Oleosin-bFGF融合基因转化红花

利用油体蛋白融合技术,为实现oleosin-b FGF油体蛋白在转基因红花中表达奠定基础,通过农杆菌介导法将含有Ca MV35S启动子和oleosin-b FGF融合基因的T-DNA转入到红花基因组中,对潮霉素抗性红花植株的基因组进行PCR检测,提取抗性植株叶片总蛋白进行SDS-PAGE分析和Western blotting检测。PCR检测结果表明,目的基因已经转入到红花基因组,蛋白检测结果证明oleosin-b FGF融合蛋白在转基因红花叶片中有表达,但融合蛋白不稳定,发生降解。     

拟南芥AtNUDT8启动子的分离及其功能分析

根据已发表的拟南芥基因组序列设计合成一对引物,以拟南芥基因组DNA为模板克隆AtNUDT8上游非编码区,并与pBAR-GUS3相连构建了植物表达载体pNUDT8P-GUS,采用农杆菌GV3101介导的渗透法转化野生型拟南芥,通过除草剂筛选获得了一批抗性纯合子转基因植株,再对转基因植株2周幼苗进行GUS活性的组织化学染色分析,并对3.5~4周的转基因植株叶片进行病原菌诱导表达分析。结果表明：已获得AtNUDT8启动子,该启动子为组成型表达启动子,并且病原菌Pst.DC3000对该启动子无诱导作用。     

转酸性蛋白酶pepB基因玉米的分子鉴定与农艺性状分析

通过分子生物学技术把酸性蛋白酶pepB基因转入受体玉米自交系基因组中,培育转酸性蛋白酶pepB基因玉米新品系。以耐盐基因badh作为筛选标记性基因,经过抗性筛选,对T1、T2、T3代转基因植株进行PCR检测,得到14个T1代转基因阳性植株,32个T2代转基因阳性植株和27个T3代转基因阳性植株。Southern杂交结果表明,外源酸性蛋白酶基因已经整合进玉米基因组中。RT-PCR结果表明,酸性蛋白酶基因在受体玉米中获得表达,获得外源酸性蛋白酶pepB基因遗传表达的T3代转基因玉米株系。通过对T2、T3代转基因玉米各品系农艺性状的分析结果表明,转基因玉米各品系在株高、茎粗、穗长等农艺性状上与受体亲本没有差异,但生育期均有不同程度的缩短。     

分子改造Cry蛋白基因的转基因玉米创制及其抗虫功能评价

利用结构域交换和密码子优化方法对苏云金芽孢杆菌(Bt)杀虫晶体蛋白Cry1Ab进行合理化设计改造,获得新型Bt蛋白编码基因cry FLIa。利用农杆菌介导法将该基因转入玉米Hi II中,对转基因后代开展分子鉴定和抗性评价等相关工作。结果表明,cryFLIa基因已整合进玉米基因组中,连续3代自交材料检测显示,转基因玉米目标基因正常表达并稳定遗传;蛋白在植株叶片中发育各时期的表达各异,在灌浆期蛋白表达量较高(471.883 ng/g)。室内生测和田间人工接虫试验表明,转cryFLIa基因玉米具有抗亚洲玉米螟的能力。     

玉米醇溶蛋白ze19基因启动子克隆与功能分析

从玉米自交系9801基因组DNA中克隆玉米醇溶蛋白基因ze19启动子,将其克隆到pMD18-T载体上.该序列与发表序列同源性为94％,包括TATA box、CAAT box启动子基本元件以及多种参与调节醇溶蛋白表达的顺式元件.将ze19启动子取代质粒PBI 121-gus中的CaMV35S启动子,构建由ze19启动子驱动GUS的植物表达载体pBIze19-gus,利用土壤杆菌介导法将重组载体pBIze19-gus转入烟草中.对转基因烟草植株GUS活性的定性与定量分析结果表明,ze19启动子驱动GUS基因在转基因烟草种子中表达活性最高,在叶片中活性很弱,在茎中没有活性.所克隆的ze19启动子具有种子特异表达特性,为玉米种子生物反应器的研究提供借鉴.     

大豆C_2H_2型锌指蛋白基因SCTF-1转化及功能分析

为探讨锌指蛋白在大豆对非生物逆境胁迫耐受过程中的作用,构建了锌指蛋白基因SCTF-1的植物表达载体p CPB-SCTF-1,利用花粉管通道法将其导入大豆中,通过抗性筛选及PCR检测,共获得了6株转SCTF-1基因植株,Southern杂交鉴定表明功能元件以单拷贝形式整合于受体基因组中。荧光定量PCR检测证明转化植株在根、茎、叶部位的表达与未转化植株相比显著提高。在4℃低温胁迫下,转SCTF-1基因植株相对电导率明显低于非转化植株,降低了21.10%~23.09%;丙二醛含量明显低于非转化植株,降低了10.56%~11.74%;过氧化物酶活性明显高于非转化植株,增加了25.02%~30.38%;转基因植株叶片未呈现明显的萎缩、萎蔫、打卷现象。因此,转SCTF-1基因的过量表达提高了转基因大豆的耐冷能力。     

美洲商陆抗真菌蛋白转化玉米的研究和抗病性检测

研究美洲商陆抗病毒蛋白(PaAFP)基因转入玉米中对玉米纹枯病的抗性。从美洲商陆叶片中获得美洲商陆抗真菌蛋白前体蛋白基因cDNA序列,构建植物表达载体pCAMBIA1300-PaAFP,通过三亲杂交法将其导入根癌农杆菌LBA4404受体菌,转化玉米获得了大量再生转基因植株。PCR、PCR-southern杂交、RT-PCR以及Tris-Tricine-SDS-PAGE检测结果表明,目的基因已经整合到玉米基因组中,并且已经得到转译。     

用基因枪法将小麦病程相关蛋白基因TaPR-1导入小麦的研究

为验证小麦病程相关蛋白基因TaPR-1的功能,利用gus基因瞬间表达技术对基因枪法转化小麦幼胚的两个重要参数金粉用量和轰击距离进行了优化.研究结果表明,金粉用量为250.0 μg,轰击距离9cm的轰击参数最为理想,GUS瞬间表达率和平均蓝点数分别可达89.8%和33.7个.采用此轰击参数,将TaPR-1基因导入扬麦158幼胚,经3～5 mg/L Bialaphos筛选获得49株抗性再生植株,经PCR、Southern杂交分析,其中2株为阳性植株,转化率为0.11%.对转基因小麦植株进行苗期离体叶段和田间成株白粉病接种鉴定,初步结果表明,转基因植株对白粉病抗性与对照相比无明显差别.     

导入Chi—linker—Glu和Bar基因获得抗真菌和抗除草剂的转基因烟草

构建重组表达载体pBIb—CG（含有Chi-linker—Glu融合基因和Bar基因）,利用农杆菌介导法将其携带的Chi—linker—Gm融合基因和B4r基因转化烟草（Nicotiana tobaccumL）品种红花大金子。经根癌农杆菌侵染和共培养后,用100mg／LKan＋500mg／LCef筛选抗性芽．获得30株抗性植株,抗性植株再生率为37％：分别对抗性再生植株中Chi一砌ker—Glu融合基因和Bdr基因的特异性引物进行PCR检测,结果27株为阳性,占90％。PCR、Souchem杂交结果证明,外源基因已整合到烟草基因组中。离体抑菌试验和除草剂抗性试验表明,转基因烟草植株对木霉菌fTricko derma viride）、镰刀菌（Fusarium solanif sppisii）和除草剂都表现出一定的抗性。     

STTM165/166转化水稻的初步研究

为研究miR165/166在水稻中的功能,利用含有miR165/166结合位点(STTM165/166)的植物表达载体,通过农杆菌介导法转化水稻品种日本晴,经过抗性筛选、分化培养、生根培养,获得转基因水稻植株。经PCR检测,STTM165/166已成功转入水稻基因组中,部分转基因水稻植株存在叶形扭曲、植株矮化等表型变异。     

Transgenic Expression of the Recombinant Phytase in Rice （Oryza sativa）

In many plants, phytic acid (phytate, 1, 2, 3, 4, 5, 6-hexakisphosphate) is one of the main storage forms of phosphate. About 80% of phosphorus (P) in cereal plants, including rice is stored as phytic acid [1-2]. P in phytic acid can’t be utilized by monogastric animals including human, while it was estimated that only 1/3 of the total P in most of the vegetal feedstuff could be efficiently utilized by the livestock. Therefore, for animal feed with P supplementation is expected to meet the d…     

外源木聚糖酶基因atx在水稻中的表达

 为通过在转基因植株中表达木聚糖酶来提高木聚糖酶的生产效率,将具有较高热稳定性和催化活性的杂合木聚糖酶基因atx连接到双元表达载体pCAMBIA1301上,成功构建了木聚糖酶植物表达载体atx Ru3ep 1301。然后以水稻成熟胚的愈伤组织作为转化受体,采用农杆菌介导法将木聚糖酶基因导入水稻(中花11)中。经过潮霉素抗性检测和PCR鉴定,证实目的基因已经整合到转基因水稻基因组中。RT PCR分析结果显示,外源木聚糖酶基因能够在CaMV 35S启动子的引导下在转基因水稻中正常转录。转基因水稻能够正常生长和繁殖。木聚糖酶活性分析表明,转基因植株最高木聚糖酶活性约为4.37 U/g（鲜叶片）。因此,利用转基因水稻生产木聚糖酶将会是一种经济、有效的方法。     

转基因水稻中重组植酸酶的表达

为通过在转基因植株中表达植酸酶降解植酸来提高水稻中无机磷利用率,构建了由玉米泛素基因Ubi启动子控制的植酸酶基因植物表达载体,并以来源于水稻未成熟胚的愈伤组织作为转化受体,经农杆菌介导法将植酸酶基因导入水稻中,共获得15个独立的转基因株系。对转基因水稻总DNA的PCR和Southern 杂交分析证明目的基因已整合入转基因水稻植株基因组中,并能稳定遗传。对部分转基因水稻未成熟种子总RNA进行RT PCR分析,表明导入的植酸酶基因能够在转基因水稻种子中正常表达。无机磷含量分析表明含目的基因的转基因水稻种子及其后代叶片中的无机磷含量较未转化植株均有了明显的提高。     

耐除草剂转基因玉米CM8401的获得及功能性状鉴定

耐草甘膦和耐草铵膦是转基因作物育种重要的目标性状。将耐草甘膦基因MC1-EPSPS构建到含有bar基因的植物表达载体pTF101.1中，通过农杆菌介导法转入玉米材料Hi-II中，从而获得兼具耐受草甘膦和草铵膦性状的转基因玉米材料 CM8401。目的基因PCR检测显示，MC1-EPSPS和bar基因稳定整合到玉米基因组中。目的蛋白试纸条检测结果显示，MC1-EPSPS蛋白和PAT蛋白在转基因玉米世代间中表达稳定。田间除草剂耐受性鉴定试验表明，转基因玉米CM8401对草甘膦和草铵膦都具有良好耐受性，可耐受4倍推荐中剂量的草甘膦和草铵膦。     

利用转基因技术初步鉴定香蕉RNA解旋酶基因功能

本研究利用前期抑制差减杂交技术筛选获得的香蕉果实上调表达的基因片段,经NCBI比对,表明该基因片段属于香蕉ATP依赖的RNA解旋酶(Helicase)基因家族成员,含有完整的RNA解旋酶超家族C-末端结构域HELICc结构。经Southern杂交证实,此RNA解旋酶基因在香蕉基因组中只有一个拷贝。构建RNA解旋酶基因的反义基因植物表达载体PBIPC86,转化番茄获得6株转基因番茄植株。转基因番茄植株的叶、花和生长形态均有变异,部分转基因番茄生长势弱。该研究结果对鉴定香蕉RNA解旋酶基因功能奠定了初步基础。     

甘薯IbNPR1基因表达载体的构建及转化烟草

为了研究甘薯NPR1基因在转基因植物广谱抗病中的应用,利用前期克隆的甘薯NPRI基因,以pCAMBIA1300质粒为基本载体,构建了由组成型CaMV35S启动子驱动IbNPR1基因的植物表达载体pCAMBIAl300+IbNPRl;然后,采用冻融法转入农杆菌EHA105菌株,通过叶盘法对烟草进行了遗传转化.经PCR检测,IbNPR1基因已整合到烟草基因组中.     

甘蔗锌指蛋白ShZP基因正义反义植物表达载体的构建及转化烟草

根据本实验室克隆的甘蔗锌指蛋白ShZP基因cDNA序列,在开放阅读框两侧设计特异引物,通过PCR扩增引入相应的酶切位点,把甘蔗ShZP基因的编码区(大小为725bp)cDNA片段,分别以正向和反向插入到中间载体pCRBI的Prd29A启动子和NOS终止子之间,构建了其正义植物表达载体pCRBIShZP和反义表达载体pCRBIantiShZP.采用冻融法分别将pCRBIShZP和pCRBIantiShZP导入根瘤农杆菌菌株EHA105中,通过农杆菌介导法对烟草进行转化,经过12mg/L的PPT连续抗性筛选,共获得23株抗性植株,对其中的5株转正义基因烟草植株和9株转反义基因烟草植株进行PCR检测,分别获得3株转正义基因的阳性植株和4株转反义基因的阳性植株.PCR检测结果初步证明外源甘蔗锌指蛋白ShZP基因已成功整合到烟草基因组中,这一研究为植物抗逆基因工程研究打下了一定的基础.     

玉米AFB2基因的克隆、表达及功能分析

通过生物信息学分析从玉米基因组数据库中筛选出一条全长cDNA序列,命名为ZmA FB2(GenBank登录号为NM_001143136.1).通过特异引物克隆该基因,ZmA FB2全长1 722 bp,编码574个氨基酸.N端含有F-box结构域,属于F-box基因家族,与水稻Os04g32460.1同源性很高,属于AFB2亚家族.qRT-PCR结果表明,该基因在玉米的根、茎和叶中均有表达,但在茎中的表达量最强.为进一步研究玉米ZmAFB2基因的功能,构建玉米ZmA FB2基因的超表达载体pCAMBIA-35S-AFB2,并通过农杆菌介导法对番茄进行遗传转化,共获得3个转基因株系,对转基因番茄表型进行鉴定,结果发现,叶片稍厚颜色暗绿,果实较小,无籽或少籽,房室发育不健全,因此,推测AFB2可能参与植物生长发育与调控,这为进一步阐明AFB2基因功能奠定基础.     

拟南芥胱硫醚-γ-合成酶( D-AtCGS)抗血清制备及对D-AtCGS转基因大豆的检测

构建了N端缺失拟南芥CGS基因(D-AtCGS)的原核表达载体,对其进行了原核表达、蛋白纯化和抗血清制备,并利用获得的抗血清对国家大豆改良中心北京分心中心获得的组成型表达、种子特异性表达的D-AtCGS转基因大豆及转全长AtCGS( F-AtCGS)和D-A TCGS的豆科模式植物百脉根进行了Western blot检...     

基于phy基因的双边界植物表达载体构建

采用同源克隆方法从泡盛曲霉中克隆了1 515 bp 的植酸酶基因,与黑曲霉(A. niger963)phyA2 的核苷酸同源性为95%.以植物表达载体pTTBUG8为基础,构建了由35S启动子调控、具有磷高效利用功能基因(phy)的双边界植物表达载体 pBSP.解决了bar基因及其产物 PAT蛋白的安全性及产权等问题,并为植物养分高效利用基因工程研究奠定了重要基础.