益生菌混合培养富集锌条件优化研究

[目的]优化益生菌混合培养富集锌的条件.[方法]以青春双歧杆菌ys01、德氏乳杆菌保加利亚亚种1.148 0和嗜酸乳杆菌ysh2混合培养富锌.通过单因素试验和中心组合试验对富锌条件进行优化.[结果]最佳富锌培养条件为:低聚果糖10 g/L、Zn2+ 0.41mg/ml、蛋白胨12.2 g/L、初始pH 6.0、接种比例3∶2∶1、接种量4.6％、培养时间72 h.在该条件下,青春双歧杆菌ys01、德氏乳杆菌保加利亚亚种1.1480和嗜酸乳杆菌ysh2混合菌体锌的含量为550μg/g.[结论]以试验所得富锌混合菌体制备的富锌酸奶发酵剂具有良好的发酵性能..     

嗜酸乳杆菌的体外抑菌研究

[目的]为研究嗜酸乳杆菌的抑菌机理提供一个好的途径。[方法]以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为指示菌株,用MRS培养基培养分离纯化嗜酸乳杆菌,利用单层琼脂平板扩散法检测嗜酸乳杆菌在不同pH值条件下对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的抑菌作用。[结果]在37℃的恒温箱中培养24 h后,通过测量抑菌圈大小,可以得知嗜酸乳杆菌对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌有明显的抑菌作用。在适宜的酸性条件下,嗜酸乳杆菌对大肠杆菌的抑制作用明显,且随着酸度的增强其抑菌效果愈加明显。嗜酸乳杆菌对金黄色葡萄球菌有明显的抑制作用,但pH值的变化对其抑菌效果影响不大。[结论]在适宜的生长条件下,嗜酸乳杆菌对一些致病菌具有抑制作用。     

新疆酸马奶中嗜酸乳杆菌的发酵特性研究

[目的]从新疆传统酸马奶以及市售酸奶中分离鉴定出嗜酸乳杆菌,从中筛选出具有潜在益生特性的菌株进行发酵特性研究,寻找具有优良发酵特性的嗜酸乳杆菌菌株.[方法]利用MRS培养基活化嗜酸乳杆菌,并采用平板菌落计数法测定发酵乳中嗜酸乳杆菌的活菌数,同时利用pH计和NaOH标准溶液滴定酸度以测定发酵乳在发酵过程以及冷藏期间的酸度变化.[结果]发酵24h,嗜酸乳杆菌G14、S22和G13先后到达发酵终点的顺序依次为G14＞ S22＞ G13,其中嗜酸乳杆菌G14的产酸能力最强,发酵乳的滴定酸度为94.83°T,pH值为4.30.4℃冷藏期间,嗜酸乳杆菌G14和S22发酵乳的后酸化程度较菌株G13低.冷藏16d时,各菌株仍具有较高的对数存活率,且菌株G13、S22和G14的对数存活率分别为79.18;、80.12;和85.57;,存活能力的顺序依次为G14＞ S22＞ G13.[结论]嗜酸乳杆菌G14产酸能力最强,最先到达发酵终点.冷藏过程中,嗜酸乳杆菌G14和S22的发酵乳后酸化程度较低,且嗜酸乳杆菌G14的对数存活率最高.     

嗜酸乳杆菌生产共轭亚油酸的发酵条件研究

[目的]为提高微生物法发酵合成共轭亚油酸(CLA)的产量,优化嗜酸乳杆菌生产共轭亚油酸的发酵条件.[方法]试验以亚油酸为底物,利用嗜酸乳杆菌合成共轭亚油酸,选取对CLA的生成量影响显著的几个因素:底物浓度、接种量、pH、发酵时间、发酵温度进行单因素试验,并在此基础上进行正交试验优化发酵条件.[结果]单因素试验得到的最优发酵条件为底物浓度1.0 mg/ml、接种量4％、初始pH 5.5、发酵时间48 h、发酵温度37℃.正交试验发现,底物浓度、发酵时间、发酵温度显著影响CLA的合成产量.最终得到的最优发酵条件为底物浓度为1.5 mg/ml、接种量2％、初始pH 5.5、发酵时间36 h、发酵温度33℃.用气质联用法对产物进行定性分析,证明产物是c-9,t-11 CLA.此时,CLA的产量为91.54 μg/ml.[结论]试验优化了共轭亚油酸的发酵条件,为更有效率地利用嗜酸乳杆菌生产共轭亚油酸提供了理论依据.     

3株奶牛生殖道分离乳酸菌的益生特性评价

[目的]评价健康奶牛生殖道分离乳酸菌益生特性,发掘其作为益生菌制剂细菌成分的可能性,为开发防治奶牛子宫内膜炎的微生态制剂提供科学依据.[方法]以直肠把握法无菌采集产后40~60 d健康奶牛子宫分泌物,采用MRS培养基在厌氧条件(氧气浓度<1.2%,37℃)下分离乳酸菌,通过扩增16S rDNA序列进行鉴定,并进行抑菌活性、耐药性、黏附子宫内膜上皮细胞特性及安全性评估,分析其开发成益生菌制剂的可能性.[结果]经16S rDNA测序分析共获得8株乳酸菌,分别为植物乳杆菌、副干酪乳杆菌、蜡样芽孢杆菌、鼠李糖杆菌、蒙氏肠球菌、德氏乳杆菌、戊糖乳杆菌和嗜热链球菌,根据预试验结果选取其中3株(植物乳杆菌、副干酪乳杆菌和鼠李糖杆菌)进行益生特性评价.3株奶牛生殖道乳酸菌培养上清液对大肠杆菌、无乳链球菌及金黄色葡萄球菌均表现出良好的抑制效果,约在接种3 h后进入典型的指数生长期,生长至平台期后植物乳杆菌OD620 nm为1.375、鼠李糖杆菌OD620 nm为1.314、副干酪乳杆菌OD620 nm为1.250.副干酪乳杆菌的产酸能力最强,植物乳杆菌和鼠李糖杆菌的产酸能力几乎相同,但均不产H2O2.3株奶牛生殖道乳酸菌对青霉素G、氯霉素、阿莫西林、氨苄西林、头孢噻肟、头孢唑林和四环素等7种抗菌药物高度敏感;能同时检测到磺胺类耐药基因sul2,在副干酪乳杆菌和鼠李糖杆菌中还同时检测到氨基糖苷类耐药基因aphA-2和β-内酰胺类耐药基因blaIMP.副干酪乳杆菌能很好地黏附于奶牛子宫内膜上皮细胞,且黏附效率与副干酪乳杆菌浓度呈正相关.3株奶牛生殖道乳酸菌的混合菌液经腹腔注射小鼠后未引起脏器病变,且对小鼠的行为活动、采食饮水亦无明显影响.[结论]从奶牛生殖道分离获得的植物乳杆菌、副干酪乳杆菌和鼠李糖杆菌可作为潜在的益生菌,用于开发防治奶牛子宫内膜炎的微生态制剂.     

益生芽孢杆菌对草鱼肠上皮细胞的黏附及对嗜水气单胞菌的抑制

为探讨益生性枯草芽孢杆菌对肠上皮细胞黏附及对嗜水气单胞菌的抑制作用,以草鱼肠上皮细胞为研究对象,检测了枯草芽孢杆菌对肠上皮细胞的黏附率、对嗜水气单胞菌的黏附抑制率和对各种生理生化指标的影响。结果显示:枯草芽孢杆菌对草鱼肠上皮细胞形态、细胞中四甲基偶氮唑盐(MTT)OD值、乳酸脱氢酶(LDH)、碱性磷酸酶(AKP)和谷草转氨酶(GOT)活性等各种生理指标无显著影响,但在孵育3h和6h后分别显著降低了Na+,K+-ATP酶和谷丙转氨酶(GPT)的活性;与嗜水气单胞菌孵育3h后,肠上皮细胞由椭圆变成不规则形态,培养液的死细胞增多,并且在多数时间点上显著降低了MTT OD值以及谷草转氨酶、Na+,K+-ATP酶和谷丙转氨酶的活性,细胞中MTT OD值和细胞上清中乳酸脱氢酶的活性显著提高(P0.05);枯草芽孢杆菌和嗜水气单胞菌共孵育对肠上皮细胞形态及各种生理指标的影响明显小于嗜水气单胞菌组;黏附抑制实验显示枯草芽孢杆菌可以显著降低嗜水气单胞菌对肠上皮细胞的黏附率。提示枯草芽孢杆菌可以抑制嗜水气单胞菌对草鱼肠上皮细胞的黏附,并减轻嗜水气单胞菌对细胞的损伤。     

耐铜菌株TLSB2-K的鉴定及其铜富集能力测定

[目的]研究菌株TLSB2-K的铜耐性以及其铜富集能力的特性.[方法]通过形态观察、革兰氏染色和16S rDNA序列比对,对前期分离的菌株TLSB2-K进行了鉴定,并采用振荡培养法,探讨了温度、pH值和渗透压对菌株生长的影响,以及铜胁迫下菌株对铜的耐性及富集能力.[结果]TLSB2-K属于蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus),最适生长条件为:温度为27℃、pH值为7、渗透压为1.1％ NaC1.铜浓度100～500 mg/L范围内,菌体生长良好,铜浓度在100～400 mg/L范围内,菌体铜含量随着铜浓度的升高而增加,当铜浓度400 mg/L胁迫培养30 h,菌体铜含量达到最大值2 250mg/kg;菌株的最高铜耐受浓度为700 mg/L.[结论]菌株TLSB2-K具有较强的铜耐性和较高的铜富集能力,具有重要的理论研究和工程应用价值.     

大肠埃希菌O_(111)黏附牦牛子宫内膜上皮细胞致炎模型的建立

为建立大肠埃希菌O_(111)黏附牦牛子宫内膜上皮细胞的致炎模型,体外分离、培养牦牛子宫内膜上皮细胞,培养5d后,加入大肠埃希菌O_(111),通过计算细胞上细菌的黏附数量研究细菌数量和孵育时间对黏附效果的影响,得到最佳黏附条件,通过ELISA法测定细胞培养上清液中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-1β(IL~(-1)β)的质量浓度变化来鉴定模型。结果表明,大肠埃希菌为1×10~5 CFU/mL、孵育时间为120min是黏附的最佳条件。ELISA法检测结果表明,与对照组相比,60、90、120min组TNF-α、IL-6、IL~(-1)β的质量浓度显著升高,致炎效果明显,表明致炎模型建立成功。     

牛乳中芽孢杆菌生物学特性研究

[目的]研究乳制品中芽孢杆菌的生物学特性,为控制当地乳制品生产中芽孢杆菌所引起的质量问题提供理论依据.[方法]以内蒙古牧场的乳制品为原料,分离纯化了40株芽孢杆菌,对其进行了菌落和菌体的形态学鉴定并研究其生物学特性.[结果]试验发现,芽孢杆菌菌株革兰氏染色反应为阳性,大部分有荚膜菌体呈杆状,两端钝圆,长1.5～6.5 μm,宽0.5～3.5 μm,芽孢椭圆形,中生、近中生或偏端,孢囊大多数明显膨大,少数不明显膨大或不膨大.最高生长温度为60℃,最低为10℃,大部分为需氧菌,少数为厌氧菌,NaCl浓度大于10％将抑制其生长,pH在5.7时部分不发生反应,部分糖分有益于芽孢的生长.[结论]研究证明了营养物质、氧气、pH的控制将有效抑制芽孢杆菌的生长,从而提高乳制品的质量.     

酵母菌与乳酸菌混合培养条件研究

[目的]研究酵母菌与乳酸菌混合培养的条件。[方法]对产朊假丝酵母（Candida tails）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）、嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）等4种菌的混合培养条件进行了优化,分析了溶解氧、温度、pH值、接种比例及接种量对其菌体生长的影响。[结果]在培养基的起始pH值6.5、酵母菌与乳酸菌混合种子（活菌数约2×109 CFU/ml）中酿酒酵母菌数：产朊假丝酵母菌数：植物乳杆菌数：嗜酸乳杆菌数约为1∶2∶3∶3、酵母菌与乳酸菌混合种子的接种量为0.2%、前期120r/min震荡培养24 h,后期静置培养24 h,培养温度为28℃恒温24 h,32℃恒温24 h条件下,培养液中的总活菌数可达到6.50×108CFU/ml。[结论]该培养基增殖效果好,适合应用于大规模生产混合发酵酵母菌与乳酸菌的发酵剂。     

沙门菌、巴氏杆菌和大肠埃希菌多重PCR检测方法的建立

旨在建立一种可以应用于临床样本同时检测沙门菌、多杀性巴氏杆菌和大肠埃希菌感染的多重PCR方法。根据NCBI上已收录的沙门菌hut基因、多杀性巴氏杆菌 kmt1基因和大肠埃希菌23SrRNA基因的全基因序列,设计并合成3对特异性引物,通过优化多重PCR反应条件,建立能够同时检测3种细菌混合感染的多重PCR诊断方法。特异性分析表明,应用该方法可以从沙门菌、多杀性巴氏杆菌和大肠埃希菌以及3种细菌的混合物中扩增出3条大小分别为286 bp、457 bp和652 bp的特异性条带,其他对照组检测结果均为阴性;敏感性分析表明,该方法对沙门菌、多杀性巴氏杆菌和大肠埃希菌的最低检出量分别为1.77×10　、1.99×10　、2.01×10　 CFU/mL;人工模拟感染样本检测表明,该方法能从混合感染的病料中检测出3种病原菌。可见：所建立的多重PCR方法具有特异性强,敏感度高,稳定性好的特点,可以有效检测沙门菌、多杀性巴氏杆菌和大肠埃希菌的混合感染。     

四川省食品动物源大肠杆菌mcr-1与ESBLs基因共转移分析

为了解四川省食品动物源大肠杆菌mcr-1耐药基因流行情况,及其与超广谱β-内酰胺酶基因(ESBLs)共存和共转移的特征,采用微量肉汤稀释法检测菌株对不同抗菌药物的敏感性;采用PCR检测菌株mcr-1,以及mcr-1阳性菌株中ESBLs基因类型;采用质粒接合转移试验分析了mcr-1与ESBLs基因共转移的耐药机制。结果显示:190株大肠杆菌的mcr-1检出率为36.84%,75.71% mcr-1阳性菌株中同时检出ESBLs基因,主要以blaTEM-1、blaCTX-M-55和blaCTX-M-14为优势基因;mcr-1阳性菌对氨曲南(ATM)、头孢噻肟(CTX)和多黏菌素E(COL)耐药率极显著高于mcr-1阴性菌(P<0.01);质粒转移率为47.14%,其中获得mcr-1和ESBLs基因共转移的接合子表现出与供体菌相同的耐药表型及耐药基因。综上,在四川省食品动物源大肠杆菌中,mcr-1与ESBLs基因共存现象广泛存在,且耐药基因易发生水平传播,对菌株多重耐药性的产生具有重要意义。     

细粒棘球蚴重组St-Eg 95-Eg.ferritin疫苗构建及生物学特性检测

构建表达细粒棘球蚴Eg95-Eg.ferritin融合蛋白的重组口服减毒鼠伤寒沙门菌活载体疫苗株并评价其生物学特性。将细粒棘球蚴Eg95-Eg.ferritin融合基因插入到表达载体pYA3341中,构建重组质粒pYA3341-Eg95-Eg.ferritin,将重组质粒分别电转入减毒鼠伤寒沙门菌X3770和X4550,获得重组疫苗菌株St-Eg95-Eg.ferritin,对重组菌的稳定性、生长状态及安全性进行分析。结果表明,经PCR和酶切鉴定成功构建重组质粒pYA3341-Eg95-Eg.ferritin,Western blot检测Eg95-Eg.ferritin蛋白在重组菌中获得表达;生物学特性研究结果表明,重组质粒可稳定存在,且不影响重组菌的生长状态,小鼠口服试验证实,重组菌安全无毒性。成功构建能稳定表达细粒棘球蚴Eg95-Eg.ferritin融合蛋白的口服减毒鼠伤寒沙门菌活载体疫苗株,将为研究包虫病口服基因工程疫苗奠定基础。     

兰州百合和有斑百合的核型研究

【目的】研究兰州百合及有斑百合的染色体核型。【方法】利用染色体常规压片的方法,对兰州百合和有斑百合的染色体数目及核型进行了研究和分析。【结果】兰州百合的核型公式为2n=2x=24=2m+2sm+6st+14t,相对长度为6.35%～12.07%,核型不对称系数为83.25%,染色体相对差异较大。有斑百合的核型公式为2n=2x=24=4m+12st+8t,相对长度为6.11%～12.90%,核型不对称系数为80.11%。【结论】兰州百合的核型类型属于3A型,有斑百合的核型类型为3B型,以有斑百合核型的进化较高,可见不同居群的百合间核型存在差异。     

美洲棘蓟马体内共生菌Wolbachia的wsp基因分子检测及系统发育分析

【目的】对美洲棘蓟马体内共生菌Wolbachia进行分子生物学鉴定,确定该蓟马体内Wolbachia的进化位置,为进一步探讨Wolbachia对其生殖作用的调控机制提供理论依据。【方法】以wsp基因为目的基因,对美洲棘蓟马体内的共生菌Wolbachia进行特异性扩增和测序,使用Clustal X 1.83软件对所得DNA序列进行比对;在MEGA 4.0软件中采用邻接法对Wolbachia的系统发育关系进行分析。【结果】利用wsp基因的特异性引物从美洲棘蓟马体内扩增出了632 bp的Wolbachia的wsp基因片段(GenBank登录号为JN315668),580 bp的Wolbachia A群的wsp基因片段和405 bp的Mel亚群的wsp基因片段。系统发育分析结果表明,美洲棘蓟马体内的Wolbachia与黑腹果蝇亲缘关系较近。【结论】美洲棘蓟马体内感染的Wolbachia属于A群Mel亚群。     

山葡萄C4H基因的克隆表达及遗传转化分析

通过生物学技术来研究C4H基因在山葡萄着色过程中的作用,进而揭示山葡萄果皮着色的分子机理;利用RT-PCR技术克隆了山葡萄C4H基因的全长cDNA序列,并对该蛋白进行生物信息学分析,预测其功能;利用实时荧光定量PCR检测C4H基因在山葡萄8个不同转色时期的表达量,将克隆获得的山葡萄C4H基因完整的ORF连接到原核表达载体pET28a上,转化到大肠杆菌E.coli BL21(DE3),并通过不同浓度的IPTG诱导表达, SDS-PAGE检测表达产物.为了验证山葡萄C4H基因的功能,构建了表达载体pC C4H并转化农杆菌GV3101.用菌液浸泡花序法对拟南芥进行遗传转化,在含50 mg/L Kan的培养基上对T_0代种子进行筛选.克隆获得的山葡萄C4H cDNA全长1 735 bp,开放阅读框1 518 bp,编码505个氨基酸,该基因表达产物分子质量为57.70 KDa,等电点值9.06.C4H基因在山葡萄果皮转色各个时期均存在表达;该基因原核表达产物与预期大小一致,表明原核表达成功,拟南芥遗传转化先后得到3个阳性幼苗.对移栽成活的2株抗性植株进行PCR检测为阳性, 2株叶片颜色均变成紫红色;经花色素苷质量浓度的测定表明其质量浓度比对照组植株高出3倍.在拟南芥中花色素苷质量浓度虽然较低,但还是能少量合成,说明其花色素苷生物合成途径是开通的,只是积累的量较少.     

Pina新等位变异Pina-D1o的分离及分析

Puroindoline基因(Pina和Pinb)是控制小麦籽粒硬度的主效基因,决定小麦加工品质,分离该基因的新等位变异有利于小麦籽粒硬度性状的改良。采用同源克隆方法从节节麦(Aegilops tauschii,DD PI603224)中分离到一个Pina新等位变异Pina-D1o。生物信息学分析表明,该基因编码区全长447bp,编码148个氨基酸残基,具有小麦族作物PinA蛋白所特有的WRWWKWWK色氨酸结构域和10个半胱氨酸所形成的5个二硫键结构。根据核苷酸序列构建的拓扑树,Pina-D1o与Pina-D1m、Pina-D1n相同,均由功能性等位变异Pina-D1a发生单基因突变而来,因而Pina-D1o有可能来源于Pina-D1a。可见,新等位变异类型PinaD1o的发现可以为小麦的籽粒硬度改良提供基因资源。     

加州新小绥螨对截形叶螨的捕食作用

为明确加州新小绥螨Neoseiulus californicus(McGregor)对截形叶螨Tetranychus truncate(Ehara)的捕食潜力,采用捕食者功能反应方程及参数研究加州新小绥螨对截形叶螨各螨态捕食作用。结果表明,加州新小绥螨对雌成螨、若螨、卵的选择性捕食系数分别为0.365、1.276和1.390。在不同温度条件下,加州新小绥螨对截形叶螨的功能反应均属于HollingⅡ型;对猎物卵和幼若螨的控制能力最强。在试验温度范围内,加州新小绥螨的捕食能力随温度升高呈先增后减趋势,28℃时最强,对截形叶螨雌成螨、若螨和卵的攻击系数(a)最大,分别为0.639、0.730和0.842;处理时间最短,分别为0.126、0.075和0.039d;最大日捕食量分别为7.943头、13.405头和25.575粒。加州新小绥螨的捕食作用存在较强的种内干扰反应,随着捕食者密度的增大,平均捕食量逐渐减少,捕食作用率也相应降低,捕食作用率与其自身密度的关系为E=0.423P-0.747。     

结球甘蓝类钙调蛋白基因 CML48和 CML50在不同胁迫下的表达分析

为探究结球甘蓝类钙调蛋白（CMLs）响应不同胁迫时的功能,丰富CMLs参与钙信号网络调控,为CMLs参与植物逆境途径及其功能的研究提供依据。以结球甘蓝ZG为材料,克隆得到 CML48和 CML50基因,序列分析表明 CML48开放阅读框（ORF）为672 bp,含4个内含子,编码223 aa,分子量为25.28 ku; CML50开放阅读框ORF为1 095 bp,编码364 aa,分子量为38.06 ku,含3个内含子;均为亲水蛋白,均含有2个EF-hand结构域;系统发育树表明 CML48和 CML50均与甘蓝处于同一进化枝,与白菜、油菜的亲缘关系最近。qPCR表明 CML48和 CML50在干旱(PEG6000)、盐胁迫(NaCl)、低温(4 ℃)、高温(37 ℃)、H₂O₂、脱落酸（ABA）、水杨酸（SA）和茉莉酸甲酯（MeJA）等不同胁迫处理下,在叶和根中的表达均有上调,且 CML50的表达量均显著高于 CML48, CML48在茎尖中高度响应高温胁迫,而在根中不响应高温和H₂O₂胁迫。初步说明 CML48和 CML50在根和叶中均可响应上述8种非生物胁迫。     

牙鲆变态发育过程中epigen基因的空间表达分布

细胞分裂在鲽形目鱼类变态过程中发挥了重要作用。Epigen作为表皮分裂原,通过激活MAPK通道来调控有丝分裂。以前的研究利用定量PCR表明,epigen在变态前期表达量升高,而变态后期表达量下降,表明其与变态发育相关。为了进一步调查epigen与牙鲆变态发育的关系,利用RNA整体原位杂交技术检测了epigen在变态期牙鲆体内的空间表达分布,发现在变态期的各个阶段,epigen基因表达分布均比较广泛,表皮、鳃、肝脏、肠道、鳍条、支鳍骨、肌节等组织都有表达,在牙鲆变态前和变态早期(E期)信号较强,而在变态高峰期(F期和G期)和变态后期(H期)信号逐渐变弱。Epigen空间表达分布模式提示,其作为表皮分裂原,可能广泛参与牙鲆变态发育早期事件,尤其可能与肝脏、肠道、支鳍骨和鳍条的发育有关。