscle:The MSTN gene mRNA expression levels of Altay sheep,Kazakh sheep and Bashbay sheep at birth were lower than other months;The MSTN gene mRNA expression level of Emil White sheep in 3 months was significantly lower than other months (P<0.05);The MSTN gene mRNA expression levels of Altay sheep,Turpan Black sheep were the highest in 4 months;The MSTN gene mRNA expression level of Kazakh sheep was the lowest at birth,and was the highest in 5 months.The MSTN gene mRNA expression levels in fat:The MSTN gene mRNA expression level of Emil White sheep at birth was significantly lower than other months (P<0.05); The MSTN gene mRNA expression levels of Altay sheep,Emil White sheep and Bashbay sheep were the highest in 5 months,the MSTN gene mRNA expression level of Bashbay sheep in 5 months was significantly higher than other months (P<0.05);The MSTN gene mRNA expression level of Kazakh sheep was the highest in 2 month,it was significantly higher than 5 months (P<0.05).Correlation analysis revealed that the MSTN gene mRNA expression levels were mostly negatively correlated with growth traits.The MSTN gene mRNA expression levels in muscle and fat of Altay sheep were all negatively correlated with growth traits;The MSTN gene mRNA expression levels in muscle of Turpan Black sheep were negative correlated with body length and body height,others were positively;The MSTN gene mRNA expression levels in muscle of Emil White sheep were positive correlated with heart girth and cannon circumference;The MSTN gene mRNA expression levels in fat were positive correlated with body length,others were negatively correlation;The MSTN gene mRNA expression levels in muscle and fat of Kazakh sheep were positive correlated with body length,others were negatively correlation;The MSTN gene mRNA expression levels in muscle of Bashbay sheep were positive correlated with body length and cannon circumference,others were negatively correlation.The MSTN gene mRNA expression level was discrepancy in different month of different varieties,and was no fixed expression pattern;The MSTN gene mRNA expression levels were positively correlated with the part of the body size.The MSTN gene mRNA expression levels might have a direct relationship with the growth traits and bone growth.     

新疆5个品种羊不同月龄MSTN基因mRNA表达水平及其与生长性状相关性分析

为了探讨不同品种绵羊肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)表达水平及其与生长性状(体重、体高、体长、胸围和管围)的关联性,试验采用实时荧光定量 PCR方法比较阿勒泰羊、吐鲁番黑羊、也木勒白羊、哈萨克羊、巴什拜羊不同月龄(初生及1、2、3、4、5月龄)肌肉和脂肪MSTN mRNA的表达水平,运用SPSS 19.0软件分析与其生长性状的相关性.在肌肉中:初生时,阿勒泰羊、哈萨克羊、巴什拜羊MSTN基因mRNA表达水平均明显低于其他各月龄;也木勒白羊3月龄MSTN基因mRNA水平均显著低于其他各月龄(P<0.05);阿勒泰羊、吐鲁番黑羊MSTN基因mRNA在4月龄表达水平最高;哈萨克羊MSTN基因mRNA初生时表达水平最低,5月龄表达水平最高.在脂肪中:也木勒白羊MSTN基因mRNA表达水平初生时显著低于其他各月龄(P<0.05);阿勒泰羊、也木勒白羊、巴什拜羊MSTN基因mRNA 5月龄表达水平最高,巴什拜羊MSTN基因mRNA 5月龄显著高于其他各月龄(P<0.05);哈萨克羊MSTN基因mRNA 2月龄表达水平最高,显著高于5月龄(P<0.05).相关性分析结果发现,MSTN基因mRNA表达水平与生长性状多呈负相关关系.阿勒泰羊在肌肉和脂肪中MSTN基因mRNA表达水平与其生长性状均呈负相关关系;吐鲁番黑羊MSTN基因mRNA在肌肉中的表达水平与体高、体长呈负相关,其余均呈正相关;也木勒白羊MSTN基因mRNA在肌肉中的表达水平与胸围、管围呈正相关,在脂肪中表达水平与体长呈正相关,其余均呈负相关;哈萨克羊在肌肉和脂肪中除与体长呈正相关外,其余均呈负相关;巴什拜羊在肌肉中MSTN基因mRNA表达水平与体长、管围呈正相关,其余均呈负相关.MSTN基因mRNA在不同月龄不同品种间的表达水平存在差异性,无固定表达模式;且与生长性状多呈负相关关系,与部分体尺性状呈正相关关系.MSTN基因mRNA表达水平可能与生长性状和骨骼生长有直接关系.     

Effect of BCB Staining on in vitro Maturation and Development of Nuclear Transfer Embryo of Pig Oocyte

This experiment aimed to study the effect of brilliant cresyl blue (BCB) on in vitro maturation of pig oocytes and the developmental capacity of pig SCNT embryos.The cumulus-oocyte complexes (COCs) were stained with different concentrations of BCB (13,26,39 and 52 μmol/L) for 90 min,and then we divided the COCs into BCB⁺ and BCB^- for in vitro culture 42 to 44 h.The results showed that,with the concentration of BCB increased,the staining rate (20.00%,46.39%,51.66% and 59.03%) raised gradually while the maturation rate of oocytes (74.03%,72.16%,70.53% and 48.61%) reduced,the percentages of oocytes staining by 26 μmol/L BCB for 90 min were higher than that of other groups in staining rate and maturation rate.However,the nuclear maturation rate of BCB⁺ groups were higher than that of BCB^- group.Therefore,26 μmol/L BCB was selected as the most effective concentration dying the oocytes (BCB⁺),which were used as parthenogenetic activation and nuclear transfer embryos.The cleavage and blastocyst rates of parthenogenetic activation and SCNT embryos in BCB⁺ group were significantly higher than that of BCB^- group (P<0.05),but there were no significant differences between the cleavage and blastocyst rates in the groups of BCB⁺ and control (P>0.05).Reconstructed embryos derived from the COCs stained with BCB were transferred to five surrogates,and six cloned piglets were obtained from one of the two pregnant pigs.These results showed that COCs stained with BCB was an effective method to select high-quality oocytes,which could improve the efficiency of in vitro embryo production.     

亮甲酚蓝对猪卵母细胞体外成熟及核移植胚胎发育能力的影响

试验旨在研究亮甲酚蓝(brilliant cresyl blue,BCB)染色对卵母细胞体外成熟及后期胚胎发育潜力的影响。本研究利用13、26、39 、52 μmol/L BCB对成熟培养前的卵丘－卵母细胞复合体(cumulus-oocyte-complexes,COCs)染色90 min,比较各组卵母细胞的着色率、成熟率及孤雌激活胚胎和核移植胚胎的发育情况。结果表明,随着BCB浓度的增加,COCs着色率依次增加(20.00%、46.39%、51.66%和59.03%),但猪卵母细胞体外成熟率逐渐降低(74.03%、72.16%、70.53%和48.61%);不同浓度BCB染色后所得BCB⁺组卵的成熟率均明显高于BCB^-组。试验结果发现,BCB浓度在26 μmol/L时,经染色的COCs既有较高的着色率,且不影响其体外成熟的效率。基于此,研究选取26 μmol/L BCB作为最佳浓度对猪卵母细胞进行染色筛选,然后进行体外培养、孤雌激活及核移植试验。结果显示,筛选的BCB⁺组卵母细胞的孤雌胚和核移植胚的卵裂率和囊胚率均显著高于BCB^-组(P<0.05),而与对照组间无显著差异(P>0.05)。胚胎移植试验挑选BCB⁺组中发育较好的1-2细胞期重组胚对5头代孕母猪进行了移植,其中2头怀孕,1头顺利产下了6头健康胎儿。综合以上试验结果表明,利用BCB染色可作为一种有效的方法筛选体外成熟质量较高的猪卵母细胞,同时提高胚胎体外生产效率。