巴西橡胶树14-3-3蛋白基因的克隆及表达分析

根据在巴西橡胶树幼态无性系与老态无性系胶乳之间差异表达的一个SSH片段序列信息设计引物,通过RACE技术获得了2个编码14-3-3蛋白的cDNA,命名为Hb14-3-3a和Hb14-3-3b。序列分析表明,Hb14-3-3a和Hb14-3-3b基因长度分别为1 154、1 050 bp,分别编码252、263个氨基酸,分子量为61.7 Ku和64.7 Ku,等电点为5.51和5.14。Hb14-3-3a/b基因在所检测的组织中均有表达,但Hb14-3-3a和Hb14-3-3b的表达模式不一样,Hb14-3-3a在树皮中表达量最高,而Hb14-3-3b在叶中表达量最高。     

香蕉果实的1个14-3-3蛋白同源基因的克隆及序列分析(简报)

根据在香蕉果实抑制缩减文库中获得的1个14-3-3蛋白基因片段,采用PCR和RACE相结合的方法从香蕉(Musa acuminate L.AAA group cv.Brazilian)cDNA文库中筛选到其全长cDNA序列.序列测定和Blastx比对分析结果表明,该cDNA全长1 037 bp,含有1个完整的阅读框,其编码区编码261个氨基酸残基,具有植物14-3-3蛋白基因的保守结构域,并与其他植物来源的14-3-3蛋白具有很高的同源性,将其命名为Ma-14-3-36(Musa acuminate 14-3-3).采用遗传进化系统发育树的分析结果表明,Ma-14-3-36与来源于单子叶植物的多数14-3-3蛋白基因序列在同一个进化枝上.采用RT-PCR对其在香蕉果实发育不同时期的表达进行分析结果表明,在香蕉果实发育的不同时期差异表达,推测其可能在果实的发育中起作用.     

香蕉多酚氧化酶成熟蛋白的原核表达

笔者所在课题组从巴西香蕉中分离到1个PPO基因全长,并进行了原核表达,但结果未表达出目的蛋白。鉴于上述情况,笔者对香蕉PPO全蛋白进行转移肽分析,结果发现其N端含有转移肽,长度为47个氨基酸。切除转移肽并进行香蕉PPO成熟蛋白原核表达,SDS-PAGE电泳检测结果表明,在62 ku处有一条特异的蛋白条带,与预测大小相符;并且进行质谱分析,结果确定重组表达蛋白为香蕉PPO,初步说明转移肽对香蕉PPO体外表达的影响,为进一步研究香蕉PPO功能及在香蕉褐变生理和调控机制中的作用提供理论基础。     

3个香蕉品种黄酮含量与果实发育成熟的关系

为了明确香蕉果实发育及成熟过程中黄酮含量变化规律,对巴西香蕉、粉蕉和皇帝蕉果实采前发育和采后成熟过程中的黄酮含量进行测定。结果表明:3个香蕉品种在果实发育成熟过程中果皮中黄酮含量均显著高于果肉中黄酮含量。从抽蕾、断蕾到采收,3个品种果皮中的黄酮含量逐渐降低,表现出与发育负相关。采前巴西蕉和黄帝蕉果肉中黄酮含量也是逐渐降低,但粉蕉果肉中黄酮含量呈先升后降的趋势。在采后成熟过程中,3个香蕉品种果皮果肉中的黄酮含量逐渐升高。且用外源乙烯和1-MCP处理后发现,香蕉果皮和果肉中的黄酮含量明显受外源乙烯诱导而增加,受1-MCP的抑制而减少,表现出与成熟正相关。     

香蕉果实发育成熟过程中多酚物质的变化规律

以3个香蕉品种‘巴西蕉’‘粉蕉’‘皇帝蕉’为供试材料,利用福林酚法测定其整个生育及成熟期果皮、果肉的多酚含量,探索不同香蕉品种在发育成熟过程中的多酚含量变化规律,及其与果实发育成熟的关系。结果显示,在香蕉果实整个生育期,多酚物质含量果皮均大于果肉。多酚物质在香蕉果皮、果肉生长发育期迅速积累,到采收期下降,采后果皮多酚物质含量随着成熟度的增加而增加,而果肉多酚物质基本维持不变。用外源乙烯和1-MCP处理后发现,与对照果实相比,乙烯促进其多酚物质的积累,而1-MCP抑制其积累。     

龙眼14-3-3基因及其启动子的克隆以及在体胚发生过程中的表达分析

分离克隆龙眼(Dimocarpus longan Lour.)胚性愈伤组织14-3-3基因,并分析该基因在龙眼体胚发生过程中的表达情况。采用RT-PCR结合RACE法,获得龙眼胚性愈伤组织14-3-3基因的cDNA全长序列和DNA序列,采用TAIL-PCR法,获得龙眼胚性愈伤组织14-3-3基因的启动子DNA序列,运用生物信息学方法对序列进行分析,并通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)研究该基因在龙眼体胚发生过程中的表达。结果表明:经克隆得到龙眼胚性愈伤组织14-3-3基因786 bp的cDNA全长序列(GenBank检索号为GU573765),该cDNA开放阅读框推定的氨基酸序列(含261个氨基酸)与其它植物14-3-3具有较高同源性;该基因的DNA序列(GenBank检索号为GU573766)长为1 859 bp,包含3个内含子,内含子的剪切位点均符合真核生物"GT-AG"规则;该基因的启动子DNA序列(GenBank检索号为GU573766)长为910 bp;该基因在龙眼体胚各阶段均有表达,其中在松散型胚性愈伤组织阶段和心形胚及鱼雷形胚阶段呈现高表达,整个变化趋势呈"倒S"状。     

与甘蔗抗黑穗病性相关的14-3-3基因的克隆和表达分析

为了解14-3-3基因在甘蔗黑穗病抗性中的作用,本研究以课题组前期构建的甘蔗抗黑穗病抑制消减杂交文库中筛选出的1个与14-3-3基因同源的EST序列作为探针,利用电子克隆和RT-PCR方法从甘蔗ROC22品种中分离到1个Sc14-3-3基因(Gen Bank Accession Number:KJ577592),并对其序列信息和基因表达情况进行分析。结果显示,该基因ORF长771 bp,编码256个氨基酸残基;Sc14-3-3是定位于细胞质的亲水蛋白,无跨膜螺旋区及信号肽,有10个Ser、3个Thr和7个Tyr潜在的磷酸化位点,并在N-端有4个蛋白结合区和1个多核苷酸结合区,对翻译和能量新陈代谢起着重要作用;该蛋白属非ε类群,其N-端和中间区域在不同物种间相对保守,C-端差异相对较大。基因表达模式分析显示,Sc14-3-3基因可能参与甘蔗对生物逆境的细胞免疫响应,其对Me JA介导的信号途径应答较SA和ABA早;黑穗病菌胁迫下,Sc14-3-3基因在甘蔗抗感品种中的表达模式存在差异,其在抗黑穗病品种YC05-179中上调表达且表达量变化明显,揭示了该基因参与甘蔗对黑穗病的应答反应。以上结果为甘蔗Sc14-3-3基因的功能研究积累了一定的基础资料,并为今后甘蔗的抗病分子育种提供后备基因资源。     

花生14-3-3基因家族的生物信息学分析

14-3-3是一类广泛存在于真核生物细胞内的多基因家族蛋白,在植物信号传导、生长发育及抗逆胁迫反应中发挥重要作用。本文通过隐马尔柯夫模型(Hidden Markov Model,HMM),对野生花生（Arachis duranensis和Arachis ipaensis）基因组的蛋白质数据库进行搜索,获得Ad14-3-3基因家族成员14个,Ai14-3-3基因家族成员13个。进化树分析显示其主要分为ε类和非ε类,其中Ad14-3-3家族包含6个ε类和8个非ε类;Ai14-3-3家族包含了7个ε类和6个非ε类成员。进一步对该基因家族的理化性质、基因定位、基因结构及上游调控序列进行分析预测。结果显示, Ad14-3-3和Ai14-3-3基因家族的染色体定位相似,在1和6号染色体没有定位,在4和7号染色体上各有3个家族成员。花生中的14-3-3基因家族高度保守,ε类14-3-3蛋白主要包含6外显子,非ε类14-3-3蛋白主要包含3-4个外显子,ε类与非ε类14-3-3蛋白的保守基序存在显著区别。上游调控序列预测分析表明,花生14-3-3蛋白存在大量的激素及逆境胁迫应答元件,预示着该基因家族参与花生的生理及逆境胁迫反应。 （１．山东省花生研究所,山东青岛,２６６１００;２．哈尔滨工业大学环境学院,黑龙江哈尔滨,１５０００１）     

香蕉中2条MaMLO基因的克隆及表达分析

MLO基因是一类植物特有的抗病基因,为了研究香蕉MLO基因在香蕉抗枯萎病中的作用,利用RACE技术从香蕉中克隆获得了香蕉2条MLO基因,分别命名为MaMLO1和MaMLO2。序列分析表明,MaMLO1的开放阅读框为1 473 bp,编码490个氨基酸;MaMLO2的开放阅读框为1 689 bp,编码562个氨基酸。系统进化树分析表明,MaMLO1与已登录的香蕉MLO1(XP_009413424)亲缘关系较近,MaMLO2与已登录的香蕉MLO6(XP_009411538)亲缘关系较近。组织特异性研究表明,这2个基因在香蕉各器官中均有表达,但MaMLO2在根中的表达量最大。不同激素处理下的研究表明,MaMLO1受ABA、乙烯和水杨酸诱导上调表达,受茉莉酸诱导下调表达;MaMLO2受ABA、乙烯、水杨酸和茉莉酸4种激素诱导上调表达。在感病品种中2个基因均是下调表达,在抗病品种中均是上调表达。结果表明,克隆到的2条MLO在感病品种中没有参与到香蕉抗枯萎病的过程,而在抗病品种中参与了香蕉抗枯萎病的过程。     

HXKs基因在香蕉果实后熟过程中功能初探

香蕉是世界主要水果之一,对乙烯非常敏感,属于呼吸跃变型果实。目前,香蕉果实后熟机理还未完全探明,后熟过程中己糖激酶(HXK)与乙烯的关系还不清楚。通过BLAST比对从香蕉基因组数据库中发现HXK基因家族的11个成员,经克隆获得这些基因的序列,并研究HXKs基因在香蕉果实自然后熟过程中的转录表达谱,重点研究乙烯利、甘露糖、NAG和1-MCP对HXKs基因表达、HXK酶活和内源乙烯生物合成的影响。结果表明:在香蕉果实后熟过程中HXKs基因呈现差异性表达,乙烯利上调大多数HXKs基因的表达和HXK酶活,1-MCP的作用正好相反,这表明外源乙烯正作用于HXK。另一方面,甘露糖加快内源乙烯生物合成,NAG却推迟内源乙烯生物合成,这说明HXK正作用于内源乙烯生物合成。所以,在香蕉果实后熟过程中乙烯和HXK之间存在相互促进的关系。这将为进一步阐明香蕉果实后熟机制提供理论依据,也将为香蕉果实保鲜新技术的挖掘提供新思路。     

6个香蕉品种果实后熟过程中品质的变化规律比较

为了解广西香蕉品种资源,以‘桂蕉6号’‘中蕉3号’‘中蕉4号’‘中蕉6号’‘巴西蕉’和‘南天黄’6个香蕉品种为试验材料,比较其后熟过程中品质的变化规律。结果表明：在后熟过程中,6个香蕉品种的色差a^*值、可溶性固形物、还原糖和总淀粉酶活性呈逐渐上升趋势,色差L^*值、可滴定酸和α-淀粉酶活性呈先上升后下降的趋势,淀粉含量呈逐渐下降趋势,色差b^*和C^*值呈波动上升;‘巴西蕉’‘南天黄’和‘中蕉6号’的可溶性糖和维生素C含量逐渐上升至平缓,而‘中蕉3号’和‘中蕉4号’的可溶性糖和维生素C及‘巴西蕉’的可溶性蛋白质先上升至黄熟期后下降,‘桂蕉6号’‘中蕉3号’‘中蕉4号’‘中蕉6号’和‘南天黄’的可溶性蛋白质含量逐渐上升;在黄熟期时,‘中蕉4号’的果皮厚和果指弯曲度最大,‘桂蕉6号’的可食率、果指长度、色差a^*值和还原糖含量最大,‘巴西蕉’的果指重、果皮重、可滴定酸、可溶性固形物和可溶性糖含量最大。利用主成分分析,对6个香蕉品种果实成熟期品质进行综合评价,‘桂蕉6号’品质最优,依次是‘巴西蕉’‘南天黄’‘中蕉3号’‘中蕉6号’和‘中蕉4号’。     

香蕉果实采后成熟过程中苹果酸脱氢酶(MDH)及苹果酸含量的变化

以巴西香蕉果实为材料,研究果实采后正常成熟过程中乙烯释放速率,苹果酸脱氢酶(MDH)活性,苹果酸、淀粉以及可溶性总糖含量的变化。结果表明：香蕉果实采后成熟过程中乙烯释放速率在采后10 d开始增加,到采后14 d达到高峰;MDH酶活性在采后10 d迅速增强,到采后16 d达到峰值;苹果酸含量在果实成熟早期上升,晚期下降,可溶性总糖含量逐渐增加,而淀粉含量持续下降。推测MDH通过改变香蕉品质而参与果实成熟。     

不同催熟条件对香蕉后熟均匀性的影响研究

粉、蔗糖、果糖和葡萄糖含量作为参考指标,研究采收后贮藏时间、催熟时间和催熟温度对2种香蕉果实后熟速度的影响。结果表明,采收后仅贮藏5 h的香蕉,在22 ℃、12 h乙烯催熟处理的条件下,尾蕉的成熟指数、表皮颜色、可溶性总糖和葡萄糖的含量和头蕉相比有显著差异,尾蕉成熟速度显著低于头蕉;22 ℃下贮藏5 d后再进行乙烯催熟处理,头蕉和尾蕉的成熟速度基本一致;适当提高催熟温度或延长催熟时间至24 h,也能提高头蕉和尾蕉的后熟一致性     

植物叶片处理香蕉果实后熟试验初报

在特定温度条件下,用胡椒、假药、糯米香等植物叶片处理香蕉果实后熟,试验结果表明参试植物叶片处理均有催化香蕉后熟作用,当温度25～30℃,叶片与香蕉质量比约1：5时,后熟香蕉果皮颜色较好,其中,假药叶处理香蕉后熟时间短,果皮颜色好;糯米香叶能延长香蕉果皮褪绿时间。     

香蕉乙烯受体基因cDNA的克隆及其表达分析

提取香蕉果实总RNA，根据有关文献报道的乙烯受体基因序列设计引物，通过RT-PCR方法扩增其开放读框(open reading frame，ORF)，结果同时扩增出2个长短不同的特异cDNA序列。测序结果表明：其中较长的cDNA序列与该报道的香蕉乙烯受体cDNA序列的对应区段(ORF)长度一致，同源性为99．1％；另一较短cDNA序列为新序列，其与该报道序列的同源性达97．2％，但缺少该报道序列中的19和1036 bp的区段。RT-PCR扩增结果显示，报道的cDNA序列在香蕉果实的几个成熟阶段均有表达，而在根和叶片等组织中检测不到其表达，说明其表达具有果实组织特异性。Southern杂交结果显示，该报道基因序列在香蕉基因组中为单拷贝存在。因此，推测新克隆的缺失cDNA序列可能来自同一基因的转录后剪辑，其可能为1个新的香蕉乙烯受体基因。