利用PCR法鉴定产SLT—Ⅱe大肠杆菌

民贺氏菌毒素Ⅱ型变异性,是仔猪水肿病的主要致病历子。根据ＳＬＴ－Ⅱｅ基因序列,合成一对针对ＳＬＴ－Ⅱｅ操纵子基因保守区的寡核苷酸引物,建立了聚合酶链反应扩增方法。通过对产ＳＬＴ－Ⅱｅ毒素大肠杆菌菌株ＴＢ１,产ＳＬＴ－Ⅱ毒素大肠杆菌菌株９３３Ｗ和产ＳＬＴ－Ⅰ毒素大肠杆菌菌株Ｈ３０的试验,结果表明用所设计的引物建立的ＰＣＲ方法可特异性鉴定产ＳＬＴ－Ⅱｅ大肠杆菌。     

猪水肿病大肠杆菌基因突变株的构建

应用定点突变技术将野生型猪水肿病大肠杆菌(O_(139))主要毒力基因SLT-Ⅱe A亚基中第167位谷氨酸和第170位精氨酸,分别突变为谷氨酰胺(E1670)和亮氨酸(R170L)后,获得突变基因SLT-Ⅱe~*。通过同源重组,将野生菌中的毒力基因SLT-Ⅱe替换为SLT-Ⅱe~*,构建了一株毒力基因突变株(SLT-Ⅱe~*)。实验结果显示,该突变菌株对Vero细胞的毒性是野生菌毒性的1/500。     

志贺样毒素Ⅱ型变异体B亚基单克隆抗体的制备

为建立针对仔猪水肿痛SLT-Ⅱe毒素的检测方法,应用PCR技术克隆SLT-Ⅱe B基因,并将其克隆到原核表达载体pET-30a进行表达.以纯化的融合蛋白免疫BALB/c小鼠,并利用淋巴细胞杂交瘤技术获得6株稳定分泌抗SLT-Ⅱe B的单克隆抗体(McAb)细胞株,其抗体亚类包括IgM、IgA、IgG2b和IgG2a,而且轻链均为K链.阻断ELISA结果显示,6株McAb均能特异性识别天然SLT-Ⅱe毒素.相加ELISA结果显示,3G7和4F3两株是针对不同抗原表位的McAb.     

鉴定猪产毒素大肠杆菌多重PCR方法的建立

根据GenBank数据库的基因序列建立了一种快速鉴定仔猪产毒素致病性大肠杆菌 3种常见毒素LTⅠ、STa和VT2e的多重PCR方法。将待检样本接种麦康凯琼脂平板 ,然后挑取单一的红色菌落直接作模板 ,加入预混好的PCR反应液进行PCR即可对产生这 3种毒素的猪大肠杆菌进行鉴定。 3种毒素基因的PCR产物的大小分别是 2 83bp、2 2 1bp和 4 87bp。     

类志贺氏菌毒素Ⅱ型变异体B亚单位基因的表达与鉴定

将由 Ｐ Ｃ Ｒ 扩增并克隆在ｐ Ｕ Ｃ１８ 质粒载体中的ｓｌｔⅡｅ Ｂ基因切出,并按预定的阅读框架插入表达性质粒载体 ｐ Ｇ Ｅ Ｘ６ｐ１ 中的谷胱苷肽转移酶（ Ｇ Ｓ Ｔ）基因的下游。重组质粒 ｐｐｐｓｌｔⅡｅ Ｂ在大肠杆菌 Ｂ Ｌ２１ 中以融合蛋白的形式表达 Ｓ Ｌ ＴⅡｅ Ｂ蛋白（命名为 Ｇ Ｓ Ｔ Ｓ Ｌ ＴⅡｅ Ｂ）,即 Ｓ Ｌ ＴⅡｅ Ｂ蛋白（７５６８ｋ Ｄ）与谷胱苷肽转移酶（２７３３５ｋ Ｄ）相连组成分子量为 ３４８８５ｋ Ｄ 的融合蛋白。通过对重组大肠杆菌 Ｐ Ｐ Ｓ Ｌ ＴⅡｅ Ｂ的菌体裂解物的 Ｓ Ｄ Ｓ Ｐ Ａ Ｇ Ｅ 电泳分析,以及根据抗原抗体结合反应的免疫学特性,通过 Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ 鉴定,重组大肠杆菌 Ｐ Ｐ Ｓ Ｌ ＴⅡｅ Ｂ（含有重组质粒 ｐｐｓｌｔⅡｅ Ｂ的大肠杆菌 Ｂ Ｌ２１）可以大量表达融合蛋白形式的 Ｓ Ｌ ＴⅡｅ Ｂ。根据 Ｇ Ｓ Ｔ 可与其底物谷胱苷肽结合的特性,用谷胱苷肽结合的 Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｂ制备的亲和凝胶纯化表达产物,纯化的表达产物经 Ｓ Ｄ Ｓ Ｐ Ａ Ｇ Ｅ,可以鉴定到分子量约为 ３５ｋ Ｄ 的蛋白条带,这与融合蛋白形式的 Ｓ Ｌ ＴⅡｅ Ｂ分子量（３４８８５ｋ Ｄ）相当。     

志贺氏菌样毒素Ⅱ型变异体单克隆抗体的制备及其应用

应用淋巴细胞杂交瘤技术,获得１株针对志贺氏菌样素Ⅱ为异体９Ｓｈｉｇａ－ｌｉｋｅ ｔｏｘｉｎ Ⅱ ｖａｒｉａｎｔ,ＳＬＴ－Ⅱｖ）Ａ亚基单位的杂交瘤细胞,并建立了以硝酸纤维素膜为载体的菌落ＥＬＩＳＡ法。用此法检测１５株分离自猪水肿病的野毒菌株和３株产其它型ＳＬＴ的标准菌株,发现该单克隆抗体与１４株野毒菌株呈阳性反应,与产ＳＬＴ－Ⅱ的９３３Ｗ株菌有微弱交叉反应,但与产ＳＬＴ－Ⅰ和ＶＴ２的菌株（Ｈ３０和Ｅ     

猪水肿病的成因及发病机制

猪水肿病(ED)由肠毒血症大肠杆菌(ETEEC)引起.在母源抗体IgA下降、饲料中蛋白质含量过高、缺硒和过食等诱因的刺激下,猪肠道内大肠杆菌迅速繁殖,依靠定植因子粘附到肠粘膜细胞上,并产生SLT-Ⅱe毒素.SLT-Ⅱe是一种热不稳定蛋白质,它能与血管内皮细胞和平滑肌细胞上的受体结合,阻碍细胞内蛋白质合成,造成血管损害而致水肿.     

猪水肿病PCR快速检测试剂盒的研制

实验在大肠杆菌产生的志贺样毒素2型变异体（Shiga—like toxinⅡe,Stx2e）研究的基础上,设计了一对特异性引物,通过优化,建立了以PCR为基础,高效快速检测猪水肿病的PCR试剂盒。该试剂盒扩增的阳性条带为172bp的特异性DNA片段,最低检出菌体量为120CFU,在-20℃至少可保存12个月,重复性良好。应用猪水肿病PCR快速检测试剂盒对22份新鲜样本进行了检测,结果显示,其中的5个样本含Stx2e阳性大肠杆菌,PCR检测结果与剖检、细菌学和生化检验结果相一致。     

类志贺毒素Ⅱ型变异体B亚单位单抗的制备和初步应用

将表达类志贺毒素II型变异体B亚单位融合蛋白的菌株ppSLT-IIeB在含氨苄青霉素的2×YTA培养基中培养,至对数生长期时加入IPTG诱导,诱导的重组菌超声波裂解后,经聚丙烯酰胺凝胶电泳证明其已表达融合蛋白。用谷胱苷肽活化的Sepharose4B亲和层析柱纯化融合蛋白,测定纯化蛋白的浓度,免疫BALB/C小鼠,细胞融合后经ELISA检测,得到一株阳性杂交瘤细胞,命名为7C3-1,制备的单抗腹水ELISA效价为210,Westernblet结果表明此单抗仅与融合蛋白反应,而与载体蛋白不反应。利用此单抗检测18株水肿病菌株,发现有13株产类志贺毒素II型变异体。     

类志贺毒素Ⅱ型变异体A亚单位基因缺失株的构建及表达

采用PCR方法分别对类志贺氏菌毒素A亚单位基因第298～805序列、818～1201序列进行了扩增，使其第806～817序列的碱基(编码167～l70位氨基酸)缺失，并将两片段连接后克隆至质粒载体pGEX-6P-1中，获得了含有重组质粒pGEX-Ade。的重组大肠埃希氏菌；经SDS-PAGE以及使用特异性抗SLT-Ⅱ eA单克隆抗体的Western-blotting，证明该重组大肠埃希氏菌在IPTG诱导条件下可表达SLT-Ⅱ eA。     

应用PCR检测产vero毒素大肠杆菌

根据产ｖｅｒｏ毒素大肠杆菌（ＶＴＥＣ）产生的ｖｅｒｏ毒素１（ＶＴ１）和ｖｅｒｏ毒素２（ＶＴ２）的基因序列,合成了２对寡核苷酸引物,建立了聚合酶链式反应（ＰＣＲ）扩增方法。共对４株产ｖｅｒｏ毒素大肠杆菌和其他７个属的４１株肠道致病菌中的ＶＴ基因进行了检测,结果仅从用传统组织培养方法确定为ＶＴ阳性的产ｖｅｒｏ毒素大肠杆菌和痢疾１型志贺氏菌提取的ＤＮＡ中观察到了ＰＣＲ扩增产物,而从其他肠道致病菌提取的模板ＤＮＡ中未扩增出任何ＤＮＡ片段。用这２对引物可以清楚地区分产ＶＴ１、ＶＴ２或ＶＴ１／ＶＴ２的大肠杆菌。ＰＣＲ扩增方法的检测敏感性为３２０ｐｇ全细菌ＤＮＡ,用ｖｔ１引物可以检测出低达３２ｐｇ的全细菌ＤＮＡ。     

猪水肿病大肠杆菌F18ab菌毛A亚单位与志贺样毒素Ⅱ型变异体A亚单位的联合表达

扩增、克隆和表达了水肿病大肠杆菌的致病因子F18ab 菌毛的主要亚单位FedA全基因(包括信号肽序列),并与现有的另一致病因子志贺样毒素Ⅱ型变异体A亚单位基因(stx 2eA)连接,然后进行联合表达。同时用已制备的抗Stx 2eA 单克隆抗体和抗F18ab菌毛单克隆抗体对联合表达的融合蛋白质进行检测鉴定。     

致猪水肿病大肠埃希菌多重PCR检测方法的建立及应用

本研究旨在建立一种快速鉴定致猪水肿病大肠埃希菌的多重PCR检测方法.分别针对大肠埃希菌16S rDNA、志贺毒素Stx2e A亚基和菌毛F18ab A亚基保守序列设计合成3对特异性引物,优化多重PCR反应条件,并进行特异性和敏感性检测.结果显示,阳性对照菌株扩增产物大小分别为1 062、733和313 bp.特异性和灵敏性检测结果表明,与肠炎沙门菌、多杀性巴氏杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌、支气管败血波氏杆菌和猪链球菌等猪常见致病菌均无交叉反应;菌体直接扩增法最低检出量为1 875 CFU.利用建立的多重PCR检测方法对分离收集的128株大肠埃希菌进行鉴定,得到36株致猪水肿病大肠埃希菌,其中30株既有菌毛F18ab又产志贺毒素Stx2e,另外6株仅产志贺毒素Stx2e.结果表明,本试验所建立的多重PCR检测方法对致猪水肿病大肠埃希菌的快速诊断和流行病学调查具有一定的应用价值.     

SLT-IIeA基因在原核系统中的克隆与表达及其鉴定

PCR扩增并克隆在pUC18质粒中的类志贺样毒素Ⅱ型变异体（SLT-Ⅱe）A亚单位基因片段切出，按预定阅读框架插入到原核性表达载体pGEX-6p-1的谷胱甘肽S－转移酶（GST）基因的下游，获得重组质粒ppGEX-A。重组粒导入大肠杆菌BL21，用IPTG进行诱导表达，通过对重组大肠杆菌的菌体裂解物的SDS－PAGE电泳分析及Western-blot鉴定，表明重组菌能大量表达融合蛋白形成的SLT-ⅡeA，即SLT-ⅡeA蛋白与谷胱甘肽转移酶相连组成的蛋白质。本实验的研究结果，为进一步研究SLT-Ⅱe的生物学特性及研制仔猪水肿病业单位苗提供了有效的生物材料。     

海安县猪水肿病的流行病学与病原特性研究

对江苏省海安县2003年5月-2004年5月各乡镇猪水肿病的发病和死亡情况进行了流行病学调查,发现猪水肿病在该地区呈零星散发性发生,发病率为0.31%～1.84%,死亡率为0.07%～0.56%,病死率为16.0%～35.0%。水肿病主要侵害仔猪,育成猪也偶有发生,一般以气温比较高的季节多发。同时从疑似猪水肿病的病料中分离到12株大肠杆菌,经O血清型鉴定,5株为O139,2株为O45,O55、O93、O9、O101、O119各1株。经多重PCR检测毒素基因(STa、STb、LT、SLT-2e)和大肠杆菌粘附素单抗(F4、F5、F6、F41、F18)检测菌毛,共6个分离株带有SLT-2e基因,其中O139分离株5株,O55分离株1株,其余6株均带STb基因。12个分离株中,单独表达F18菌毛的4株(O1392株,O45、O119各1株),F5 F411株(O93),F41 F181株(O139),F5 F41 F182株(均为O139)。经药敏试验,多数分离菌株对壮观霉素和新霉素高度敏感。     

产志贺毒素大肠杆菌志贺毒素Ⅰ型双抗体夹心ELISA检测方法的建立

为建立双抗体夹心ELISA法检测产志贺毒素大肠杆菌(STEC)Ⅰ型志贺毒素(Stx1),利用重组Ⅰ型志贺毒素A亚单位(Stx1A)免疫小鼠,制备单克隆抗体,从中筛选出非竞争性的2株单抗,构建双抗体夹心法ELISA检测方法,并对试验样品中的志贺毒素进行检测。结果显示:共获得4株针对Stx1A的单克隆抗体,分别为1H2-G7、2H1-C12、8E7-E6和2F6-F8。当8E7-E6作为包被抗体,而2F6-F8作为检测抗体时,其检测毒素的OD值最高。对样品中的Stx进行检测,表明该方法只有效识别Stx1,对Stx2不识别。结论:成功建立了用于检测Stx1的双抗体夹心ELISA法,为临床上快速诊断STEC感染奠定了基础。     

新疆牛源产志贺毒素大肠杆菌耐药性及其ESBLs基因鉴定

本研究的目的是通过调查新疆地区分离的牛源产志贺毒素大肠杆菌(STEC)的耐药表型和基因型,掌握STEC耐药性的发展和传播规律。本研究对新疆6个地区的牛源(非O157:H7)STEC分离株进行了18种抗生素的药物敏感性试验,并检测菌株中携带的超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)基因。结果显示:4.31%STEC表现为多重耐药,1.91%为产ESBLs菌株。检测到的主要ESBLs基因包括bla_TEM和bla_CTX-M。这是首次在新疆STEC中检测到bla_TEM和bla_CTX-M。本研究分离出的多数多重耐药STEC属于系统发育A群。多重耐药STEC可能是由非致病性大肠杆菌获得毒性和耐药基因而形成的。抗生素的选择压力可能对细菌在牛肠道中的定植表现出一定竞争优势,从而增加了耐药STEC对食物的污染。     

引致猪水肿病毒素的抗体检测

猪水肿病（ＥＤ）是断奶仔猪常见的一种传染病，与类志贺氏毒素Ⅱ变种（ＳＬＴ－Ⅱｖ）密切相关。本试验用多粘菌素Ｂ从基因工程菌大肠杆菌ＴＢ１中提取ＳＬＴ－Ⅱｖ，作中和试验检测来自江苏等地２６７份屠宰猪血清，发现９份血清有ＳＬＴ－Ⅱｖ的抗体，滴度由１∶４～１∶２５６不等，显示致猪水肿病毒素在猪群的实际存在     

猪水肿病发病机理研究进展

猪水肿病主要发生于断奶后2周内的仔猪,是常见的一种急性致死性传染病。该病是由利用其菌毛(F18ab)黏附于小肠上皮细胞,并产生类志贺样毒素Ⅱ型变异体(SLT-Ⅱe)的产类志贺毒素大肠埃希菌引起的一种肠毒血症。仔猪断奶后的免疫能力,营养水平和遗传抗性是导致猪水肿病的主要影响因素。文章着重阐述了猪水肿病的致病机理,为该病的预防和治疗提供重要的理论依据。     

江苏某奶牛场健康奶牛体内产志贺毒素大肠杆菌的分离鉴定及其对小鼠致病性的研究

通过对江苏省某奶牛场连续6个月的定群、定畜跟踪调查,获得产志贺毒素大肠杆菌(STEC)在该牛场分布的广泛性、持续性和血清型多样化的资料,并对一些重要血清型分离株作致病性的鉴定.基于本实验室已经建立的多重PCR方法对stx1、stx2、eaeA、ehxA共4个基因进行检测,对检测出的阳性样品,非O157 STEC采用多重PCR结合CT-SMAC平板的分离方法,而O157 STEC通过免疫磁珠结合O157显色平板的分离方法.结果表明,该奶牛场STEC的初筛率为16.1%(112/696),分离率为11.1%(77/696).分离株属于35种O血清型和60种O:H血清型.该场的优势血清型为O4、O26和O93,O157在该场存在,但并非优势血清型.77个分离株中,stx2基因的检出率为68.8%,远远高于其它毒力基因,如stx1(19.5%)、eaeA(11.7%1)和ehxA(20.8%).该场分离到一些O157和O26血清型的菌株,对小鼠具有较强的致病性.奶牛是STEC的天然宿主,可健康带菌.除了O157STEC外,非O157 STEC中一些高致病力菌株对人类的健康也存在威胁.