沙丁胺醇人工抗原的制备及ic-ELISA方法的建立

以合成沙丁胺醇(SAL)完全抗原为基础获得针对SAL的多克隆抗体,建立检测SAL的间接竞争ELISA(ic-ELISA)检测方法,为进一步开发SAL快速检测试剂盒奠定基础.为此,分别用混合酸酐法和活化酯法制备SAL-BSA免疫原和SAL-OVA检测原,免疫新西兰大白兔获得SAL多抗血清,建立检测SAL ic-ELISA...     

氯霉素人工抗原的合成及多克隆抗体的制备

将氯霉素以重氮化方法使之分别与牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)、人血清白蛋白(HSA)载体蛋白连接．三种偶联物选择其中两个分别作为免疫原与包被原进行抗血清制备及ELISA试验，结果产生了特异性抗体。交叉试验表明：产生的特异性抗体与氯霉素反应明显，与其他类似物交叉反应不明显。     

己烯雌酚完全抗原的合成和多克隆抗体的制备

采用混合酸酐法,将己烯雌酚与牛血清白蛋白或卵清蛋白偶联形成完全抗原.经紫外分光光度计扫描鉴定,并通过聚丙烯酰胺电泳实验,推算出牛血清白蛋白与DES-HS的结合比是1:25～1:30.以己烯雌酚-牛血清白蛋白为抗原免疫家兔,制备出多克隆抗体,经酶联免疫吸附试验和琼脂扩散试验进行鉴定,并采用酶联免疫吸附方法进行效价测定,抗血清效价均超过了1:10 000.     

呋喃它酮代谢物人工抗原及多克隆抗体的制备

本文利用对醛基苯甲酸(CPA)与呋喃它酮代谢物(AMOZ)进行衍生化,得到衍生物CPAMOZ,并通过质谱法对其结构进行确证。然后采用混合酸酐法将CPAMOZ与载体蛋白偶联,采用紫外扫描(UV)法对偶联物进行验证。用偶联成功的人工全抗原(CPAMOZ-BSA)免疫BALB/c小鼠,间接ELISA测定小鼠血清抗体效价为1∶8×104,对NPAMOZ的半数抑制量为26.55μg/L,间接竞争ELISA鉴定小鼠血清多克隆抗体,与NPAMOZ、CPAMOZ的交叉反应率分别为100%、44.8%,与AMOZ、对醛基苯甲酸、对硝基苯甲醛以及同类其他三种药物呋喃妥因、呋喃西林、呋喃唑酮等原药及其代谢物以及代谢物衍生物的交叉反应均小于0.01%。结果表明,制备的AMOZ多克隆抗体效价高、特异性强,灵敏度高,为进一步制备AMOZ单克隆抗体和研制快速筛选检测试剂盒奠定了基础。     

雌二醇人工抗原合成及其多克隆抗体的制备

雌二醇(estradiol,EST)具有很强的生理功能,对畜禽有广泛的药理作用,但是在动物食品中残留会危害人类健康。雌二醇属于半抗原生物小分子,具有免疫反应性,但不具有免疫原性。本文中雌二醇采用混合酸酐法将肟化产物与牛血清蛋白(bovine serumalbumin,BSA)偶联,同时与卵清蛋白(ovalbumin,OVA)偶联,紫外分光光度法测定其交联率。用此合成产物进行动物体免疫,获得了雌二醇的多克隆抗体。经间接酶联免疫测定,其抗血清的稀释度可以达到1:10240,证明雌二醇免疫原的合成成功,为雌二醇酶联免疫试剂盒的研究奠定基础。     

雌二醇人工抗原的合成及间接竞争ELISA标准曲线的建立

琥珀酸酐法将雌二醇(E2)衍生化,再用碳二亚胺法(EDC)将半抗原与BSA和OVA偶联,制备免疫原和检测抗原,紫外扫描和红外光谱鉴定表明人工抗原合成成功,E2与BSA偶联比为12.3∶1。将E2-BSA免疫BALB/c小鼠,细胞融合技术筛选抗E2杂交瘤细胞株,制备单克隆抗体。结果表明,筛选的3株杂交瘤细胞E2D5、E3F7和E4A6抗体效价均在8×104以上。以E3F7细胞株建立间接竞争ELISA(icELISA)标准曲线,其线性范围为0.06⁶6.2μg/L,检测限和IC50值分别为0.03和0.76μg/L,除与去氢甲睾酮22.9%的交叉反应率外,与其他化合物无交叉反应。本研究为开发ELISA试剂盒,检测食源性动物产品中E2残留奠定基础。     

ELISA方法在猪瘟抗原抗体检测上的应用

本文总结了猪瘟抗原检测,包括双抗体夹心ELISA、竞争ELISA、抗原捕获ELISA和NASBAELISA,以及猪瘟抗体检测方法,包括间接ELISA、竞争ELISA、液相阻断ELISA和斑点ELISA方面的研究进展。     

呋喃唑酮在动物体内的代谢及代谢物残留检测研究进展

呋喃唑酮是人工合成的硝基呋喃类药物,具有致癌作用。自2005年11月以来,我国出口的鳗鱼多次被检出呋喃唑酮代谢物3-氨基-2-恶唑烷酮(AOZ)超标,引起了人们的高度重视。1呋喃唑酮在动物体内的代谢呋喃唑酮进入体内后,代谢非常迅速。鲶鱼体内的半衰期仅0.27h。家兔灌服呋喃唑酮后1     

呋喃妥因代谢物AHD单抗的制备及鉴定

将呋喃妥因代谢物1-氨基-乙内酰胺脲(AHD)的衍生物1-氨基乙内酰脲-4-羧苯基肟(CPAHD)分别与牛血清蛋白(BSA)和Jeffamine修饰的卵清蛋白(OVA)偶联,经紫外光谱扫描鉴定,成功合成了免疫抗原CPAHD-BSA和包被抗原CPAHD-Jeffamine-OVA。应用杂交瘤技术将免疫鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合,获得了稳定分泌抗4-NPAHD单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为B10E7。使用本细胞株制备的McAb对4-NPAHD的半数抑制质量浓度(IC50)为3.65 ng/mL,与同类抗生素及其代谢物未发现交叉反应,显示高度的灵敏性和特异性。本抗体的研制为建立间接竞争酶联免疫方法奠定了基础。     

磺胺甲(口恶)唑人工抗原的合成及多克隆抗体的制备

将磺胺甲(口恶)唑以重氮化方法使之分别与人血清白蛋白(HSA)、卵清蛋白(OVA)载体蛋白连接,分别作为免疫原与包被原进行抗血清制备及ELISA试验,结果产生了特异性抗体.交叉试验表明:产生的特异性抗体与磺胺甲(口恶)唑反应明显,与其他类似物交叉反应不明显.     

人MxA基因的原核表达及其抗血清的制备

本试验旨在利用大肠杆菌BL21(DE3)表达MxA融合蛋白pET32a(+)-MxA,制备兔抗人MxA抗血清。采用PCR技术获得MxA基因,然后将MxA基因重组到pET32a(+)载体中,筛选阳性克隆,转化大肠杆菌,IPTG诱导表达,用超声波裂解重组菌BL21(DE3)培养物,纯化蛋白质后免疫新西兰兔制备抗血清。SDS-PAGE分析结果显示,pET32a(+)-MxA融合蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中以包涵体形式高效表达;获得的抗血清经间接ELISA法检测效价为1∶6400;Western blotting检测结果显示,抗血清可与真核表达的MxA蛋白进行特异性结合。试验结果表明,在大肠杆菌中成功表达了pET32a(+)-MxA融合蛋白,制备了具有高度特异性的兔抗人MxA抗血清,这样为采用酶标法测定病毒患者全血细胞或由干扰素诱导的细胞产生的MxA蛋白质含量及临床诊断试剂盒的开发和应用打下了基础。     

鸡免疫球蛋白(GIgG)轻链的分离纯化及其抗血清的制备

经硫酸铵盐析、柱色谱分离得到纯化的鸡血清IgG。继用2-巯基乙醇还原、碘乙酰胶烷化拆开IgG的轻、重链,再经Sephadex G100凝胶过滤柱色谱分离得到IgG轻链。以IgG轻链免疫家兔制得兔抗鸡IgG轻链抗血清。     

喹喔啉-2-羧酸人工抗原合成与抗体制备

试验以喹喔啉-2-羧酸(quinoxaline-2-carboxylic acid,QCA)及其与γ-氨基丁酸(ABA)的衍生物(QCA-ABA)为半抗原,将其与牛血清白蛋白(BSA)和鸡卵清蛋白(OVA)偶联,合成人工抗原。以QCA-BSA和QCA-ABA-BSA为免疫原,免疫大白兔制备多克隆抗体,利用紫外分光光度计分析结合物的结合情况,间接ELISA和间接竞争ELISA分析抗体特性。结果表明,以QCA-BSA、QCA-ABA-BSA为免疫原制备的抗体平均效价分别为12.8×10⁴、6.4×10⁴。2种抗体对QCA灵敏度低,IC₅₀均大于10000 ng/mL,而对QCA-ABA的灵敏度高,IC₅₀分别为14.2和7.75 ng/mL,特异性好,仅与3-甲基-喹喔啉-2-羧酸(12%)、卡巴氧(0.038%)和喹赛多(0.028%)有较低程度的交叉反应,与衍生试剂和结构类似物均无交叉反应(<0.01%)。该抗体为建立动物可食性组织中QCA残留物的快速检测方法奠定了基础。     

猪圆环病毒2型特异性纳米抗体文库的构建及鉴定

为构建猪圆环病毒2型(PCV2)特异性纳米抗体文库,并对其库容和多样性进行鉴定分析,使用PCV2全病毒灭活疫苗免疫羊驼,经四次免疫后采血分离外周血淋巴细胞,提取总RNA,通过RT-PCR反转录合成cDNA;根据羊驼重链抗体基因序列设计特异性引物,通过巢式PCR扩增羊驼单域重链抗体(variable domain of heavy chain of heavy-chain antibody,VHH)基因片段vhh,并将其克隆到噬菌粒载体pCANTAB 5E中,构建pCANTAB- vhh重组质粒;通过电穿孔法将重组质粒导入E. coli TG1获得抗PCV2特异性纳米抗体基因文库。文库菌梯度稀释后计数单克隆菌落数,并通过菌液PCR鉴定重组菌阳性率,计算抗体文库库容量;对PCR鉴定为阳性的重组质粒进行测序,分析抗体文库多样性。结果显示,构建的PCV2特异性纳米抗体文库重组菌阳性率为92.0%,库容量为2.75×10¹⁰ CFU/mL;测序后序列比对分析结果表明,纳米抗体文库包含的基因序列具有丰富的多样性。本研究成功构建了PCV2特异性纳米抗体文库,且文库质量满足后续试验要求,为进一步获得针对PCV2抗原的纳米抗体奠定了基础。     

抗鸡源EphA2蛋白小鼠多克隆抗体的制备及其特性研究

为深入探究鸡源EphA2生物学功能,试验首先对鸡源EphA2基因进行了原核分段克隆以及真核表达载体构建。重组原核表达载体分别命名为pGEX-6p-1-EphA2-A(1-534aa)和pGEX-6p-1-EphA2-B(585-972aa),真核表达载体命名为pcDNA3.1-EphA2。重组原核表达载体转化BL21后经IPTG诱导以及SDS-PAGE分析发现,融合蛋白GST-EphA2-A和GST-EphA2-B均获得有效表达。以纯化的GST-EphA2-A和GST-EphA2-B蛋白免疫小鼠制备了抗鸡EphA2多克隆抗体。间接免疫荧光试验以及Western blot试验表明,所制备的抗鸡EphA2多克隆抗体不仅能识别转染pcDNA3.1-EphA2的DF-1及LMH细胞中表达的外源性EphA2,而且还能有效识别内源性鸡源EphA2蛋白。本研究中鸡EphA2的成功表达及其多克隆抗体研制为后续研究鸡EphA2的功能提供了分子生物学工具。     

Construction,Expression, Purification,Refold and Activity Assay of a Specific ScFv Fragment against Foot and Mouth Disease Virus

An active form of a single-chain antibody (scFv) from the murine monoclonal antibody (mAb) 1C7, which is specific for type O foot and mouth disease virus (FMDV), was produced in Escherichia coli. The complementary DNAs encoding the variable regions of the heavy chain (V_H) and light chain (V_L) were connected by a (Gly₄Ser)₃ linker, using an assembly polymerase chain reaction. V_H-(Gly₄Ser)₃-V_L genes were screened by phage display technology. The sequencing results showed that the V_H gene of scFv was composed of germline VH76-1BG-DFL16.1-JH4 and the V_L gene of scFv consisted of germline bw20-JK2. The resultant scFv gene was cloned to the pProEX^TM HTc vector and expressed in E. coli as inclusion bodies. After extraction from the E. coli cells, the inclusion bodies were solubilized and denatured in the presence of 8 mol/L urea. The expressed scFv fusion proteins were purified by nickel–nitrilotriacetic acid and finally renatured by dialysis. The purity and activity of the purified scFv were confirmed by sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide gel electrophoresis and enzyme-linked immunosorbent assay. The result revealed that the 1C7 scFv conserved the same characteristics of specific recognition and binding to type O FMDV as the parental 1C7 mAb.     

猪圆环病毒2型ORF2重组蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

利用已构建的基因工程重组菌BL21(DE3)表达猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2编码的结构蛋白,经切胶纯化后作为免疫原。采取抗原量依次递增的免疫方式免疫8周龄BALB/c小鼠,取其脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合。间接酶联免疫吸附试验(ELISA)筛选,有限稀释法进行亚克隆3次,最终获得4株稳定分泌抗PCV2 ORF2重组蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别命名为D2A1、H4G2、B10H10和G1G2。经ELISA检测,其腹水效价分别达到1∶2.048×107、1∶2.56×106、1∶1.28×106、1∶2.56×106。亚型鉴定4株单克隆抗体均属IgG2a亚型,其轻链均为κ链。Western blot鉴定表明获得的4株单克隆抗体均能特异性的识别43 kD的重组PCV2 ORF2蛋白。在间接免疫荧光试验中,单抗D2A1株的反应为阴性,H4G2、B10H10和G1G2反应为阳性,表明后3株单抗能够识别天然的PCV2 ORF2蛋白表位。本试验为进一步研究PCV2ORF2基因的功能及建立快速准确的诊断PCV2的方法奠定了基础。     

人工四倍体桑树新品种强桑2号的育成

通过人工诱导加倍桑树染色体的方法,获得丰产性能更优的桑树多倍体品种。将鲁桑系二倍体杂交组合塔桑×农桑14号F1代的幼苗,用秋水仙碱处理诱导出人工四倍体植株,经过对优良人工四倍体株系的选择、扩大繁殖以及区域适应性鉴定试验和农村生产试验,2011年通过浙江省农作物品种审定委员会审定并定名为强桑2号。该人工四倍体桑树新品种在区域性试验中与对照二倍体桑树品种湖桑32号比较,桑叶增产18.93%,桑叶养蚕的万蚕茧层量提高3.03%,并表现出抗桑疫病、抗旱耐瘠等特点。新品种适合在长江流域蚕区栽植。     

Antibodies against Crandell Rees Feline Kidney (CRFK) Cell Line Antigens, α‐Enolase,and Annexin A2 in Vaccinated and CRFK Hyperinoculated Cats

Background: Cats inoculated with feline herpesvirus 1, calicivirus, and panleukopenia (FVRCP) vaccines grown on the Crandell Rees feline kidney (CRFK) cell line have been shown to develop anti‐CRFK antibodies. The identities of common CRFK antigens are unknown. Hypothesis: Cats inoculated with CRFK lysates and FVRCP vaccines will develop autoantibodies measurable by Western blot immunoassay. Antigens associated with these antibodies can be isolated for further study. Animals: One CRFK hyperinoculated rabbit, 44 age‐matched unvaccinated kittens purchased from a commercial vendor. Methods: Commonly recognized CRFK antigens were identified by comparison of Western blot immunoassays using sera from a hyperinoculated rabbit and kittens inoculated with CRFK lysate or 1 of 4 commercially available FVRCP vaccines. Antigens were purified from CRFK lysates and sequenced. Antigen recognition was confirmed by Western blot immunoassay and indirect ELISA for 2 proteins using sera from CRFK and FVRCP inoculated kittens. Results: CRFK antigens 47, 40, and 38 kD in size were identified. Protein isolation and sequencing identified 3 CRFK proteins as α‐enolase, annexin A2, and macrophage capping protein (MCP). Sera from FVRCP and CRFK inoculated cats were confirmed to recognize annexin A2 and α‐enolase by Western blot immunoassay and indirect ELISA. Conclusions and Clinical Relevance: This study validated the use of Western blot immunoassay for detection of antibodies against CRFK proteins and identified 3 CRFK antigens. In humans, α‐enolase antibodies are nephritogenic; α‐enolase and annexin A2 antibodies have been associated with autoimmune diseases. Further research will be necessary to determine the clinical relevance of these findings.     

猪细胞周期蛋白依赖性激酶2多克隆抗体的制备与鉴定

为研究猪细胞周期蛋白依赖性激酶2(pCDK2)的生物学功能,本试验构建重组原核表达载体pET28a-pCdk2,转化大肠杆菌BL21 (DE3)受体菌,用IPTG诱导重组蛋白(rpCDK2)表达并进行SDS-PAGE和Western blotting鉴定,蛋白经纯化及与弗氏佐剂乳化后免疫家兔制备多克隆抗体。分别用Western blotting和免疫过氧化物酶单层细胞染色法(IPMA)检测抗体的免疫活性。结果显示,成功表达了rpCDK2蛋白,该蛋白以可溶性和包涵体两种形式存在,可溶性rpCDK2蛋白分子质量约为38 ku,包涵体rpCDK2蛋白在38~43 ku间有3种不同分子质量形式;IPMA检测结果显示,所制备的pCDK2蛋白多克隆抗体与猪肾细胞(PK-15)和猪睾丸细胞(ST)免疫染色呈特异性反应,且Western blotting分析显示,多克隆抗体与这两种细胞的总蛋白反应出现4条特异性条带(分子质量在34~50 ku之间),可能跟pCDK2的多种磷酸化形式有关。本试验利用原核表达系统成功制备了rpCDK2蛋白,并制备了免疫活性和特异性良好的pCDK2蛋白多克隆抗体,为该蛋白生物学功能及相关疾病研究提供了基础材料。