龙眼DlICE1基因克隆及低温胁迫表达分析

本研究以龙眼胚性愈伤组织为材料,根据龙眼转录组数据库,采用RACE-PCR和RT-PCR技术获取龙眼DlICE1 cDNA全长序列,并对其进行生物信息学分析与低温胁迫下表达分析。结果表明,龙眼DlICE1 cDNA全长为2327 bp,其中开放式阅读框（ORF）序列长1614 bp,共编码537个氨基酸。生物信息学分析表明,龙眼DlICE1编码的蛋白质属于不稳定的弱酸性蛋白,不具有典型的信号肽,且不属于分泌蛋白;亚细胞定位表明其位于细胞核内,与甜橙的同源蛋白亲缘关系最近;实时荧光定量PCR表明,龙眼DlICE1能够有效响应低温胁迫,低温诱导其表达量提高。研究结果显示,龙眼DlICE1基因参与龙眼胚性愈伤组织抗寒过程。     

龙眼古树胚性愈伤组织Dlwrky44基因的克隆及分析

参考龙眼转录组数据库信息,以莆田宝庵寺的龙眼古树“宝树”幼胚诱导的胚性愈伤组织作为试验材料,获得了龙眼古树wrky44基因的全长序列,命名为Dlwrky44,登录号为JF709012,共2313 bp,其中3′UTR458 bp,poly A尾长25 bp,5′UTR 735 bp,并包含1个1119 bp的开放阅读框,编码373个氨基酸.根据推导的氨基酸序列进行生物信息学分析结果表明:D1WRKY44蛋白是不稳定、亲水蛋白;无信号肽和跨膜结构,亚细胞定位于细胞核中;具有2个WRKY结构域,并具有核定位信号,在wrky家族中属第1类.系统进化树分析结果表明:龙眼古树DlWRKY44蛋白与柽柳亲缘关系最近.对龙眼古树EC Dlwrky44基因在不同低温胁迫条件下(0、5、10、15、20、25℃)处理12h的表达进行了分析,结果表明:Dlwrky44基因的表达量随着温度的逐渐降低,表达量逐渐升高,当温度升到15℃时,表达量达到最高.     

龙眼胚性愈伤组织γ-ECS基因的克隆及表达分析

γ-ECS基因编码的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶是细胞内谷胱甘肽（GSH）从头合成的限速酶。以龙眼转录组数据库为基础，采用同源克隆的方法从龙眼胚性愈伤组织中分离得到γ-ECS基因cDNA全长序列，在GenBank上的登录号为JF815477。γ-ECS基因序列全长1 812 bp，包括17 bp 5′UTR及254 bp 3′UTR；ORF长度为1 541 bp编码511个氨基酸。生物信息学分析结果表明，龙眼胚性愈伤组织γ-ECS的核甘酸序列及其推导的氨基酸序列分别与蓖麻、毛果杨等具有较高的同源性；γ-ECS为1个具有跨膜结构的非分泌蛋白，具有亲水性；亚细胞定位于过氧化物酶体，不含信号肽，并存在亮氨酸拉链结构。龙眼胚性愈伤组织γ-ECS基因在龙眼体胚发生过程中的整体表达趋势是先升高，后降低，其表达量在心形胚阶段达到最大值之后在鱼雷形胚阶段急剧下降。γ-ECS基因表达量变化可能与GSH在龙眼体胚发生过程中的含量变化一致。     

夜来香SAMT基因的分离与原核表达

为探究夜来香（Cestrum nocturnum）花香基因SAMT在花香代谢中的调控作用,以花瓣为材料,采用RT-PCR和RACE技术相结合,克隆夜来香SAMT基因的全长cDNA。结果表明：该cDNA的序列长度为1 493 bp,编码365个氨基酸,其中包含1 098 bp ORF、130 bp 5′UTR和265 bp 3′UTR,将其命名为CnSAMT;生物信息学分析结果表明：该基因所编码的氨基酸序列与烟草、番茄的同源性分别为98％和98％,属于甲基转移酶-7家族;原核表达结果表明：CnSAMT的蛋白表达产物约为42 ku,与软件预测的结果大致相同。采用染色体步移技术,克隆夜来香CnSAMT的5′端调控序列,结果表明：该序列长度为993 bp,且该序列除了含有TATA-box、CAAT-box等启动子核心元件外,还含有光、生长素、脱落酸、热胁迫、缺氧胁迫等外界环境条件响应的顺式作用元件。     

龙眼Mn-SOD基因的表达及其启动子功能分析

以龙眼胚性愈伤组织为材料,研究龙眼Mn-SOD基因在应答非生物因子和外源激素处理下的转录情况,并利用烟草瞬时转化法分析其启动子的表达活性。结果表明:龙眼胚性愈伤组织中Mn-SOD基因的表达受到红光和蓝光的抑制;而在白光处理下,Mn-SOD呈现先上升再下降的趋势,在绿光中,则是先下调再上升。在盐胁迫处理下,Mn-SOD基因的表达受到抑制,在蔗糖和不同天数处理中则不受影响。在一定浓度范围内,外源激素IAA、GA3、Me JA、SA和ETH均能诱导或抑制龙眼胚性愈伤组织中Mn-SOD基因的表达,提示其参与外源激素的应答。构建4个不同启动子缺失片段驱动报告基因GUS的植物表达载体并转化烟草。结果表明,龙眼Mn-SOD基因4个不同启动子缺失片段启动GUS基因的能力均低于Ca MV35S启动子,但均可启动GUS基因的表达。瞬时表达和定量表达结果显示,3’缺失的MSD-pro4(-669~-267 bp)启动GUS基因的能力最强,其次为5’缺失的MSD-pro1(-669~-1 bp),最弱的为MSD-pro2(-432~-1bp)和MSD-pro3(-267~-1 bp),提示Mn-SOD启动子-669~-432 bp区段内含有重要的正向顺式调控元件;而-432~-1 bp区段含有负调控元件。     

小麦TaHTAS-5A基因的克隆、表达分析及亚细胞定位

非生物胁迫对小麦的生长发育具有不良影响,克隆与非生物胁迫相关的基因,并对其结构及表达特性进行分析,可以为进一步探索小麦的抗逆机制和抗逆育种奠定基础。本研究利用同源克隆技术从普通小麦品种中国春中克隆了水稻E3泛素连接酶基因OsHTAS的同源基因TaHTAS-5A(GeneBank登录号:MF967573),并利用生物信息学方法对其基因序列特征进行分析;利用qRT-PCR技术对该基因在小麦不同组织及不同逆境胁迫下的表达模式进行分析;同时,对该基因的表达产物进行了亚细胞定位。结果表明,小麦TaHTAS-5A基因含有220bp的5′UTR、1 242bp的ORF以及126bp的3′UTR,共编码413个氨基酸;基因组分析表明,该基因全长3 819bp,共包含4个外显子和3个内含子;缺体-四体定位表明该基因位于小麦5A染色体上;蛋白结构分析显示,TaHTAS-5A蛋白的N端包含四个跨膜结构域,C端包含一个E3泛素连接酶特有的RING finger保守结构域,具有植物E3泛素连接酶的结构特征;qRT-PCR结果显示,TaHTAS-5A对高温、低温和ABA都有响应,对干旱和盐响应不敏感;TaHTAS-5A在小麦的根、茎、叶和幼穗等不同组织中均有表达,但表达量有差异,在叶和穗中的表达量明显高于根部和茎部;亚细胞定位结果表明,TaHTAS-5A位于细胞膜上。本研究为进一步探究小麦TaHTAS-5A基因的功能奠定了基础,也为小麦非生物胁迫抗性改良提供了一定的理论依据。     

番茄泛素活化酶基因家族进化及表达模式分析

泛素活化酶是蛋白泛素化所需的第一个酶,在泛素蛋白酶体途径中发挥重要作用。本文利用生物信息学方法从番茄基因组中鉴定出2个泛素活化酶(ubiquitin activating enzyme,UBA)基因,命名为Sl UBA1和Sl UBA2。序列分析表明Sl UBA1和Sl UBA2基因的CDS序列长分别为3 060和3 255 bp,分别编码1 019和1 084个氨基酸,编码蛋白分子量为114.15和120.46 ku,分别位于第6和9染色体。2个基因均含有5个内含子,编码蛋白均为酸性、疏水性蛋白;对蛋白二级结构分析发现2个UBA蛋白均以α-螺旋和无规则卷曲为主;亚细胞定位预测均定位于细胞核。序列比对和进化树分析表明番茄UBA基因与其他物种UBA基因相似性高,进化过程非常保守。番茄不同组织表达分析结果表明2个UBA基因在根系和花的表达量较高,果实成熟过程中的表达量相对较低。非生物胁迫试验结果表明:Sl UBA1基因在低温、干旱和盐胁迫下均上调表达;而Sl UBA2基因对非生物胁迫没有明显响应,这些结果表明Sl UBA1基因可能参与番茄对低温、干旱和盐胁迫的响应。     

油菜素内酯对低温胁迫下冬小麦 wrab17基因表达的影响

为了探索油菜素内酯（BR）对低温胁迫下 wrab17基因表达模式的影响,以寒地冬小麦品种东农冬麦1号（Dn1）为试验材料,利用qRT-PCR技术克隆得到 wrab17基因的cDNA序列,利用生物信息学方法分析该序列的特征,采用qRT-PCR技术检测低温（5 ℃、0 ℃、-10 ℃、-25 ℃）胁迫下该基因在冬小麦叶片和分蘖节中的表达情况以及BR对 wrab17基因表达量的影响。结果表明, wrab17基因的编码区序列长度为735 bp,包含500 bp的完整开放阅读框,可编码167个氨基酸,属于稳定蛋白质,该蛋白质无跨膜区和信号肽。qRT-PCR分析表明,低温胁迫下对照组和BR处理组的Dn1叶片和分蘖节中, wrab17基因的相对表达量分别在-10 ℃和-25 ℃时最高,且BR处理组 wrab17基因的相对表达量均高于对照组,推测BR可通过提高 wrab17基因的表达量来增强冬小麦的抗寒能力。     

野生蕉（Musa spp.，AB group）抗寒基因FAD7的分子克隆与功能分析

以福州旗山国家森林公园野生蕉（Musa spp.,AB group）和福建地方著名栽培品种天宝蕉（Musa acuminata,AAA group）叶片为材料,克隆获得ω-3脂肪酸去饱和酶基因FAD7,并对其 cDNA序列进行生物信息学分析;同时,进行了低温胁迫下FAD7转录水平变化的研究。结果表明,旗山野生蕉FAD7（命名为Mu-FAD7-1,GenBank登录号为JX911314）和天宝蕉FAD7（命名为Ma-FAD7-1,GenBank登录号为KF011506）ORF均为1 371 bp,编码456个氨基酸,两者共有22个差异碱基和10个差异氨基酸残基;生物信息学预测显示,香蕉FAD7编码蛋白为亲水性,不含信号肽,定位于叶绿体;在不同低温胁迫下,天宝蕉Ma-FAD7-1转录水平变化小,而旗山野生蕉Mu-FAD7-1在普通香蕉停止的生长临界温度13 ℃时表达量显著升高,并达到峰值,降至4 ℃时仍然维持较高水平,进一步验证了野生蕉FAD7可能具有抗寒基因的功能。     

龙眼生长素受体基因TIR1的克隆及表达分析

为进一步明确龙眼生长素受体基因TIR1的结构和功能,本试验采用RT-PCR和RACE-PCR对龙眼胚性愈伤组织2个TIR1基因(分别命名Dl TIR1-1和Dl TIR1-2)进行克隆,并进行生物信息学和表达分析。研究结果表明:Dl TIR1-1全长4 343 bp,包含ORF 1 755 bp,编码584个氨基酸(Gen Bank登录号:KR558759),而Dl TIR1-2全长2 821 bp,包含ORF 1 926 bp,编码641个氨基酸(Gen Bank登录号:KR558760)。生物信息学分析结果表明,Dl TIR1-1和Dl TIR1-2理化性质较为一致,均属于不稳定蛋白,不含信号肽,具有跨膜螺旋;亚细胞定位于细胞质中,分别含有31个和45个蛋白磷酸化位点;系统进化树分析显示,Dl TIR1-1与十字花科的亚麻荠和甜菜处于同一分支,而Dl TIR1-2与甜橙和胡杨等木本植物保持较近的遗传距离。q PCR结果表明,Dl TIR1-1和Dl TIR1-2在龙眼体胚发生过程中和不同组织器官中的表达模式较为一致,且在非胚性愈伤组织、根和花中表达量最高;此外,在一定的浓度范围内,IAA、ETH、ABA和GA3均能适当提高龙眼TIR1的表达量,而添加Me JA却明显抑制TIR1的转录。上述结果表明,Dl TIR1-1和Dl TIR1-2可能具有相似功能,且均参与龙眼非胚性愈伤组织形成、根系分化以及花器官发育,此外龙眼生长素信号转导途径可能受多种植物激素调控。     

低温贮藏对‘松风本’龙眼果实品质和耐贮性的影响

本文以‘松风本’龙眼果实为试验材料,研究贮藏温度对龙眼果实贮藏品质和耐贮性的影响。采后龙眼果实经过挑选、清洗等预处理后晾干,用聚乙烯保鲜袋（0.015 mm厚）包装,分别置于室温(25±0.5)℃和低温(3±0.5)℃下贮藏。贮藏期间定期取样测定龙眼果实的营养品质和耐贮性指标。结果表明：与(25±0.5)℃室温贮藏相比,(3±0.5)℃低温贮藏可以有效延缓龙眼果实采后呼吸强度,保持较高的果皮色素（叶绿素、类胡萝卜素、花色素苷、类黄酮）含量和果肉营养物质（可溶性固形物、可溶性总糖、蔗糖、还原糖、维生素C）含量。此外,(3±0.5)℃低温贮藏还能延缓采后龙眼果肉自溶和果皮褐变,以及抑制龙眼果实失重率的升高,维持较高的龙眼果实商品率。据此认为,(3±0.5)℃可以作为‘松风本’龙眼果实低温贮运的推荐温度条件,以保持‘松风本’龙眼果实的贮藏品质和延长其保鲜期。     

龙眼体胚Myb转录因子基因的克隆及序列分析

以龙眼同步化调控的鱼雷形胚为材料,设计特异上下游引物,采用RT-PCR法,获得了797 bp的基因序列。通过NC-BI的BLAST软件进行核苷酸序列和氨基酸序列的同源性搜索及相似度分析,结果表明,所获得的核苷酸序列和翻译的氨基酸序列与其他物种的Myb转录因子有较高的同源性,推断该基因序列属于龙眼Myb转录因子基因。已在GenBank登录,登录号为HQ661039。     

温度和供氮形态对龙眼吸收氮素动力学的影响

研究龙眼幼苗在不同温度（10、15、20、25、30、35℃）和不同氮营养（硝态氮、3/4硝态氮+1/4铵态氮、1/2硝态氮+1/2铵态氮、1/4硝态氮+3/4铵态氮、铵态氮）供应条件下吸收氮素的动力学特征,比较龙眼吸氮能力变化,并探讨龙眼对氮形态的偏好性,为龙眼不同季节（物候期）选择适用氮肥形态提供依据。结果显示,温度和供氮形态对龙眼吸氮能力有显著影响（P<0.05）。在中低温度（10~25℃）等量供应硝态氮和铵态氮条件下,龙眼根系吸收氮素（硝态氮和铵态氮之和）的最大吸收速率（I_max）最高或较高,而亲和力（Am）和离子吸收补偿点（C_min）则随温度和氮形态变化不大,故此时龙眼吸氮能力强。在高温（30℃）且仅供应铵态氮时,根系具有最高I_max和A_m,同时C_min最低,最有利于龙眼吸氮。在极端高温（35℃）时将铵态氮和硝态氮以3∶1的比例配合供应,则I_max最高,A_m较高且C_min较低,有利龙眼对氮素的吸收。另外,等量硝态氮和铵态氮共存条件下,龙眼在低温（10~15℃）时吸收铵态氮的I_max更高、A_m更强而且C_min更低,明显偏好铵态氮;在中高温（20~35℃）时吸收硝态氮的I_max更高,但A_m更弱且C_min更高,对氮形态的偏好性不明显。对照华南龙眼生长物候期,建议在龙眼秋梢生长期施用铵态氮为主、硝态氮为辅;在花前至小果期可以1∶1的比例施用硝态氮和铵态氮;在果实膨大期,可全部施用铵态氮或以3∶1的比例施入铵态氮和硝态氮。     

不同保鲜薄膜袋包装对‘松风本’龙眼果实低温贮藏效果的影响

以福建省晚熟龙眼品种‘松风本’龙眼果实为材料,研究微孔复合保鲜薄膜袋、高密度聚乙烯薄膜袋、普通聚乙烯薄膜袋等3种保鲜薄膜袋包装对龙眼果实在（5±1）℃下低温贮藏效果的影响。结果表明：微孔复合保鲜薄膜袋内较高的O2含量可明显改善龙眼果实外观品质,保持较高的龙眼果肉可溶性固形物、可滴定酸和维生素C等营养物质含量;高密度聚乙烯薄膜袋内较高的CO2含量能延缓龙眼果肉自溶和果实病害发生,但果肉乙醇含量积累会影响龙眼果实品质,加速龙眼果实果皮褐变;普通聚乙烯薄膜袋内的O2含量最低而CO2含量最高,会导致果肉乙醇含量积累过多、果实发病率最高和好果率最低。综合结果可知,3种保鲜薄膜袋包装对‘松风本’龙眼果实在（5±1）℃低温下贮藏保鲜效果为微孔复合保鲜薄膜袋＞高密度聚乙烯薄膜袋＞普通聚乙烯薄膜袋。     

龙眼成花与氧化损伤的关系探讨

以储良龙眼为试材,通过分析低温诱导、氧化胁迫、自然低温+药剂处理龙眼成化过程中氧化损伤各指标变化,研究龙眼成花和氧化胁迫之间的相关性。结果表明,氧化胁迫有利于龙眼成花。对顶芽和叶片活性氧、抗坏血酸和丙二醛(MDA)含量的检测结果也表明,氧化胁迫诱导龙眼成花的同时,也导致了龙眼树各组织活性氧的累积,且抗坏血酸抑制龙眼成花,MDA促进龙眼成花。因此认为活性氧与龙眼成花呈正相关。     

不同低温胁迫条件下胡椒叶片生理生化及结构分析

以中国胡椒主栽品种热引1号胡椒为材料,设置5个不同温度处理,分别为CK(30℃/28℃)、4、6、8、10℃,分别处理0、24、48、72 h后,对其在不同温度和时期处理下叶片的寒害表现、生理生化和解剖结构进行分析。结果表明:随温度降低和处理时间的延长,植株寒害程度不断加剧。低温胁迫下热引1号胡椒POD、CAT、SOD活性均显著高于CK,POD活性上升的幅度最大,SOD活性上升幅度最小,SOD防御系统低温耐受时间更长;可溶性蛋白和可溶性糖含量在10℃胁迫条件显著高于其他处理;胡椒丙二醛和脯氨酸含量在温度达到4℃时才有显著增加。石蜡切片结果表明,随着胁迫温度的降低,胡椒叶片厚度逐渐减小,胡椒栅栏组织厚度和CTR值能够反映其受寒害程度。本研究结果为筛选优异抗寒种质提供参考,并为开展胡椒抗寒分子机理研究提供依据。