B型副鸡禽杆菌田间分离株的毒力及免疫原性研究

为探索分离自安徽省某大型白羽鸡场的1株B型副鸡禽杆菌的毒力及免疫原性,本试验测定了该菌对5～6胚龄SPF鸡胚及35～40日龄SPF鸡的毒力,并用该菌株制备免疫原,免疫35～40日龄SPF鸡,用攻毒的方法测定菌株的免疫原性,同时对本菌株制备的抗原及目前国内、国外市场上销售的鸡传染性鼻炎A型、B型、C型三价或二价灭活疫苗的免疫效力进行比较。毒力试验结果显示,本菌株对SPF鸡胚的最小致死剂量为110 CFU,对SPF鸡的最小发病剂量为5.5×10~3 CFU。免疫原性试验结果显示,本菌株制备的抗原免疫鸡能有效抵抗本菌株的攻击,说明本菌株的免疫原性良好,而市场上销售的鸡传染性鼻炎三价/二价灭活疫苗免疫鸡均无法抵抗本菌株的攻击,说明市场上销售的疫苗对本菌株的保护效果较差,B型菌疫苗间的交叉保护效果不理想。本试验为B型鸡传染性鼻炎疫苗的研究提供参考和物质基础。     

鸡传染性鼻炎三价灭活疫苗生产用菌株的筛选

为了筛选免疫原性良好的鸡传染性鼻炎灭活疫苗生产用菌株,本试验对分离的5株A型、3株B型和3株C型副鸡禽杆菌的致病性和免疫原性进行分析。首先通过毒力试验筛选毒力较强的菌株,对筛选出的菌株进行最小发病剂量测定,再将最小发病剂量定为攻毒剂量,进行免疫原性分析和最小抗原含量测定。毒力试验结果显示,11株分离株均具有较强的毒力,从中筛选出毒力较强的A型菌2株(HN3株和HB2株)、B型菌2株(HN5株和SD4株)和C型菌2株(HN1株和SD3株)。最小发病剂量测定结果显示,A型HN3株、B型HN5株和C型SD3株毒力最强,最小发病剂量分别约为2.0×10⁴、1.8×10³和2.3×10³CFU。免疫原性分析和最小抗原含量测定结果显示,A型HN3株、B型HN5株和C型SD3株具有良好的免疫原性,不仅可以抵抗同源菌株的攻击,还能对同血清型异源菌株提供良好的保护,免疫后血清HI抗体效价和阳性比例均较高,且与攻毒保护相关性较好,A型HN3株、B型HN5株和C型SD3株的最小抗原含量分别为5.0×10⁸、1.0×10<...     

副鸡禽杆菌毒力因子研究进展

副鸡禽杆菌(Avibacterium paragallinarum, Apg)是鸡传染性鼻炎的病原菌,可以引起鸡鼻腔分泌黏液性物质、打喷嚏、眶下窦肿胀、面部水肿和结膜炎等临床症状,导致病鸡生长不良,产蛋率急剧下降,从而危害养禽生产。Apg的致病性受多种因素影响,包括荚膜、脂多糖等细胞壁结构成分和菌体分泌的功能性蛋白(如血凝素和金属蛋白酶等)。本文从生物被膜及组分、细菌分泌物、铁离子获取和利用等方面对Apg毒力因子的研究进展进行归纳和综述,以期为鸡传染性鼻炎的科学防治提供理论参考。     

副鸡禽杆菌研究进展

副鸡禽杆菌(Apg)是可引起鸡传染性鼻炎(IC)的一种革兰氏阴性短杆菌。病鸡主要表现为颜面部肿胀、流涕等。该病导致育成鸡生长不良、淘汰率升高,产蛋鸡产蛋量下降,给养禽业造成了巨大经济损失。近年来,在我国多个地区暴发传染性鼻炎,甚至在已经免疫二价或三价灭活疫苗的鸡群中仍有发病。论文从病原特征、主要毒力因子以及疫苗研发等方面对副鸡禽杆菌新近取得的研究进展进行归纳总结,为进一步研究副鸡禽杆菌的致病机制以及新型防控方法提供参考。     

副鸡嗜血杆菌(Hpg-8株)培养条件的优化及免疫原性的测定

结合生产实际,采用不同添加量的酵母浸出液、鸡血清、NADH作为半合成培养基的辅料进行Hpg-8株的培养,通过活菌计数及菌液OD600吸光值的测定来比较各试验组的培养效果,并将所获得的培养物适当浓缩后制成油乳剂灭活疫苗免疫60日龄SPF鸡进行免疫原性的测定。最后,综合考虑各组培养物的抗原浓度、单位生产成本及免疫原性,确定使用在半合成培养基中添加5%鸡血清、10%酵母浸出液和0.0015%NADH的培养方案进行Hpg-8株的培养,采用该培养条件所获得的菌液的活菌数可达2.04×109CFU/mL,其免疫原性也符合中华人民共和国兽药典对Hpg-8株制苗抗原的要求。     

2株B型副鸡禽杆菌的分离鉴定

2010年3月、2011年12月分别从北京平谷、延庆疑似鸡传染性鼻炎的病鸡体内各分离到1株细菌,根据发病鸡群的临床症状、细菌分离培养、形态观察、过氧化氢酶试验、革兰氏染色结合动物回归试验、免疫攻毒试验和PCR等方法初步鉴定为副鸡禽杆菌(Apg);同时将分离菌株送匈牙利诗华研发中心进行分型鉴定,确定为B型副鸡禽杆菌,根据分离地点将分离菌株命名为B型副鸡禽杆菌(平谷株和延庆株).通过GenBank与已经发表的Apg基因序列进行同源性比对分析,结果显示,平谷株、延庆株基因序列同源性达到99.6％,而与参考株Modesto的基因核苷酸序列同源性达到98.3％、98.8％.     

鸡传染性鼻炎二价油乳剂灭活疫苗的保存期检验

应用3批鸡传染性鼻炎二价油乳剂灭活疫苗进行了保存期检验,结果表明,二价苗在4～8℃保存12个月和18个月后免疫鸡群,鸡群对A、C型强致病力菌株的保护率在二免后4周左右分别为100%和88.5%,血清SPA、阻断ELISA和HI抗体阳性检出率较高,但疫苗保存18个月后所免疫鸡的血清C型HI抗体效价的几何平均数有显著的下降.因此,该二价苗的保存期以12个月为宜.     

鸡传染性鼻炎二介油乳剂灭活疫苗的保存期检验

应用3批鸡传染性鼻炎二价油乳剂灭活疫苗进行了保存期检验，结果表明，二价苗在4－8℃保存12个月和18个月后免疫鸡群，鸡群对A、C型强致病力菌株的保护率在二免后4周左右分别为100％和88．5％，血清SPA、阻断ELISA和HI抗体阳性检出率较高，但疫苗保存18个月后所免疫鸡的血清C型HI抗体效价的几何平均数有显著的下降。因此，该二价苗的保存期以12个月为宜。     

副鸡禽杆菌河南株的分离及PCR鉴定

从河南某鸡场的疑似鸡传染性鼻炎的病鸡框下窦分泌物中分离到一株细菌,经染色镜检、菌落形态及培养特性观察怀疑为副鸡禽杆菌(Apg),命名为HN-1株。参照GenBank上发表的副鸡禽杆菌基因组序列的保守区设计1对引物,通过PCR技术扩增出939 bp的基因片段,将扩增产物与T载体连接后,转化感受态细胞,筛选出阳性重组质粒进行测序。将测序结果与GenBank上已发表的Apg相关基因序列比对,显示同源性达98%,从而从分子水平上进一步证实该分离株为副鸡禽杆菌。     

副鸡禽杆菌lpxM蛋白的原核表达及免疫原性研究

【目的】探究副鸡禽杆菌(Avibacterium paragallinarum)外膜蛋白lpxM的免疫原性,为预防鸡传染性鼻炎提供理论参考。【方法】构建pET-28a-lpxM原核表达载体,经PCR扩增和双酶切鉴定后将阳性质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,用IPTG进行诱导表达,并对诱导时间和诱导浓度进行优化,用尿素缓冲液纯化重组蛋白lpxM并进行SDS-PAGE分析。利用Western blotting鉴定重组蛋白的特异性。将重组蛋白与MONTANIDEISA 71 VG佐剂制备成疫苗v-lpxM,通过动物试验观察重组蛋白的免疫效果。【结果】重组质粒pET-28a-lpxM转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导后成功表达,在37 ku处有目的蛋白特异性条带,在37℃、700 mmol/L IPTG、诱导4 h时蛋白表达量最高;重组蛋白lpxM在上清和沉淀中均有表达,且在沉淀中表达量相对较高;Western blotting结果显示,C型副鸡禽杆菌Modesto株的阳性鸡血清与纯化后的重组蛋白可发生免疫反应。免疫保护试验结果显示,v-lpxM疫苗对A、B和...     

鸡传染性支气管炎病毒M41株毒种保存期试验

对保存于中国兽医微生物菌种保藏管理中心的4个不同年代(1991年4月、1996年6月、2001年1月、2006年12月)冻干的鸡传染性支气管炎病毒(IBV)M41株毒种进行了对雏鸡的毒力和病毒含量测定试验,结果表明:4个不同保存年代的IBV M41株毒种均能使雏鸡100%出现鸡传染性支气管炎典型症状,病毒含量均≥10~(6.0)EID_(50)/0.1 mL。其中一支毒种在-70℃以下保存22年11个月,其毒力和病毒含量均符合《中华人民共和国兽用生物制品规程》(二○○○年版)规定,能够满足检验需求。本试验为探寻IBV M41株毒种更加合理的保存期提供了参考。     

狂犬病病毒（Flury株）鸡胚低代毒（LEP）毒种的保存期试验研究及免疫原性测定

采用小鼠脑内接种法对保存不同年代的5批狂犬病病毒(Flury株)鸡胚低代毒(LEP)毒种进行病毒含量测定,并将每批毒种分别肌肉注射3月龄健康易感犬,21 d后采用小鼠脑内中和试验和荧光抑制试验分别测定犬血清抗体效价,评价毒种的免疫原性。结果显示,5批毒种每0.03 mL的病毒含量分别为104.67LD50、104.67LD50、103.5LD50、103.5LD50、104.17LD50;5批毒种免疫的10只犬血清抗体效价采用两种方法测定均达到1∶32以上,结果表明狂犬病病毒(Flury株)毒种在-70℃保存12年病毒含量仍符合标准规定,并保持有良好的免疫原性。     

一株A型副鸡嗜血杆菌的分离鉴定

从山东省某蛋鸡场发病鸡群中分离到一株细菌,经培养特性观察、生化试验、V因子生长试验、致病性试验和PCR试验,证实分离菌为一株致病性副鸡嗜血杆菌,血清型鉴定该菌为A型。药物敏感性试验表明分离菌对头孢噻肟、头孢曲松、丁胺卡那霉素高度敏感,对硫酸新霉素、强力霉素中度敏感,对磺胺间甲氧嘧啶钠、环丙沙星、庆大霉素耐药。     

测定鸡传染性法氏囊病活疫苗（B87株）参考品有效期的经典热加速稳定试验

采用热加速稳定性试验,以鸡胚半数致死量测定法对制备的参考疫苗进行病毒含量测定,预期其贮存有效期。根据Arrhenius方程,以不同温度下衰减速率常数K估算较低温度下K值,并计算参考疫苗在-30℃下贮存效力值下降一个滴度所需的时间约为2．4年。     

水貂细小病毒性肠炎灭活疫苗保存期试验

对2~8℃条件下保存90,120,150,180,210,240,300,360 d的水貂细小病毒性肠炎灭活疫苗接种水貂进行免疫试验,结果表明:保存300 d的疫苗接种水貂30 d后血清中水貂肠炎细小病毒(MEV)HI抗体均在1∶32以上,免疫水貂强毒攻击均获得100%保护,确定水貂细小病毒细胞灭活疫苗保存期为300 d。该结果为水貂细小病毒细胞灭活疫苗运输和保存提供了理论依据。     

鸭疫里墨氏杆菌菌种保存试验及蜂胶苗的保护试验

鸭疫里默氏杆菌感染已成为危害养鸭业最严重的细菌性疾病之一，其病原生长营养要求较高，普通方法不易保存；目前防制该病主要采用药物和（或）疫苗，本文对向种保存方式鸭疫里默氏杆菌的活力和毒力进行初步试验，并检测了自行研制的蜂胶苗的保护率。结果表明将带菌鸭血放于-20℃冰箱，鸭疫里默氏杆菌的活力和毒力可保持17个月以上，应用研制的蜂胶苗对雏鸭免疫两次可获得较好的保护力，达100%（10/10）。     

A型副鸡嗜血杆菌血凝素基因的克隆表达及其产物的生物学活性鉴定

根据GenBank中登录的A型Hpg Hp8株血凝素基因序列，设计合成了1对特异性引物，以Hpg Hp8株中提取的细菌DNA为模板，利用PCR扩增了Hpg血凝素全长基因（1035bp），将其克隆到pET-32a（＋）载体上，构建了原核表达载体pET—HA，表达并纯化了重组蛋白，通过免疫印迹及血凝和血凝抑制试验鉴定了该重组蛋白的生物学活性。结果显示，表达并纯化的Hpg HA重组血凝素蛋白可以和A型Hpg抗血清特异性结合，并且可以凝集鸡红细胞。表明，成功地构建了Hpg血凝素基因的原核表达载体，并表达、纯化了具有凝集鸡红细胞活性的Hpg—HA融合蛋白。     

乳胶凝集试验检测鸡传染性鼻炎血清抗体的研究

将Ａ型和Ｃ型鸡副嗜血杆菌培养后,菌落计数,离心计数,离心后用０．０１ＭｐＨ７．４磷酸盐缓冲液洗涤菌体２次。经过对致敏温度、致敏时间、致敏乳胶的菌体浓度及菌体的处理方式等条件的选择,建立了检测鸡传染性鼻炎血清抗体的乳胶凝集试验。与琼脂扩散试验相比,特异性一致,但更加敏感,且操作简便、快速。结果说明,该方法有较好的应用前景,尤其适用于本病的现场快速诊断。     

鸡传染性鼻炎灭活疫苗免疫效力的试验研究

应用当地分离株研制的鸡传染性鼻炎氢氧化铝胶灭活苗进行了免疫保护试验。并与油佐剂苗进行了比较,经对免疫鸡的抗体检测,攻毒后的临床症状,眶下窦中HPg分离表明鸡传染性鼻炎氢氧化铝胶苗优于油乳剂灭活苗。