野生大豆种质资源对大豆疫霉根腐病抗性评价

由大豆疫霉菌引起的大豆疫霉根腐病是严重影响大豆生产的毁灭性病害之一.防治该病经济有效的方法是抗病育种,而抗性资源筛选又是抗病育种的基础.本研究采用下胚轴伤口接种法,用黑龙江省的大豆疫霉菌的1号优势生理小种对来自全国19个省份的415份野生大豆资源进行了抗性鉴定,表现抗病的有96份,占总鉴定资源的23.1%,表现中抗的资源有152份,占36.6%,表现感病的资源有167份,占40.2%.根据野生大豆的来源分析发现,在我国,抗性野生大豆资源分布较广泛.     

大豆疫霉根腐病分子生物学研究进展

大豆疫霉根腐病是严重威胁世界大豆生产的重要病害,选育和利用抗病品种是防治大豆疫霉根腐病最有效的措施,本文就和品种合理布局密切相关大豆疫霉根腐病菌遗传多样性、无毒基因标记及克隆、抗病基因的定位和抗性资源的分子鉴定等最近研究进展作一综述.     

大豆种质对大豆疫霉菌株Pm8的抗性分析

采用黄化苗下胚轴接种法,利用大豆疫霉菌株Pm8对来自不同地区的355份大豆品种(系)进行疫霉根腐病接种鉴定。结果表明:96份材料表现为抗病类型,占鉴定总数的27%,106份表现为中间类型,占总数的30%。在所鉴定的品种(系)中,北京、浙江等省(市)抗大豆疫霉菌株Pm8的资源比较丰富;吉林、四川等省的抗性资源较贫乏。研究结果为大豆抗病育种选择亲本和利用品种布局进行大豆疫霉根腐病生态控制提供了依据。     

野生大豆接种大豆疫霉根腐病后苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性的变化

对大豆疫霉根腐病菌胁迫下抗感不同野生大豆品种根、茎、叶中苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性的变化规律进行了研究.结果表明:在接种疫霉根腐病菌1号生理小种后,抗病野生大豆根和攀中的PAL活性在病程的大部分阶段比相应对照增加,并且变化的幅度较大,而感病品种相反.抗感野生大豆叶中PAL活性与对照相比变化幅度均较小.     

大豆疫霉菌侵染对大豆木质素含量及合成关键基因表达的影响

为探究大豆木质素含量及合成关键基因在与大豆疫霉菌互作过程中的变化趋势及相关性,利用大豆疫霉菌株P6497接种大豆品种Williams,分别于6,8,10和15 d分析了根部组织木质素含量及合成相关基因的表达。结果表明:根组织中木质素含量在疫霉菌侵染过程中积累速度显著增加;对木质素合成过程中9个合成关键基因表达模式分析表明,PAL、C4H和F5H表达水平在所选4个时间点均显著高于未接种对照;CCo AOMT在接种后第8,10和15天3个时间点的表达水平显著高于对照;4CL的表达在接种后第10和15天时比对照上调超过100倍;CAD和CCR表达水平分别在接种后8和10 d与对照存在显著差异;C3H和COMT的表达量在处理组和对照组中差异不显著。在接种样品中,C4H、4CL和CCR基因表达与木质素含量变化模式呈显著正相关。以上结果表明:大豆根部木质素积累受疫霉侵染诱导,暗示木质素参与大豆与疫霉互作过程,同时根据试验结果推测C4H、4CL和CCR是诱导木质素含量提高的关键基因。     

拮抗大豆疫霉菌植物内生细菌的筛选与鉴定

大豆疫霉根腐病是世界范围内危害严重的毁灭性大豆病害,筛选内生菌进行生物防治是未来该病害防治的重要发展方向。以大豆根系为材料筛选得到67株内生细菌,采用平板对峙生长实验,发现其中18株对大豆疫霉菌的菌丝生长具有抑制作用,其中以A2、A4、A7和B8效果最佳,抑制率分别达到72.8%、55.5%、76.0%和87.1%。利用无菌发酵滤液与大豆疫霉孢子共培养发现,A2和A4对孢子萌发具有明显抑制效果,抑制率达75.4%和85.8%。盆栽实验表明,A2和A4无菌发酵滤液能使经大豆疫霉孢子侵染后的大豆种子萌发率由63.1%分别提高到80.0%和80.3%,健康幼苗率由31.4%提高到45.7%和50.9%。根据16S rDNA序列系统发育分析,初步确定A2为假单胞菌(Pseudomonas sp.),A4、A7和B8皆为芽孢杆菌(Bacillus sp.)。     

大豆疫霉菌遗传多样性的RAPD分析

利用随机扩增DNA (RAPD)技术分析了15个大豆疫霉菌( Phytophthora sojae)的遗传多样性,并同其它7 个疫霉种的8个菌株进行了比较。运用筛选出的12个引物共获得152个RAPD标记,其中84. 2%具有多态性。通 过聚类分析结果表明,疫霉属种间的遗传相似系数的变化幅度为0. 533～0. 783,大豆疫霉菌与其它几种疫霉的遗 传距离相对较远,用引物OPB06扩增到P. sojae种特有的一个RAPD标记; P. sojae种内菌株间遗传相似系数的变化 幅度为0. 855～0. 967,亦存在较丰富的遗传多样性,该遗传多样性与菌株毒力之间有一定相关性,而与菌株地理来 源没有相关性。     

华南地区大豆育种材料抗疫霉根腐病鉴定

采用下胚轴伤口接种法,用大豆疫霉菌菌株Pm14对419份华南地区大豆育成品种及育种材料进行抗病性鉴定。结果鉴定出抗病资源60份,占鉴定资源总数的14.32%;中间反应类型有58份,占13.84%;感病材料301份,占71.84%。对资源的来源组成进行分析,统计结果表明,抗病性材料所占比例引自非洲的材料最高,国内次之,巴西最低。     

吉林、辽宁大豆品种(系)对大豆疫病的抗病基因鉴定

采用下胚轴伤口接种法评价了吉林和辽宁省49个主栽品种(系)对Phytophthora sojae13个不同致病型标准菌系的抗性。与鉴别寄主的比较分析表明,铁丰29,吉育67,沈农9号,吉育80推导含有Rps3a基因;铁丰31,吉育45,吉育90,九农34,铁豆42,铁豆43,铁豆44推导含有Rps3a和Rps1d双基因;辽豆18推导含有Rps3a和Rps1k双基因;辽豆17推导含有Rps1d和Rps6双基因;辽豆21,辽豆22和辽豆24推导含有Rps1a基因;九农29和九农35推导含有Rps1k基因。     

野生大豆接种大豆疫霉根腐病菌后多酚氧化酶(PPO)活性变化

以8个对黑龙江省大豆疫霉菌1号优势生理小种抗感性不同的野生大豆为材料,对接种大豆疫霉菌游动孢子后野生大豆根、茎、叶中多酚氧化酶(Polyphenol Oxidase,PPO)活性变化情况进行了初步研究。结果表明:抗病野生大豆根和叶中PPO活性在整个病程均比相应对照增加,茎中PPO活性在病程的大部分阶段高于对照,且根中PPO活性高于茎和叶的PPO活性增幅;感病野生大豆根和叶中PPO活性在病程的大部分阶段低于对照。     

大豆疫霉根腐病菌生理小种的鉴定及品种抗病性筛选

从黑龙江佳木斯，汤原，集贤，宾县，林口等县（市）采集大豆疫霉根腐病（Phytophthora sojae)标样，用V－8PBNIC选择性培养基分离获得18个P.sojae菌株，用国际上通过用13个单基因抗病的大豆品系，鉴定出5个生理小种，其中12个菌株为1号生理小种，占66．7％，为优势小种；另外还有13号生理小种和3个未报道的新生理小种，其毒力公式分别为3a,3b,3c,5,3b和1a,1d,3c,5,7。用1号生理小种接种和53个黄淮地区当前推广及待推广品种，结果表明抗病的30个，占鉴定品种的56．6％；感病的14个占26．4％；中间类型9个占17．0％。     

黑龙江省土壤中大豆疫霉菌（Phytophthora sojae）的多样性

为探究不同类型土壤中大豆疫霉菌(Phytophthora sojae)的多样性,以分离自5种不同类型土壤的176株P. sojae为研究对象,利用基因推导法和AFLP分子标记技术进行多样性分析。结果表明,不同类型土壤中P. sojae无毒基因型、无毒基因种类、无毒基因组合和群体致病力均表现出差异性,其中黑土、白浆土和草甸土中的P. sojae无毒基因型、无毒基因种类和无毒基因组合多样性相对丰富,群体致病力中等偏弱;盐碱土中的P. sojae无毒基因型、无毒基因种类和无毒基因组合多样性丰富度较低,群体致病力相对较强;风沙土中没有分离到P. sojae。聚类分析表明,以0.76为阈值时,可将176株P. sojae划分为6个组,其中黑土和白浆土中的P. sojae呈现丰富的遗传多样性;草甸土和盐碱土中的P. sojae遗传多样性丰富度较低。综合分析表明,黑龙江省P. sojae群体无毒基因和遗传多样性丰富,并与土壤类型存在一定的相关性。     

黑龙江省大豆品种对大豆疫霉根腐病抗性评价及抗性基因推导

采用下胚轴伤口接种法,利用课题组在黑龙江省分离鉴定的8个大豆疫霉根腐病生理小种（race1、race3、race4、race5、race9、race13、race44、race54）对黑龙江省曾经大面积推广种植的44个大豆品种进行接种鉴定。结果表明,对上述8个生理小种分别有45.5%、29.5%、40.9%、43.2%、36.8%、45.5%、31.8%、72.7%表现抗性或中间类型,共产生37种反应型;通过基因推导,合丰-44,绥农-12可能含有Rps1c基因或Rps1a+Rps1c、Rps1c+Rps6、Rps1c+Rps7的基因组合;黑河-32可能含有Rps1a+Rps1d的基因组合,其它品种可能含有新的抗病基因或基因组合,表明黑龙江省存在丰富的抗大豆疫霉根腐病的种质资源。 大豆;大豆疫霉根腐病;抗性基因;基因推导     

大豆疫霉根腐病菌游动孢子侵染野生大豆下胚轴的透射电镜观察

用大豆疫霉根腐病菌的游动孢子悬浮液处理抗感性不同的野生大豆下胚轴,接种后3～72 h,用透射电镜观察野生大豆与大豆疫霉菌的亲和性与非亲和性互作中细胞超微结构的变化。结果表明:接种后3～36 h,感病野生大豆随接种时间延长下胚轴细胞器结构破坏严重,而抗病野生大豆细胞结构基本完整;接种后48 h,抗病野生大豆的细胞壁物质累加,出现胞壁沉积物,而感病野生大豆细胞壁出现部分降解;接种后72 h,抗病野生大豆细胞质壁分离,但细胞器结构基本完整,感病野生大豆细胞器几乎无完整的结构。     

大豆疫霉根腐病菌的分离鉴定及种质资源对3号生理小种的抗性评价

采用下胚轴伤口接种法,用在黑龙江省建三江农场分离到的大豆疫霉菌3号生理小种对292份栽培大豆材料(其中农家品种153份、其它大豆栽培品种139份)和236份野生大豆材料进行了抗性鉴定。结果表明:栽培大豆资源抗病80份,占27.4%,中间类型93份,占31.8%,感病119份,占40.8%。153份农家品种中,抗病的有49份,占农家品种的32.0%,表明农家大豆品种资源抗性比例较高。野生大豆资源中抗病的有49份,占20.8%;中间类型55份,占23.3%;感病132份,占55.9%。鉴定的这些高抗资源可为我国大豆抗疫霉根腐病育种奠定基础。     

P-loop，Bet v 1结构域的缺失及突变对GmPR10 和Gly m 4l 抑制大豆疫霉菌能力的影响

大豆疫霉根腐病是由大豆疫霉菌（Phytophthora sojae）引起的危害大豆生长的严重病害。课题组前期研 究表明具有P-loop 结构域的GmPR10（Gene Bank accession no. FJ960440)和具有P-loop、Bet v1 结构域的Gly m 4l （Gene Bank accession no. HQ913577.1)抑制大豆疫霉菌生长,并且过表达GmPR10 和Gly m 4l 的转基因大豆植株可 以提高对大豆疫霉根腐病的抗性。为研究GmPR10 和Gly m 4l 抑菌机理,本研究利用点突变技术,获得了GmPR10 的P-loop结构域突变体（Gly48/Thr48和Gly51/Arg51）、Gly m 4l的P-loop结构域突变体（Gly49/Ile49和Lys55/Pro55）、GmPR10 和Gly m 4l的P-loop结构域以及Gly m 4l的Bet v1结构域缺失突变体,并纯化回收相应突变体蛋白,进行体外抑制 大豆疫霉菌试验。结果表明,突变或缺失P-loop,Bet v1结构域的GmPR10和Gly m 4l失去了抑制大豆疫霉菌（Race 1）生长的能力,说明P-loop、Bet v 1结构域对GmPR10和Gly m 4l行使抑菌功能至关重要。     

大豆疫霉菌子1代单游动孢株群体毒力变异

采用大豆幼苗下胚轴伤口接种法测定了7个大豆疫霉菌的68个1代单游动孢株的毒力，并对其中的45个1代单游动孢株毒力进行聚类分析，结果表明，1代单游动孢株中已无与其出发菌株毒力相同的个体，变异率高达100%。与出发菌株相比，子代单游动孢株个体毒力总体表现为减弱。但来源于同一个出发菌株的无性繁殖后代之间的毒力基本保持一致。     

大豆疫霉根腐病子叶接种法抗病性鉴定

用子叶接种法鉴定了来自黑龙江、内蒙古、湖北、以及四川的65个大豆品种对疫霉根腐病1号生理小种的抗感情况.其中抗病品种11个,中间类型5个,感病品种49个.其鉴定结果与下胚轴接种法比较相同的有51个品种.经过DPS v7.05分析下胚轴接种法与子叶接种法之间的相关呈极显著,经r×c独立性测验得到X2=1.46＜X0 05,22=5.99,2种方法差异不显著.证明了子叶接种法进行大豆疫霉根腐病抗性鉴定同样准确可行.此外还可以解决遗传分析上需要保存感病植株后代的问题,为遗传分析时鉴定疫霉根腐病抗感情况提供了可靠的方法.     

大豆疫霉菌多聚半乳糖醛酸酶pspg1基因的克隆及表达分析

大豆疫病严重影响我同及世界各国的农业生产,为探讨多聚半乳糖醛酸酶在大豆疫霉菌致病过程中的作用,采用PCR的方法从大豆疫霉菌中克隆了多聚半乳糖醛酸酶pspg1基因,并利用RT-PCR法对其在大豆中的表达进行了分析.结果表明:大豆疫霉菌pspg1基因开放阅读框长1236 bp,编码一个长412氨基酸的蛋白质.对其进化关系进行分析,发现该基因与其它卵菌的pg基因亲缘关系最近,形成一个独立的分支.RT-PCR分析表明:pspg1基因在接种大豆疫霉菌的大豆下胚轴中大量表达,而在健康大豆下胚轴中未检测到.克隆了大豆疫霉菌pspg1基因,并发现该基因在大豆疫霉菌侵染大豆过程中发挥重要作用.     

大豆疫霉病菌致病性分化研究

对采用黑龙江省和内蒙古地区的15株大豆疫霉病菌（P.sojae)进行了生理小种鉴定，只有4株表现稳定的抗感反应，其中3株为38号小种，能克服所有8个鉴别寄主所携带的抗菌基因，表现出较强的致病性；9个菌株（占60％）能克服4个以上Rps基因，包括多抗基因Rps1k,Rps1c和Rps1a，说明黑龙江省P.sojae群体毒性构成复杂，且存在一定比例强毒性菌株，对大豆生产构成潜在威胁，长期保存的P.sojae菌株致病性发生变化，表现为能克服的抗病基因数量增加。