海南番木瓜PRSV和PLDMV病毒发生情况及分子鉴定

对海南昌江、乐东、澄迈、文昌和三亚5个主要番木瓜产区的病毒病发生情况进行调查。对76份番木瓜疑似病毒样品进行检测,检测结果表明海南番木瓜病毒病主要有2种：由番木瓜环斑病毒（Papaya ring spot virus,PRSV）引起的番木瓜环斑病毒病和由番木瓜畸形花叶病毒（Papaya leaf-distortion mosaic virus,PLDMV）引起的番木瓜畸形花叶病毒病。其中,番木瓜环斑病毒病最为常见,检出率达77.63％,是影响海南地区番木瓜产业健康发展的主要病毒病;畸形花叶病毒病发生率很低,仅检出2例番木瓜畸形花叶病毒病样品。以PRSV病毒基因组P1和Hc-Pro作为靶标基因进行分子克隆、测序,结果表明海南地区PRSV病毒可明显分为2个株系：HN-PRSV-1株系和HN-PRSV-2株系。此外,基于CP基因的系统进化树分析结果表明在海南新发现的PLDMV病毒可能源于台湾和日本。本研究可为开展番木瓜花叶病的防控和创制抗花叶病毒番木瓜新种质提供数据参考。     

海南地区番木瓜畸形花叶病毒的发现与鉴定

利用马铃薯Y病毒属的简并引物对3个海南感病番木瓜植株的叶片进行RT-PCR检测,并将其克隆到T载体上进行测序和BLAST分析。结果表明：均获得了大小约1 700 bp的特异性条带,与预期大小基本一致;所得序列与GenBank中收录的番木瓜畸形花叶病毒（Papaya leaf distortion mosaic virus,PLDMV）基因序列相似性达到88％～96％,序列包含部分NIb蛋白基因、外壳蛋白（CP）基因和3′端非编码区。这是首次报道在中国海南地区发现番木瓜感染了PLDMV。但是仅基于PLDMV外壳蛋白基因的系统进化分析结果还不足以证明在海南发现的PLDMV与其他地区的某一PLDMV株系为同一进化簇。     

利用PLDMV/Twin-Strep侵染性克隆纯化HC-Pro病毒蛋白

番木瓜畸形花叶病毒(Papaya leaf distortion mosaic virus,PLDMV)是一种新的潜在威胁番木瓜种植业的病毒,其辅助成分蛋白酶(helper component-proteinase,HC-Pro)是PLDMV编码参与病毒复制、运动、寄主植物症状表现的多功能蛋白,因此纯化获得具有功能活性...     

原核表达dsRNA抗番木瓜畸形花叶病毒的研究

番木瓜畸形花叶病毒(Papaya leaf distortion mosaic virus,PLDMV)是一种已对番木瓜种植业构成潜在威胁的新型病害,在转基因植物备受争议的背景下,利用原核表达的dsRNA来防控病毒的策略不失为一种新的选择。本文选取PLDMV CP基因全长(879 bp),运用OZ-LIC法构建了含有pdk内含子的ihpRNA结构,将其嵌入原核表达载体pSP73中,并转化RNaseⅢ缺陷型大肠杆菌M-Jm109LacY,构建了1种能高表达dsRNA的原核表达菌株M-Jm109LacY-CP879,以终浓度为0.4 mmol/L IPTG诱导后能够稳定高效的表达CP879-dsRNA。研究共设2个处理:保护性处理与治疗性处理。分别用含有CP879-dsRNA的粗提液对这2个处理的番木瓜植株进行喷施处理,通过统计发病率、观察病症变化以及ELISA分析结果表明,保护性处理能有效抑制番木瓜畸形花叶病毒的侵染,主要表现为发病时间推迟和相对较低的发病率;治疗性处理植株的病毒积累量会在喷施后第3~12天内出现暂时性的降低。结果表明,保护效果优于治疗效果,若每月喷施2~3次dsRNA粗提液,有望能够有效地预防PLDMV的侵染。     

利用ID-ELISA技术调查分析海南3种主要番木瓜病毒分布及感病情况

利用PCR方法分别扩增番木瓜环斑病毒（papaya ringspot virus,PRSV）、番木瓜畸形花叶病毒（papaya leaf distortion mosaic virus,PLDMV）和番木瓜花叶病（papaya mosaic virus,PaMV）的外壳蛋白（coat protein,CP）基因,并连接到原核表达载体pET-28a上,获得重组质粒pET28-PRSV-CP、pET28-PLDMV-CP和pET28-PaMV-CP,通过转化、诱导表达后,经SDS-PAGE分析显示,这3种CP蛋白在大肠杆菌中高效表达,其中PRSV CP蛋白和PLDMV CP以包涵体形式存在,PaMV CP以可溶蛋白形式存在。利用Ni2+-NTA琼脂糖亲和层析纯化获得了3种病毒的重组CP蛋白,并免疫大白兔获得高效价的抗体。Western blot检测结果表明,这3种抗血清与对应的诱导表达蛋白发生特异反应。再采用抗血清建立一种快捷、简便和低成本的ID-ELISA（Indirect enzyme-linked immunosorbent assay）技术,并利用此技术对海南岛283个疑似感病的番木瓜样品进行检测鉴别,初步掌握了海南岛3种主要番木瓜病毒的分布及感病情况,为下一步该病的有效防治策略提供科学依据。     

番木瓜镁离子转运蛋白基因CpMGT1的克隆与功能分析

镁是一种大量金属营养元素,其在植物的生长、发育、光合、胁迫响应等生物学过程中起重要作用。在高等植物中,Mg²⁺的吸收、运输、分布和再分配主要由镁离子转运蛋白（MGT/MRS2）和Mg²⁺/H⁺交换体（MHX）介导。其中,MGT/MRS2又名CorA,最先在鼠伤寒沙门氏菌中被发现,后在拟南芥、水稻等模式植物中进行了较为深入的研究。番木瓜（Carica papaya L.）是一种隶属于十字花目番木瓜科的重要热带果树,至今还未见有关MGT基因的报道。本研究基于番木瓜的基因组和转录组数据,采用RT-PCR技术成功克隆到一个MGT基因（CpMGT1）,应用生物信息学手段预测蛋白的理化特性和保守基序,运用qRT-PCR分析基因的表达模式,利用缺失CorA、MgtA和MgtB的沙门氏菌突变株MM281进行功能互补。结果表明：CpMGT1的编码区为1332 bp,预测编码443 aa,理论分子量为50.43 kDa、等电点为5.12;该蛋白含有2个疏水跨膜区（TM1和TM2）,其中TM1包含高度保守的GMN基序;进化及亚细胞定位分析表明CpMGT1与拟南芥中AtMGT1和AtMGT2的亲缘关系较近,定位于细胞膜;定量分析显示CpMGT1基因为组成型表达,其中在根、茎和果实中的表达量较高;在MM281中异源表达可显著提高工程菌在低Mg²⁺浓度下的生长速率,表明CpMGT1具有高效的Mg²⁺转运活性。CpMGT1的克隆与鉴定为进一步揭示番木瓜MGT基因在不同组织特别是在果实中Mg²⁺的积累机制奠定了坚实的基础。     

一种E.coli-Free的酵母同源重组系统稳定快速构建PLDMV侵染性克隆的新方法

侵染性克隆是研究病毒的重要工具,而偏大的病毒基因组及其在大肠杆菌中的不稳定给构建侵染性克隆造成很大困难。通常采用插入内含子和酵母同源重组等方式可以获得稳定克隆,但本实验最初利用酵母同源重组系统并未成功构建番木瓜畸形花叶病毒(PLDMV)的侵染性克隆。经研究证实,该不稳定现象确实存在于大肠杆菌中,而非酵母和农杆菌细胞。通过改良酵母同源重组方法,成功构建了有/无内含子intron 2的PLDMV侵染性克隆p35S-FL和p35S-FL-In2,农杆菌注射接种番木瓜均发病,侵染效率达64.7%~69.7%。本研究通过酵母同源重组质粒直接转化农杆菌,建立了一种10 d内即可稳定快速构建PLDMV侵染性克隆的E.coli-Free酵母同源重组新方法。该方法对其他在大肠杆菌中不稳定的植物病毒侵染性克隆的构建具有重要意义。     

混合感染番木瓜PRSV/PLDMV株系基因组全长cDNA的克隆和实时荧光定量PCR分析

番木瓜环斑病毒(Papaya ringspot virus,PRSV)与番木瓜畸形花叶病毒(Papaya leaf distortion mosaic virus,PLDMV)存在混合感染的现象,近年来混合感染发病率逐年递增,是一种新的威胁番木瓜种植业的病毒病害。运用RT-PCR和RACE方法从混合感染样品中克隆获得2种病毒基因组全长c DNA,分别命名为PRSV-LM和PLDMV-LM,Gen Bank登录号分别为KT633943和KT633944,基因组序列大小分别为10 325、10 153 nt(不包括3′端的poly A)。序列分析表明:PRSV-LM与单独感染样品中的PRSV海南分离物HN(Gen Bank登录号:EF183499)的核苷酸序列和氨基酸序列相似性最高,为94%;PLDMV-LM与单独感染样品中的PLDMV海南分离物Hainan-DF(Gen Bank登录号:JX974555)核苷酸和氨基酸序列相似性最高,分别高达99%和97%。进化树分析显示,PRSV-LM和PLDMV-LM分别与单独感染样品的PRSV和PLDMV海南分离物有共同的进化起源。进一步利用实时荧光定量PCR对混合感染样品的PRSV与PLDMV病毒积累量进行分析,结果表明,混合感染样品中PLDMV病毒积累量大约是PRSV含量的100倍。研究结果为进一步探究PRSV/PLDMV混合感染发病机制奠定基础。     

玉米DUF1685基因家族的鉴定和进化分析

本研究共鉴定出16个单、双子叶植物和卷柏的211个DUF1685基因家族成员。蛋白理化性质分析表明,211个DUF1685s基因的氨基酸序列长度为83~1071 aa,分子量为9.2~116.3 kDa,理论等电点为3.66~11.90。系统发育进化分析表明,DUF1685基因家族被划分了3个亚家族（Class I、Class II和Class III）,Class I和Class II亚家族产生A1和A2、B1和B2的事件发生在单、双子叶植物分化后,同时A1和B2分支（成员均为双子叶植物基因）出现了基因扩张现象。保守基序和基因结构分析结果表明,同一亚家族成员之间保守基序相似,211个DUF1685基因家族成员中大部分含有1个内含子,少部分基因含有2个及以上内含子或者不含内含子。选择压分析表明,DUF1685基因家族在进化过程中相关位点受到正向选择,这可能是导致部分基因发生功能变化的原因。共线性分析表明,片段复制事件可能是玉米DUF1685基因扩增和进化的潜在驱动力。基因启动子区域顺式元件分析结果表明,玉米DUF1685基因启动子区域含有光响应元件、ABA和非生物胁迫相关的顺式作用元件,推测这些基因可能参与玉米对非生物胁迫的响应。转录组数据分析表明,玉米DUF1685基因与特定组织（成熟花粉）的生长发育相关。本研究从多方面探究了玉米DUF1685基因家族的功能和进化情况,以期为今后深入研究玉米DUF1685基因生物学功能和进化关系提供理论参考。     

番木瓜环斑病毒弱毒株的构建及分析

弱毒株是利用交叉保护防治植物病毒病害的关键限制因子。通过对马铃薯Y病毒属病毒(强、弱毒株)的全长及部分氨基酸序列比对分析,筛选出在亲本强毒株PRSV-LM的P1和HC-Pro基因上的8个可能与致病性相关的氨基酸突变位点(I_(309)、K_(481)、K_(598)、R_(728)、F_(753)、L_(754)、N_(787)和D_(944))。采用定点突变和Gibson拼接法,分别成功构建了4种含有2个突变位点(L_(754)和N_(787))、4个突变位点(I_(309)、K_(481)、F_(753)和D_(944))、6个突变位点(I_(309)、K_(481)、F_(753)、L_(754)、N_(787)和D_(944))和8个突变位点(I_(309)、K_(481)、K_(598)、R_(728)、F_(753)、L_(754)、N_(787)和D_(944))的PRSV-LM全长c DNA侵染性克隆突变体:p Gprsvm~2、p Gprsvm4、p Gprsvm6和p Gprsvm8。经人工接种、病症观察和RT-PCR检测,4种突变体克隆均能系统性侵染非转基因番木瓜植株,除克隆p Gprsvm~2的病症表现与亲本强毒株PRSV-LM一致外,其他多位点突变的克隆p Gprsvm4、p Gprsvm6和p Gprsvm8在番木瓜植株上的病症严重程度出现依次减弱,而克隆p Gprsvm8的病症最弱,且延迟2周发病。本实验初步验证了6个氨基酸突变位点(I_(309)→S、K_(481)→Q、K_(598)→E、F_(753)→L、R_(728)→I和D_(944)→N)与PRSV-LM的病症表现及致病力相关,其中K_(598)→E和R_(728)→I可能是影响致病性的关键位点。     

番木瓜畸型花叶病毒(PLDMV)调查鉴定

对采自广州、景洪（云南）、海口（海南）的各１７,２４,１３个番木瓜样品进行ＤＡＳ－ＥＬＩＳＡ、ＲＴ－ＰＣＲ和生物测定等分析鉴定,发现来自广州和海口的样品中有２１个样品感染番木瓜环斑病毒（ＰＲＳＶ）,而来自景洪的样品中未发现感染ＰＲＳＶ,在所有样品中都未发现感染有番木瓜畸型花叶病毒的。      

基于RNAi抗PRSV番木瓜株系的培育及其分子特征验证

根据RNAi原理构建的抗海南番木瓜环斑病毒(PRSV)植物表达载体p CAMBIA2300-35S-CP-RNAi-OCS,通过基因枪法将载体导入番木瓜的愈伤组织中,经卡那霉素抗性筛选后再分化成为植株。描述转化植株的分子特征同时进行抗病毒试验分析其抗病性。实验结果显示:转基因株系474为单拷贝插入的杂合子,插入位点在第7号染色体supercontig_61的717 141位置;抗病毒试验中,在接种病毒后28 d内非转基因株系1280有高浓度的病毒积累并很快表现出明显的病症,而转基因株系474基本无病毒积累且无发病症状。表明转基因株系474具有较好的PRSV抗性,有待于进一步田间试验。     

番木瓜β-Gal基因的克隆分析与植物表达载体构建

番木瓜果实采后贮藏期间的迅速软化与β-Gal基因的表达密切相关。利用常规PCR结合反向PCR技术,分离了一条4501bp的番木瓜β-Gal基因组序列。其共含有17个内含子,外显子部分与相应的cDNA序列只有1个碱基的差异。生物信息学分析结果表明,该番木瓜β-GAL属于糖苷水解酶超级家族42中家族35的成员,在进化过程中与拟南芥的亲缘关系较近,与鳄梨和北美云杉则较远。同时,它还具有一段定位于胞外的信号肽,再次表明其可能参与了果肉细胞壁的降解和果实软化。进一步分离了β-Gal基因启动子,初步验证了其果实表达特异性。将该启动子替换载体p2301/TTRG上的CaMV 35S启动子,构建出RNAi-β-Gal双T-DNA植物表达载体。酶切分析和PCR检测结果表明,载体p2301/BPTTRG已被成功导入农杆菌,可用于后续的遗传转化研究。     

MicroRNA用于创制抗PRSV番木瓜新种质的展望

微小RNA(microRNA, miRNA)是真核生物体内调控基因表达的一类非常重要的小分子RNA,在植物逆境适应过程中发挥着重要的作用。总结番木瓜环斑病毒(papaya ring spot virus, PRSV)致病机理研究的最新进展,探讨miRNA在植物抗病毒中的研究进展和应用前景,提出研究番木瓜miRNA参与抗PRSV机制的途径,为开展番木瓜miRNA研究和创制抗PRSV番木瓜新种质提供理论参考。     

番木瓜环斑病毒海南株系植物RNAi表达载体的构建

为研究广谱抗环斑病毒（PRSV）海南株系转基因番木瓜育种方案,采集海南番木瓜各主要种植区的PRSV株系,以外壳蛋白（CP）、辅助成分－蛋白酶（HC-Pro）和复制酶（Nib）基因作为靶标基因,通过序列比对和运用Clustalx软件分析,得到干扰基因的保守区域和挑选出海南PRSV典型株系的代表样品。以pUCCRNAi为骨架质粒,利用代表样品的CP、NIb、Hc-Pro基因片断保守序列构建RNAi发夹结构,将发夹结构导入pCAMBIA2300-35S-OCS植物表达载体,构建出抗PRSV植物表达载体pCAMBIA2300-35S-CP-RNAi-OCS、pCAMBIA230035S-Hc-Pro-RNAi-OCS、pCAMBIA2300-35S-NIb-RNAi-OCS。实验将PRSV不同株系保守序列的分析与RNAi的高效抗病设计理念相结合,可用于创造高效、广谱抗PRSV病毒病的新种质。     

PRSV运动相关病毒蛋白的Sos恢复系统诱饵载体构建及自激活效应检测

为研究与番木瓜环斑病毒运动相关的病毒蛋白(CP、HC-Pro、CI)互作的寄主因子,构建以Sos恢复系统为原理的胞质酵母双杂交系统的3个病毒蛋白诱饵载体,并检测其自激活作用来验证是否适用于后续的文库筛选.通过RT-PCR从番木瓜环斑病毒海南分离物中扩增出这3个病毒蛋白的片段,按正确方向将目标片段分别插入诱饵载体pSos中,并将重组质粒导入酵母温度敏感酵母菌株cdc25H,检测其表达产物对酵母Sos恢复系统Ras信号通路的激活作用而产生的细胞温敏特性影响.结果表明,这3个含番木瓜环斑病毒运动相关的病毒蛋白的诱饵载体构建正确,对酵母菌株cdc25H的Sos恢复系统无激活作用,激活试验为阴性.